实验一 光学显微镜的使用与微生物观察

实验一 光学显微镜的使用与微生物观察

第一节 普通光学显微镜的使用 一、实验目的

1、了解普通光学显微镜的基本构造和工作原理。

2、学习并掌握普通光学显微镜，重点是油镜的使用技术和维护知识。 3、在油镜下观察微生物的几种基本形态。 二、基本原理

（一）普通光学显微镜的构造

普通光学显微镜由机械系统和光学系统两部分组成（图1-1）。 1、机械系统

机械系统包括镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、调节器等。 （1）镜座：它是显微镜的基座，可使显微镜平稳地放置在平台上。 （2）镜臂：用以支持镜筒，也是移动显微镜时手握的部位。

（3）镜筒：它是连接接目镜（简称目镜）和接物镜（简称物镜）的金属圆筒。镜筒上端插入目镜，下端与物镜转换器相接。镜筒长度一般固定，通常是160mm。有些显微镜的镜筒长度可以调节。

（4）物镜转换器：它是一个用于安装物镜的圆盘，位于镜筒下端，其上装有3～5个不同放大倍数的物镜。为了使用方便，物镜一般按由低倍到高倍的顺序安装。转动物镜转换器可以选用合适的物镜。转换物镜时，必须用手旋转圆盘，切勿用手推动物镜，以免松脱物镜而招致损坏。

（5）载物台：载物台又称镜台，是放置标本的地方，呈方形或圆形。载物台上装有压片夹，可以固定被检标本；有标本移动器，转动螺旋可以使标本前后和左右移动。有些标本移动器上刻有标尺，可指示标本的位置，便于重复观察。

（6）调节器：调节器又称调焦装置，由粗调螺旋和细调螺旋组成，用于调节物镜与标本间的距离，使物像更清晰。粗调螺旋转动一圈可使镜筒升降约10mm，细调螺旋转动一圈可使镜筒升降约0.1mm。

图1-1 普通光学显微镜的构造

1. 镜座 2. 镜臂 3. 镜筒 4. 转换器 5. 载物台 6. 压片夹 7. 标本移动器 8. 粗调螺旋 9. 细调螺旋 10. 目镜 11. 物镜 12. 虹彩光阑（光圈） 13. 聚光器 14. 反光镜 2、光学系统

光学系统包括目镜、物镜、聚光器、反光镜等。

（1）目镜：它的功能是把物镜放大的物像再次放大。目镜一般由两块透镜组成。上面一块称接目透镜，下面一块称场镜。在两块透镜之间或在场镜下方有一光阑。由于光阑的大小决定着视野的大小，故它又称为视野光阑。标本成像于光阑限定的范围之内，在光阑上粘一小段细发可用作指针，指示视野中标本的位置。在进行显微测量时，目镜测微尺被安装在视野光阑上。目镜上刻有5×、10×、15×、20×等放大倍数。可按需选用。

（2）物镜：它的功能是把标本放大，产生物像。物镜可分为低倍镜（4或10×）、中倍镜（20×）、高倍镜（40～60×）和油镜（100×）。一般油镜上刻有“OI”（oil immersion）或HI（homogeneous immersion）字样，有时刻有一圈红线或黑线，以示区别。物镜上通常标有放大倍数、数值孔径（numerical aperture，简写为NA）、工作距离（物镜下端至盖玻片间的距离，mm）及盖玻片厚度等参数（图1-2）。以油镜为例，100/1.25分别表示放大倍数为100倍，NA为1.25；160/0.17分别表示镜筒长度160mm，盖玻片厚度等于或小于0.17mm。

图1-2 XSP-I6型显微镜物镜的主要参数

（3）聚光器：聚光器又称聚光镜，它的功能是把平行的光线聚焦于标本上，增强照明度。聚光器安装在镜台下，可上下移动。使用低倍物镜（简称低倍镜）时应降低聚光器，使用油镜时则应升高聚光器。聚光器上附有虹彩光阑（俗称光圈），通过调整光阑孔径的大小，可以调节进入物镜光线的强弱（物镜焦距、工作距离与光圈孔径之间的关系见图1-3）。在观察透明标本时，光圈宜调得相对小一些，这样虽会降低分辨力，但可增强反差，便于看清标本。

