产中性蛋白酶芽孢杆菌的选育 - 图文

产中性蛋白酶芽孢杆菌的选育

摘要：紫外诱变方便易操作，所以本实验选用紫外诱变的方式对分离纯化到的菌株进行诱变，以获得具有较高酶活性或产酶较多的产中性蛋白酶菌株。本实验对纯化得到的菌株进行LB培养基活化，得到代谢旺盛，酶系活跃的活化菌株，功率15W紫外灯30cm处照射照射分别照射1min、3min，将得到的诱变菌液进行10倍梯度稀释，取10-3~10-6梯度菌液涂布于固体牛奶培养基上，37。C培养24h，另设一组未经紫外诱变的对照，同样条件下培养。结果发现，未经诱变的培养基中，-3培养基中出现较多菌株，而-4、-6均无菌株，-5中仅出现一株菌株。经紫外诱变照射1min的

关键词：紫外诱变 活化 培养 蛋白酶

引言：从自然环境中分离，经简单筛选而获得的产酶菌株，虽然具备了一定的产酶能力，但是要达到某种特定代谢产物的大量积累，实现高产、优质和低耗的高

【】

效转化则需要对菌株进行改良，解除或突破微生物的代谢调控1。随着基因工程技术和代谢控制理论的发展，定向育种发挥着越来越大的作用，但传统的诱变技术仍然是大多数工业微生物育种的重要技术【2】。传统诱变技术包括应用各种物理化学方法，例如紫外诱变，X射线，NTG诱变，由于其低廉的成本及简单的使用方法，仍然是目前大多数菌体选育首选且使用最多的方法，现有用来进行诱变育种的出发菌株应对诱变剂敏感，变异幅度大，经诱变处理过的高产菌株，并一定是继续提高产量潜力大的菌株。这是因为，诱变获得的高产菌株再诱变时易出现负突变，继续提高产量较为困难【3】。本实验利用紫外线进行诱变，得到D1/D2=6：1的诱变菌株，相较于未诱变前D1/D2=8：3酶活力显著提高为原来的2.25倍，可用于进一步的发酵复筛。 1、材料与方法 1.1材料

1.1.1原料 初筛并保藏的菌种 1.1.2 培养基

1）LB发酵液体培养基 ： 蛋白胨：10.0g；酵母膏：5.0 g；氯化钠：10.0g；蒸馏水：1000mlpH到 7.0。

2）初步筛选固体培养基 ： 脱脂奶粉：5.0g；酵母膏：2.0 g；琼脂：20.0g；蒸馏水：1000mlpH: 7.0。 3）LB斜面保藏固体培养基： 蛋白胨：10.0g；酵母膏：5.0 g；氯化钠：10.0g；琼脂：20.0g；蒸馏水：1000ml；pH到 7.0。

1.1.3 实验仪器：接种环，摇床，1000uL移液枪，离心机，离心管，振荡器，酒精灯，擦手酒精棉，无菌空培养皿，超净工作台，秒表，磁力转子，涂布器，直尺，报纸，比色卡

1.1.4 试剂：生理盐水， 1mol/L NaOH溶液 1.2方法

1.2.1菌种活化 接种环挑取斜面保藏培养基中的菌种，置于LB活化培养基中37。C摇床培养12h。 1.2.2离心

1.2.2.2微量移液器移取9ml活化菌液于10ml离心管中，振荡，两组平行，3000r/min 10m离心10min。

1.2.2.2 移去离心管中的上清液，加入4ml生理盐水，振荡器振荡至菌体溶于其中，两组平行，3000r/min离心10min。

1.2.3紫外线照射

1.2.3.1将离心所得样品移去上清液，加入4ml生理盐水，振荡器振荡至菌体溶解，将两组混在一起.

