体外获得高纯度大鼠背根神经节神经元的原代培养 (1)

医药类

第29卷第3期2009年6月

国际病理科学与临床杂志　　

InternationalJournalofPathologyandClinicalMedicine

Vol.29　No.3

Jun.　2009

论　著

体外获得高纯度大鼠背根神经节神经元的原代培养

谭洪毅,潘频华,胡成平

(中南大学湘雅医院呼吸内科,长沙410008)

[摘要]　目的:建立一种切实可行的胚胎大鼠背根神经节神经元培养及纯化方法。方法:用显微解剖获取足

够数量的胚胎大鼠背根神经节,通过胰蛋白酶+EDTA消化、交替使用NB培养基与加入了52氟222脱氧尿嘧啶核苷酸/尿苷的抗有丝分裂NB培养基等方法,在体外获得纯化的背根神经节神经元,采用神经丝蛋白免疫细胞化学染色法与DAPI染核的方法鉴定并测定神经元的纯度。结果:获得的背根神经节神经元在体外生长良好,纯度可达到

96%以上。结论:本实验方法可以获得大量高度纯化的大鼠背根神经节神经元。

[关键词]　背根神经节;　神经元;　原代培养

[中图分类号]　R392.28　　　[文献标识码]　A　　　[]　16732(205

Primarycultureminiied

dorsalrootinvitro

HUChengping

(DepartmentofXHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410008,China)

[　O　Toestablishafeasiblemethodofcultureandpurificationofembryonicdorsalrootneuronsofrats.Methods　Adequatedorsalrootganglions(DRGs)wereobtainedbymicrodissection,thenweredissociatedwithtrypsinplusEDTA.ThedissociatedneuronswereculturedwithNBmedianand52fluoro22′2deoxyuridine/uridineforpurification.Anti2NF200andDAPIstainingwastoexaminethepurificationpercentageofDRGn.Results　TheisolatedandculturedDRGnsurvivedandgrewingoodconditioninvitro,andthepurifiedpercentageofDRGnwasabove96%.Conclusion　Themethodisveryusefulinobtainingthemassivehighpurifiedembryonicdorsalrootganglionneuronsofrats.

[Keywords]　dorsalrootganglion;　neurons;　primarycellculture

[IntJPatholClinMed,2009,29(1):0185205]

感觉神经元位于脊髓的神经节或与Ⅴ,Ⅶ,Ⅷ,

经机制的研究

[5]

。作者先前的研究发现,呼吸道合

Ⅸ,Ⅹ对颅神经相联系的感觉神经节。有关背根神经节(dorsalrootganglions,DRGs)内感觉神经元的研究逐年增多,DRGn被广泛地应用于观察细胞的死亡过程径

[3]

[1]

胞病毒感染导致的气道反应性增高大鼠模型,其背根节神经元突触素的表达增高,并与气道壁神经可塑性改变相关控机制的研究

[6]

。以往体外背根节感觉神经元原代。为此参考最近国外方法

[8]

、突触生长

[2]

、生长因子的信号传导途,以及呼吸系统疾病相关神

培养方法难度大,细胞数量低,不能满足细胞信号调

[7]

、疼痛过敏的研究

[4]

,旨在

收稿日期:2008-12-16　　　修回日期:2009-03-30作者简介:谭洪毅,硕士,主要从事哮喘发病机制的研究。通讯作者:潘频华,E2mail:pinhuapan668@

基金项目:国家自然科学基金资助(30670914)。ThisworkwassupportedbyNationalNatureScienceFoundationofChina(30670914).

185

医药类

第3期国际病理科学与临床杂志　　第29卷

建立一种切实可行的胚胎DRGn纯化原代培养方法,以满足各种细胞分子生物学研究。1　材料与方法

1.1　实验动物与主要试剂及器械

胎转到放于体显上的含5mLL215培养基的培养皿中,切除胚头、四肢和尾巴。仰卧放置胚胎,清除胸腹部脏器充分暴露腹侧脊柱,从颈部椎管开口插入显微剪,交替在中线两侧将椎管平行剪开,用显微镊去除椎骨条暴露脊髓。两把显微镊轻轻推脊髓两侧以松动神经节,慢慢将脊髓从椎管中提出(神经节成串挂于脊髓两侧)转入第3个装有5mLL215的100mm培养皿中。重复以上步骤,直到取出所有脊髓。

孕15d(E15)的SD大鼠(长沙市开福区东创实验动物科技服务部)。试剂包括L215培养基(Leibo2vitzProductNumberL4386),Neurobasal培养基(Gib2coCat,No.21103),B227添加剂(GibcoCat,No.125872010),β2NGF(R&DCat,No.5562NG2NGF),52Fluoro22’2deoxyuridine(SigmaCat,No.F0503),Uri2dine(SigmaCat,No.U3750),D2葡萄糖(SigmaCat,No.G8270),L2谷氨酰胺,Trypsin+EDTA,I型鼠尾