图1-3 物镜焦距、工作距离与光圈孔径之间的关系

（4）反光镜：它是普通光学显微镜的取光设备，其功能是采集光线，并将光线射向聚光器。反光镜安装在聚光器下方的镜座上，可以在水平与垂直两个方向上任意旋转。反光镜的一面是凹面镜，另一面是平面镜。一般情况下选用平面镜，光量不足时可换用凹面镜。 （二）普通光学显微镜的性能 1、数值孔径

数值孔径（NA）又称开口率，是指介质折射率与镜口角1/2正弦的乘积，可用式1-1表示。

NA?nsin?2 （1-1）

式中，n为物镜与标本之间介质的折射率，为镜口角（通过标本的光线延伸到物镜边缘所形成的夹角（图1-4）。

物镜的性能与物镜的数值孔径密切相关，数值孔径越大，物镜的性能越好。因为镜口角

?总是小于180?，所以sin2的最大值不可能超过1。又因为空气的

折射率为1，所以以空气为介质的数值孔径不可能大于1，一般为0.05～0.95。根据式1-1，要提高数值孔径，一个有效途径就是提高物镜与标本之间介质的折射率（图1-5）。使用香柏油（折射率为1.515）浸没物镜（即油镜）理论上可将数值孔径提高至1.5左右；实际数值孔径值也可达1.2～1.4。

图1-4 物镜的镜口角 图1-5 介质折射率对光线通路

的影响 2、分辨率

分辨率是指分辨物像细微结构的能力。分辨率常用可分辨出的物像两点间的最小距离（D）来表征（式1-2）。D值愈小，分辨率愈高。

D??2nsin?2

（1-2）

式中，λ为光波波长。

比较式1-1和式1-2可知，D可表示为： D??2NA （1-3）

根据式1-3，在物镜数值孔径不变的条件下，D值的大小与光波波长成正比。要提高物镜的分辨率，可通过两条途径：① 采用短波光源。普通光学显微镜所用的照明光源为可见光，其波长范围为400～700nm。缩短照明光源的波长可以降低D值，提高物镜分辨率。②加大物镜数值孔径。提高镜口角或提高介质折射率n，都能提高物镜分辨率。若用可见光作为光源（平均波长为550 nm），并用数值孔径为1.25的油镜来观察标本，能分辨出的两点距离约为0.22μm。 3、放大率

普通光学显微镜利用物镜和目镜两组透镜来放大成像，故又被称为复式显微镜。采用普通光学显微镜观察标本时，标本先被物镜第一次放大，再被目镜第二次放大（图1-6）。所谓放大率是指放大物像与原物体的大小之比。因此，显微镜的放大率（V）是物镜放大倍数（V1）和目镜放大倍数（V2）的乘积，即：

V=V1×V2 （1-4）

如果物镜放大40倍，目镜放大10倍，则显微镜的放大率是400倍。常见物镜（油镜）的最高放大倍数为100倍，目镜的最高放大倍数为15倍，因此一般显微镜的最高放大率是1500倍。

图1-6 普通光学显微镜的成像原理

4、焦深

一般将焦点所处的像面称为焦平面。在显微镜下观察标本时，焦平面上的物像比较清晰，但除了能看见焦平面上的物像外，还能看见焦平面上面和下面的物像，这两个面之间的距离称为焦深。物镜的焦深与数值孔径和放大率成反比，数值孔径和放大率越大，焦深越小。因此，在使用油镜时需要细心调节，否则物像极易从视野中滑过而不能找到。 三、实验器材

1、 仪器 显微镜；

2、 材料 ？标本片，香柏油，二甲苯，擦镜纸。 四、实验程序

（一）显微镜（油镜）操作

1、领取并检查显微镜：按学号向实验指导老师领取显微镜，所有实验课均对号使用。从显微镜箱中取出显微镜时，用右手紧握镜臂，左手托住镜座，直立平移（图1-7），轻轻放置在实验台上（图1-8），检查各部件是否齐全，镜头是否清洁，有问题及时报告老师。