1.2.3.2移取3ml菌液加入空培养皿中，加入一个洁净的磁转子，两组平行，编号为1、2，剩余2ml加入留作对照。 1.2.3.3将1、2两个3ml菌液培养皿移去皿盖，暗室中在15W紫外灯下分别照射1min、3min，距离30cm。对照组不做照射。

1.2.4培养皿培养 分别从1、2号培养皿中移取1ml菌液，梯度稀释至10-6，取10-3~10-6各100ul涂布于固体牛奶培养基中，用报纸将其完全包装，黑暗环境中37。C培养24h。（此步操作于黑暗环境中红光灯下进行） 2结果与分析

2.2分析

对照组未经紫外线照射，其余条件均与试验组条件相同。在其结果中，-3培养基中有较多菌落，-5水平培养基中仅有一株菌落，-4，-6水平均无菌落。经分析讨论认为，出现此种情况的原因是实验过程中出现过大的失误，导致实验结果与预

期结果出现较大偏差。实验组中，1组经紫外照射1min，2组经三分钟紫外照射，实验结果：1组中，-3、-4、-5水平均出现突变菌株，-6水平未出现菌落，推测其可能原因是菌体浓度过小，也存在偶然因素。2组中均未长出菌株，最可能原因是照射时间过长。再有突变生长的1组中，-3、-5水平中的菌落直径较小，但其透明水解圈较大，均达到D1/D2=6:1，-4水平培养基中菌落较大，但其透明水解圈的直径相对较小，本组选取-3水平培养基中的菌株YB1，进行LB斜面培养基进行保藏，用以进行复筛。

参考文献：

【1】贾英民 马宏颖 中性蛋白酶高产菌株的诱变及发酵条件 河北农业大学 2008

【2】朱明军， 区健发，陈鸿图中性蛋白酶高产菌株的诱变选育 现代食品科技 2012。

【3】王鸣刚，张新国，陈文洁 高产中性蛋白酶枯草芽孢杆菌的诱变选育、液体酶制备及酶学性质研究，兰州理工大学 2011. 【4】秦燕飞 薛正莲 紫外诱变和氨基酸抗性筛选选育那西肽高产菌株 中国抗生素杂志 2011

【5】阳飞 张华山 李荣斌 原生质体紫外诱变选育多糖高产菌株 中国酿造 2008

【6】候旭 闵伟红 一株虾青素产生菌的筛选诱变及初步鉴定 食品科学 2011 【7】谢维 果胶高效降解菌株的紫外诱变选育_生物特性及其生物脱胶应用研究 南京农业大学硕士学位论文

【8】马燕 黄敏 L_甲硫氨酸高产菌株的紫外线诱变育种 四川大学学报 2004。 【9】李天芝 李丽 周建树 紫外诱变对血红铆钉菇菌丝纤维素酶活性影响 中国食用菌 2009

【10】陈鸿图.高产中性蛋白酶菌株选育及产酶特性研究[D].华南理工大学,2012. 【11】]刘芳.一株产蛋白酶海洋菌的鉴定、产酶条件优化和酶的性质研究[D].青岛科技大学,2013.

【12】万岩松.淀粉液化芽孢杆菌BS5582中性蛋白酶的研究[D].江南大学,2012.

【13】元阳豆豉中高产蛋白酶乳酸菌的筛选及其产酶条件的研究，中国微生态学杂志，2011年1月第23卷第1期。

【14】郭承义,王志,陈雄,雷锦成.高产蛋白酶和淀粉酶米曲霉菌株的选育[J].中国调味品,2012,02:42-45.

【15】孙妍等，产蛋白酶和纤维素酶纳豆芽孢杆菌益生菌株的筛选及其生长特性研究，东北农业大学 学报，第42卷 第3期，42（3）：39~42。

【16】肖峰等，一株产中性蛋白酶海洋细菌的筛选与初步鉴定，食品与药品 ，2011年第13卷第03期

【17】 蔡婉玲等，蛋白酶产生菌的筛选和紫外诱变育种，生物技术，2011年21（1）

【18】孙金旭 乳酒酵母紫外诱变原生质体制备研究 酿酒科技2008

【19】沈萍 陈向东 微生物学实验 高等教育出版社 2007年11月第4版 【20】刘婷,张天斌,林元山.产中性蛋白酶菌株的筛选及其发酵条件的优化[J].湖南农业科学,2009,05:102-104+107

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