在体视显微镜下一把镊子固定脊髓,另一把逐个摘取神经节。

1.5　DRGs消化及DRGn种板

将含有神经节的L215,900r/min3min,加入0.25%

胶原(生友鼠尾胶原蛋白I型),NF200小鼠抗大鼠(MilliporeCat,No.mab5266),羊抗鼠IgG(H+L)红

+在37min。900r/min离3加入10滴FBS终止消化,再次in离心3min,去除FBS,加入NB培养基后

色荧光二抗(ABGABCat,No.2420020296),染(BeyotimeCat,No.C1005)海金钟WA1030)、/WA3050)ikonType102)。1.2　培养基

用巴士德吸管反复吹打成细胞悬液。细胞计数,依实验需要以5×10/mL到2×10/mL(检测蛋白或RNA表达)密度或4000/mL密度(突触形态观察)

5

6

准备NB培养基和Neurobasal培养基46mL;B227添加剂1mL,NGF100μg/L,10%D2葡萄糖2mL

接种到事先包被好的培养皿中,将培养皿转入37℃,5%CO2培养箱中培养。1.6　DRGn纯化

和L2谷氨酰胺(100mmol/L)1mL混合即为NB培养基,抗有丝分裂的NB培养基:在NB培养基基础上加入10mol/L的52氟222脱氧尿嘧啶核苷酸和10mol/L的尿苷。在超净台内按说明将I型鼠尾

25

25

用NB培养基培养24h后大部分DRGn已经贴壁,更换含10mol/L52氟222脱氧尿嘧啶核苷酸和10mol/L尿苷的抗有丝分裂NB培养基培养72h,

25

25

胶原溶于0.006mol/L的乙酸,配制成终浓度为0.024g/L的I型胶原溶液,以4μg/cm包被100mm培养皿和24孔板,在超净台内隔夜凉干备用。1.3　分离胚鼠

2

再次更换NB培养基培养72h,重复以上循环,纯化的DRGn可以存活1月以上。1.7　免疫细胞化学鉴定DRGn及纯度

取培养4d后的DRGn,吸除培养液,0.01mol/LPBS清洗3次,4%多聚甲醛室温下固定30min。再

向E15d大鼠腹腔注射10%水合氯醛1mL麻醉大鼠,用酒精对麻醉好的大鼠腹部消毒,正中切开腹部,用粗镊子提取输卵管同时用眼科剪剪断宫颈处,将取出的胚胎串放入装有75%酒精的烧杯中转入超净台放置10min。1.4　分离DRGs

用PBS洗3次,每次5min,换入0.1%Triton室温作用30min,PBS洗3次,每次5min。去除PBS后加入一抗anti2NF200于37℃下作用1h,PBS冲洗3次,加入红色荧光标记的二抗,室温下作用1h。PBS冲洗3次,加入DAPI染色液室温下作用5min。PBS冲洗3次。在荧光显微镜下观察培养细胞显色

将体视显微镜放置于超净台中,并在3个100mm培养皿内分别加入L215培养基(4℃)10,5和5mL。在超净台内逐个将子宫及胎膜撕破取出胚胎

情况,红色荧光的为DRGn及突触,蓝色荧光为细胞核。在200倍下随机选取10个视野分别计数DRGn和细胞核的数目,最后计算出细胞纯度。186

放于装有10mLL215培养基的培养皿内,提头将胚

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第3期谭洪毅,等:体外获得高纯度大鼠背根神经节神经元的原代培养第29卷

2　结　　果

2.1　DRGn细胞培养状况

养基后,每天均可见大量的细胞死亡,除DRGn外的杂质细胞明显减少。培养持续1月仍可见大量的DRGn存活(图1)。2.2　DRGn细胞纯度鉴定

种板后的NB培养基中主要含有DRGn、雪旺细胞和成纤维细胞,其中DRGn明显较其他细胞大。24h后大部分细胞已经贴壁,DRGn较大,胞体成圆

培养后4d的DRGn行免疫细胞化学鉴定,红色荧光的为DRGn及其突触,蓝色荧光为细胞核,将两者图像融合后计数红染的细胞胞体数及蓝染总细胞核数,前者除以后者得到DRGn占总细胞数的比例,DRGn的纯度高于96%(图2)

。

形,周围有光晕并长出小突触;雪旺细胞两端带有较粗的长突起,成梭形;成纤维细胞胞体小,为不规则的多角形,可见纤细突起。换入抗有丝分裂NB培

图1　D。A:×100;B:×200;C:×400.

Fig.1　I

iiRGncellsonthe4thdayaftertheculture.A:×100;B:×200;C:×400.