图1-7 显微镜的搬动 图1-8 显微镜的放置

光源：良好的照明是保证显微镜使用效果的重要条件。将低倍镜旋转到工作位置，用粗调螺旋提升镜筒，使镜头距离载物台10mm左右，降低聚光镜的位置，完全打开虹彩光阑，一边看目镜，一边调节反光镜镜面的角度（在正常情况下，一般用平面反光镜；若自然光线较弱，则可用凹面反光镜）。然后，调节聚光器的位置（酌予升降），直至视野内得到均匀适宜的亮度。

3、低倍镜观察：使用低倍镜观察，视野较广，焦深较大，便于搜寻目标，因此宜从低倍镜开始观察。将载玻片标本（涂面朝上）置于载物台中央（图1-9），用压片夹固定（图1-10），并将标本部位移到正中，转动粗调螺旋（图1-11），使镜头与标本的距离降到10mm左右。然后，一边看目镜内的视野，一边调节粗调螺旋缓慢升高镜头，至视野内出现物像时，改用细调螺旋（图1-12），继续调节焦距和照明，以获得清晰的物像，并将所需部位移到视野中央，再换中、高倍镜观察（图1-13）。

图1-9 将载玻片标本置于载物台中央 图1-10 用压片夹固定载玻片标本

图1-11 转动粗调螺旋 图1-12 转动细调螺旋 图1-13 转换物镜

4、中、高倍镜观察：依次用中、高倍镜观察低倍镜下锁定的部位，并随着物镜放大倍数的增加，逐步提升聚光器增强光线亮度。找出所需目标，将其移至视野中央。

5、油镜观察：将聚光器提升至最高点，转动转换器，移开高倍镜，使高倍镜和油镜成“八”字形，在标本中央滴一小滴香柏油，把油镜镜头浸入香柏油中，微微转动细调螺旋，直至看清物像。如果油镜上升至离开油面还未看清物像，则需重新调节。可从侧面注视，小心地转动粗调节器将油镜重新浸在香柏油中，但不能让油镜压在标本上，更不能用力过猛，击碎玻片，损坏镜头。

6、调换标本：观察新标本片时，必须重新从第3步开始操作。

7、用后复原：观察完毕，转动粗调螺旋提升镜筒，取下载玻片，先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，然后用擦镜纸蘸取少许二甲苯（香柏油可溶于二甲苯）擦去镜头上的残留油迹，再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯，最后用细软的绸布擦去机械部件上的灰尘和冷凝水。降低镜筒，将物镜转成“八”字形置于载物台上。降低聚光器，避免聚光器与物镜相碰。使反光镜垂直于镜座，以防受损。将显微镜放回显微镜箱中锁好，并放入指定的显微镜柜内。 第二节 微生物形态观察 一、仪器和材料

1、 显微镜、擦镜纸、香柏油或液体石蜡、二甲苯。

2、 示范片：大肠杆菌（杆状）、小球菌（球状）、硫酸盐还原菌（弧形）、枯草

芽孢杆菌、放线菌、颤藻、鱼腥藻或念珠藻等。 二、试验内容和操作方法

1、严格按照光学显微镜操作方法，依低倍、高倍和油镜的次序观察杆状、球状、弧状和丝状的细菌示范片，用铅笔分别绘出各种细菌的形态图。 2、同法逐个观察放线菌的示范片，分别绘出其形态图。

3、同法逐个观察颤藻、鱼腥藻或念珠藻的示范片，分别绘出其形态图。

问题与思考

1、使用显微镜的油镜时，为什么必须使用镜头油？

2、镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不直接用高倍镜或油镜观察？

实验二 培养基的配制

一、实验目的

1. 学习制备培养基的基本技术。 2. 制备牛肉膏蛋白琼脂培养基。 二、实验基本原理

培养基是将微 生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配制而成的各种营养基质。培养基为微生物的生长提供营养物质和生存空间。它具有微生物正常生活所需的各种养料和适宜的环境条件；（1）适当组分和比例的营养物质；（2）适宜的pH值；（3）合适的渗透压；（4）保持无菌状态。所以培养基是培养微生物所必需的最主要材料。培养基的配制是微生物学工作者的主要技术操作之一。

培养基的种类：

根据培养基的组成成分，可将培养基分为三类：

合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。

半合成培养基：由一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。 天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成的。 从培养基的物理状态来分：

液体培养基：不加凝固剂的液态状培养基。 固体培养基：在液体培养基中加入2％左右的凝固剂的固体状培养基或固体状农副产品培养基。

半固体培养基：在液体培养基中加入0.2％-0.5％凝固剂而成的半固体状培养基。

微生物最常用的凝固剂为琼脂（其次为明胶），又叫洋菜、冻粉。它不是一种营养物质，只能被极少数种类的细菌分解利用。琼脂是从海藻中（主要是石花菜）提取而制成的。是一种多糖类化合物，主要成分是复杂的多糖硫酸酯钙盐，琼脂是一种可逆性胶体，在常规浓度下加热到96C以上即成溶胶状态，融化的琼脂，当温度下降到42℃以下，又凝固为固体。

牛肉膏蛋白培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌培养基，这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，可供作繁殖之用，制作固体培养基时须加2%琼脂，培养细菌时，应用稀酸或稀碱将PH调至中性或微碱性。牛肉膏蛋白培养基的配方：

牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl0.5%，pH7.4～7.6。 三、材料与仪器

1. 试剂 牛肉膏，蛋白胨、NaCl、琼脂、1mol/L NaOH、1mol/L HCl。 2. 其它： 试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，漏斗，乳胶管，弹簧夹，纱布，棉花，牛皮纸，线绳，pH试纸，电炉，台秤。 四、实验步骤

1.称量 根据用量按比例依次称取成分，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，蛋白胨易吸湿，称量时要迅速。 2. 溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，加热，逐一加入各成分，使其溶解，琼脂在溶液煮沸后加入，融化过程需不断搅拌。加热时应注意火力，勿使培养基烧焦或溢出。溶好后，补足所需水分。

3. 调PH 用1mol/L NaOH或1mol/L HCl把PH调至所需范围。

4. 过滤 趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利于某些实验结果的观察，如无特殊要求时可省去此步骤。

5. 分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三解瓶内分装时注意，勿使培养基沾染在容器口上，以免沾染棉塞引起污染。

1）液体分装 分装高度以试管高度的1/4左右为宜，分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的1/2为宜。

2）固体分装 分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，斜面长度不超过管长的1/2（图1）。分装三解瓶，以不超过容积的1/2为宜。

3）半固体分装 装置以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。

图1 灭菌的试管培养基趁热摆成斜面

6. 加棉塞 分装完毕后，在试管口或三解瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试管帽等，以阻止外界微生物进入培养基而造成污染，并保证有良好的通气性能。 7. 包扎 棉塞头上包一层牛皮纸，扎紧，即可进行灭菌。

8. 保存 灭菌后的培养基放入37℃养箱中培养24小时，以检验灭菌的效果，无污染方可使用。 问题与思考：

1．培养基配制时应注意什么问题？为什么？ 2．分装培养基时为什么要使用弹簧夹？ 3．培养基配好后，为什么要立即灭菌？

实验三 消毒和灭菌

一、实验目的

了解干热灭菌及高压蒸汽灭菌的操作方法。 二、实验原理

灭菌是用物理或化学的方法来杀死或除去物品上或环境中的所有微生物。消毒是用物理或化学的方法杀死物体上绝大部分微生物(主要是病原微生物和有害微生物)。消毒实际上是部分灭菌。在微生物实验、生产和科研工作中，需要进行纯培养 不能有任何杂菌，因此，对所用器材、培养基要进行严格灭菌，对工作场所进行消毒，以保证工作顺利进行。