图2　免疫细胞化学荧光显微镜下观察DRGn(×200)。A:DRGn胞体及突触被anti2NF200标记;B:DAPI染核;C:A,B的融

合图。

Fig.2　FluorescentmicroscopeimageofDRGncells(×200).A:Neuronandsynapsewerestainedwithanti2NF200antibodywith

rhodamineconjugatesecondaryantibody;B:NucleuswasstainedwithDAPI;C:CombinedpictureofAandB.

3　讨　　论

上摘除,在实际操作过程中能从一个胚胎上摘取约40个DRGs,如果1只E15d的雌鼠拥有15个胚

胚鼠、新生鼠和成鼠的DRGn均可用于原代培养。采用雌鼠与雄鼠同笼后观察到阴道栓当天记为第1天的方法判断怀孕天数。选择15d大胚鼠的DRGn为培养对象。选择E15胚鼠为实验对象有着

胎,那在2h的解剖操作过程中大概能得到600个DRGs,而每个神经节上最终能得到5000～7000个DRGn,这样解剖1只E15d大鼠大约能得到3.5×10个DRGn,可以充分满足实验需要;此外E15d

6

特殊的优势,胚大鼠的感觉神经元在孕9～14d形成

[9210]

胚鼠DRGs只含有极少量的成纤维细胞和雪旺细胞,使得培养容易获得纯化的DRGn,E16d的胚鼠187

,而E15d的DRGs能被比较容易的从脊髓

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[11]

第29卷

更适合做雪旺细胞的原代培养而不是DRGn。过程中污染的发生;采用胰酶加EDTA的方法消化较单纯采用胰酶消化的效果要好,消化的时间不宜过长(不超过60min),过长的消化时间胰酶将对DRGn造

获得实验需要的DRGn就必须去除雪旺细胞和成纤维细胞等非神经元细胞,除了选择E15胚鼠外,细胞纯化方法的选择显得十分重要。对于DRGn培养的纯化方法国内外文献报道有多种,包括采用差速贴壁方法纯化

[12]

成不可逆的损伤,最终导致贴壁的DRGn数目减少,当消化时间足够长而细胞离散不好时可以在低速离心后用巴士德吸管反复吹打细胞悬液,然后再低速离心后反复吹打,通过数次重复可得到离散较好的单细胞悬液,但吹打过程应尽可能避免产生气泡。

综上所述,采用E15胚胎大鼠DRGs,通过显微解剖、胰酶+EDTA消化、物理吹打分离DRGn和采用NB培养基中加入52氟222脱氧尿嘧啶核苷酸/尿苷纯化细胞的方法,AMalin博士和胡小

。

参　考　文　献

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以及采用抗有丝分裂药物阿糖

[7,13214]

胞苷或52Fu来清除非神经元细胞。这些方法

在本实验过程中都进行过尝试,差速贴壁的方法利用神经细胞贴壁较晚,而非神经元细胞黏附能力强、贴壁快的特点,在DRGn种板前在未包被的普通培养皿中培养50min以清除贴壁快的非神经元细胞,但一次差速贴壁操作往往不能完全清除非神经元细胞,即便是少量残存的非神经元细胞亦可在以后的培养过程中快速增殖从而威胁神经元细胞的生长;使用阿糖胞苷的缺点在于它具有明显的神经元毒性,明显下降,神经突触延伸缓慢;率低,1052Fu来纯化DRGn,。最终采用

24

了向培养基中加入52氟222脱氧尿嘧啶核苷酸/尿苷的方法来清除非神经元细胞,52氟222脱氧尿嘧啶核苷酸52Fu代谢后的有效成份,通过直接干扰胸腺嘧啶的合成从而阻止DNA的合成达到清除增殖细胞的目的,且其细胞毒性低;反观52Fu需要经过多次生物转化后才具有抗有丝分裂能力,因此使用52氟222脱氧尿嘧啶核苷酸清除非神经元细胞效果要迅速

得多,采用10mol/L浓度及可在短期内获得满意的纯化效果,取培养第4天的细胞采用细胞免疫化学的方法观察纯化效果达到了96%以上。此外同时加入的尿苷能够保证RNA的正常合成,从而既杀死具有增殖能力的雪旺细胞和成纤维细胞等非神经元细胞,又保证了DRGn的正常代谢。

解剖方法上,在DRGn分离过程中,从腹侧解剖暴露脊髓至关重要,实验过程中笔者尝试过用分离成鼠神经节的路径从背侧解剖不能获得满意的效果,无法完整地提取脊髓;此外抗生素的加入对细胞生长存在影响,培养过程中NB培养基中不加入抗生素,笔者的经验是在解剖用培养基L215中加入浓度为200U/mL的青霉素和0.2g/L的链霉素可以有效避免解剖

188

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《》

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