灭菌的方法，通常可以分为四大类：（1）加热灭菌：包括直接灼烧灭菌、干热灭菌、加压蒸汽灭菌、间歇灭菌和煮沸消毒；（2）过滤去菌；（3）射线灭菌和消毒；（4）化学药剂灭菌和消毒。

在本实验中，介绍与培养基和玻璃器材灭菌有关的部份灭菌方法。

干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白凝固变性而达到灭菌的目的，细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白凝固越快，反之含水量越小凝固越慢。因此与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160～170℃），时间长（1～2h）。高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放入一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内水沸腾产生蒸汽，水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于水蒸汽不能溢出而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点升高，得到高于100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

一般培养基用0.1MPa、121.1℃.

15～30min可达到彻底灭菌,灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变. 三、材料与仪器

吸管、培养皿、试管、电热干燥箱，手提试高压蒸汽灭锅，牛肉膏蛋白胨培养基、蒸馏水。 四、实验步骤

（一）干热灭菌法 适用于空的、干燥的玻璃器皿的灭菌。培养基不适用。

1．将包好的待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电热干燥箱（注意留有一定的间隙），关好箱门。

2．接通电源，打开排气孔，使箱内湿空气能逸出，旋动恒温调节器，保持加热升温状态，至箱内达到100℃时关闭排气孔。

3．当温度升到160～170℃时，借恒温调节器的自动控制，保持此温度2h。 4．切断电源，冷却至70℃时，打开箱门，取出灭菌物品（未降至70度以前，切勿打开箱门，否则温度骤降导致玻璃器皿炸裂）。 （二）高压蒸汽灭菌

1．首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角架相平为宜。

2．放回内层锅，并装入待灭菌物品（内装培养基或小的三角瓶），不要装得太挤，以免妨碍汽流通影响灭菌效果，三角瓶口不要与桶壁接触，以免冷凝水

3、了解血球计数板的计数原理，掌握血球计数板的计数方法。 二、实验材料：斜生栅藻、小球藻、铜绿微囊藻； 三、主要实验仪器和器皿

１．显微镜，血球计数板，计数器 ２．培养瓶（三角瓶） ，量筒； 四、试剂

１．培养液： BG11 培养液 ２．碘固定液 五、培养条件：

光照强度：1200Lux、温度：20-25℃、光照时间：24h连续光照 六、方法和步骤

1、前期准备：各种器皿的消毒、培养液的配制、准备并培养 3 种不 同的淡水微藻：斜生栅藻、小球藻、铜绿微囊藻；

2、接种：将不同的实验藻种分别接种到盛有培养液的不同三角瓶 (100ml)中,接种的藻容量和新培养液之间的比例为 1：2～1：3。培养量与总容量的比小于 2/3；

3、培养 ：按上述培养条件进行培养，在培养的过程中，每天摇瓶 3 次，使藻类充分见接触氧气和光照；

4、换代：5-7 天换代 1 次，换代浓度同上；

5、固定：将藻液摇匀，用小三角瓶分别倒取一定量(20-30ml)的上述3种藻液加入几滴碘液，摇匀杀死细胞；

6、取样：摇匀后，用吸管吸取上述不同的藻液分别滴到盖有盖玻片的血球计数板的边缘，使藻液慢慢进入盖有盖玻片的区域，避免盖玻片浮起，用吸水纸轻轻吸走多余的藻液，每种藻液取样 2 次；

7、观察计数：显微镜下观察不同的藻种并分别计数。 1）血球计数板计数原理 血球计数板是一块特制的载玻片，板的中部一“H” 型的凹槽， 横槽两边的平台上各有一个有九个大方格的方格网。每个大格：边长 为１ｍｍ，深为 0.1mm，容积为 0.1mm3(10-4ml)。中间大方格为计数 室以计数室为中心，对角线两端各有一个有 16 个中格组成的大格。

2）计算藻细胞密度 数出对角线上的 4 个大方格中的总藻数 A，若藻液的稀释倍数为 B，则计算公式如下：细胞密度＝A÷4×B×104（个／ml）（单位：个／ml） 七、实验结果

按下表记录实验数据。 次数 1 1 2 各大格中的藻数 3 4

2 八、问题与思考

用此法计数的结果是活藻体还是死、活菌体的总和？

实验七 土壤细菌、放线菌、霉菌及纤维素降解菌的分离及提纯 一、目的要求

通过平板涂布法学习土壤中一般异养性细菌、放线菌、霉菌及纤维素降解菌的分

离以及纯化方法 二、基本原理

微生物分离培养的基本原理是：选用不同成分和酸碱度的培养基，在不同的湿度

和不同的通气条件下进行培养，使只有适合该条件的微生物得以生长。微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。由于土壤中菌数高，常需进行一定量稀释，使微生物能在培养基上长成单个菌落，以达到分离的目的。本实验将采用四种不同的培养基从土壤中分离不用的微生物 三、器材

1、培养基：牛肉蛋白胨琼脂培养基、高氏一号培养基、马丁培养基、赫奇逊培养基 2、土壤悬液、无菌玻璃棒、无菌吸管、盛有9ml无菌水的试管、无菌试管 四、操作步骤

1、选定采土地点后，铲去表涂层2～3cm，取3～10cm深层土壤10g。称取土样1g，

加入盛有99ml无菌水的锥形瓶中，振荡10min，使土壤中菌体、芽孢或孢子均匀分散，

－－

制成102稀释度的土壤稀释液。然后按10倍稀释法进行稀释分离，以制备107稀释度

－

为例，具体操作过程如下：取4.5ml无菌水试管6支，按103……10－7顺序编号，放

－

置在试管架上。取移液管一支，准确吸取0.5ml102土壤稀释液，此为10－3稀释度的

－－－－

土壤稀释液，依次操作，制成104、105、106、107的土壤稀释液。

2、用无菌吸管分别吸取适宜浓度的土壤稀释液0.1ml，接种于相应的培养基平板上。

每一稀释度至少有两个平板重复。接种时每一稀释度用一支无菌吸管，菌液注入平板后，应立即用无菌涂棒将该菌液均匀地涂布于平板表面，注意勿刮破琼脂。

通常，细菌采用10-4、10-5、10-6三种稀释液接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，

37°C培养；放线菌采用10-3、10-4、10-5三种稀释液接种于高氏一号培养基。28°C培养；霉菌则采用10-2、10-3、10-4三种稀释度接种于马丁培养基，28°C培养；纤维素降解菌采用10-2、10-3、10-4三种稀释度接种于赫奇逊培养基，28°C。

3、当单菌落长出时，用接种环挑菌落接到相应的斜面培养基上，在相应的温度下培养 五、问题与思考

1、你所涂布的平板是否较好的得到了单菌落？

2、在四种不同的平板上你得到了哪些类群的微生物？简述它们的菌落特征？ 实验八、微生物实验常用玻璃器皿清洗 一、 实验目的

二、 1.熟悉实验所需各种常用玻璃器皿的名称和规格 三、 2.掌握玻璃器皿等器材的清洗、包扎技术 二、实验原理

为确保实验顺利地进行，要求把实验所用的玻璃器皿清洗干净。为保持灭菌后和无菌状

态，需要对培养皿、吸管等进行包扎，对试管和三角瓶等加塞棉塞。这些工作看起来很普通简单，但如操作不当或不安操作规定去做，则会影响实验结果，甚至会导致试验的失败。 三、试剂和仪器

1.高压蒸汽灭菌锅、试管、三角瓶、培养皿和吸管、棉线、纱布、棉花、牛皮纸、报纸等 2.洗涤工具、去污粉和相应洗涤液 四、实验内容

（一） 玻璃器皿的清洗： 新购的玻璃器皿的洗涤

将器皿放入２％盐酸溶液中浸泡数小时，以除去游离的碱性物质，最后用流水冲净。

对容量较大的器皿，如大烧瓶、量筒等，洗净后注入浓盐酸少许，转动容器使其内部表面均沾有盐酸，数分钟后倾去盐酸，再以流水冲净，倒置于洗涤架上晾干，即可使用。 常用旧玻璃器皿的洗涤

确实无病原菌或未被带菌物污染的器皿，使用前后，可按常规用洗衣粉水进行刷洗； 吸取过化学试剂的吸管，先浸泡于清水中，待到一定数量后再集中进行清洗。 带菌玻璃器皿的洗涤

凡实验室用过的菌种以及带有活菌的各种玻璃器皿，必须经过高温灭菌或消毒后才能进行刷洗：

1.带菌培养皿、试管、三角瓶等物品，做完实验后放入消毒桶内，用0.1MPa灭菌20～30 min后再刷洗。含菌培养皿的灭菌，底盖要分开放入不同的桶中，再进行高压灭菌。

2.带菌的吸管、滴管，使用后不得放在桌子上，立即分别放入盛有3～5%来苏尔或5%石炭酸或0.25%新洁尔灭溶液的玻璃缸（筒）内消毒24h后，再经0.1MPa灭菌20 min后，取出冲洗。

3.带菌载玻片及盖玻片，使用后不得放在桌子上，立即分别放入盛有3～5%来苏尔或5%石炭酸或0.25%新洁尔灭溶液的玻璃缸（筒）内消毒24h后，用夹子取出经清水冲干净。 新购置的载片，先用2%盐酸浸泡数小时，冲去盐酸。再放浓洗液中浸泡过液，用自来水冲净洗液，浸泡在蒸馏水中或擦干装盒备用。

如用于细菌染色的载玻片，要放入50g/ L肥皂水中煮沸10min，然后用肥皂水洗，再用清水洗干净。

最后将载玻片浸入95%酒精中片刻，取出用软布擦干，或晾干，保存备用。 若用皂液不能洗净的器皿，可用洗液浸泡适当时间后再用清水洗净。 4.含油脂带菌器材的清洗 一）单独高压灭菌：

用0.1MPa灭菌20～30 min→趁热倒去污物→倒放在铺有吸水纸的篮子上→用100 ℃烘烤0.5h→用5%的碳酸氢钠水煮两次→再用肥皂水刷洗干净。

（二）玻璃器材的晾干或烘干

不急用的玻璃器材：可放在实验室中自然晾干； 急用的玻璃器材：把器材放在托盘中（大件的器材可直接放入烘箱中），再放入烘箱内，用80～120℃烘干，当温度下降到60℃以下再打开取出器材使用。

（三）器皿的包扎：

要灭菌后的器皿仍保持无菌状态，需在灭菌前进行包扎。

1.培养皿：洗净的培养皿烘干后每10套（或根据需要而定）叠在一起，用牢固的纸卷成一筒，或装入特制的铁桶中，然后进行灭菌。

2.吸管：洗净、烘干后的吸管，在吸口的一头塞入少许脱脂棉花，以防在使用时造成污染。塞入的棉花量要适宜，多余的棉花可用酒精灯火焰烧掉。每支吸管用一 条宽约4~5cm

的纸条，以30~50℃的角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，另一端用剩余的纸条打成一结，以防散开，标上容量，若干支吸管包扎成一束 进行灭菌。使用时，从吸管中间拧断纸条，抽出试管。

3.试管和三角瓶：试管和三角瓶都需要做合适的棉塞，棉塞可起过滤作用，避免空气中的微生物进入容器。制作棉塞时，要求棉花紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙， 松紧适宜。过紧易挤破管口和不易塞入；过松易掉落和污染。棉塞的长度不小于管口直径的2倍，约2/3塞进管口。

目前，国内已开始采用塑料试管塞，可根据所用的试管的规格和试验要求来选择和采用合适的塑料试管塞。

若干支试管用绳扎在一起，在棉花部分外包裹油纸或牛皮纸，再用绳扎紧。三角瓶加棉塞后单个用油纸包扎。

问题与思考：

叙述常用玻璃器皿清洗方法及步骤

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