产中性蛋白酶芽孢杆菌的选育 - 图文
更新时间:2024-06-27 04:22:01 阅读量: 综合文库 文档下载
产中性蛋白酶芽孢杆菌的选育
摘要:紫外诱变方便易操作,所以本实验选用紫外诱变的方式对分离纯化到的菌株进行诱变,以获得具有较高酶活性或产酶较多的产中性蛋白酶菌株。本实验对纯化得到的菌株进行LB培养基活化,得到代谢旺盛,酶系活跃的活化菌株,功率15W紫外灯30cm处照射照射分别照射1min、3min,将得到的诱变菌液进行10倍梯度稀释,取10-3~10-6梯度菌液涂布于固体牛奶培养基上,37。C培养24h,另设一组未经紫外诱变的对照,同样条件下培养。结果发现,未经诱变的培养基中,-3培养基中出现较多菌株,而-4、-6均无菌株,-5中仅出现一株菌株。经紫外诱变照射1min的
关键词:紫外诱变 活化 培养 蛋白酶
引言:从自然环境中分离,经简单筛选而获得的产酶菌株,虽然具备了一定的产酶能力,但是要达到某种特定代谢产物的大量积累,实现高产、优质和低耗的高
【】
效转化则需要对菌株进行改良,解除或突破微生物的代谢调控1。随着基因工程技术和代谢控制理论的发展,定向育种发挥着越来越大的作用,但传统的诱变技术仍然是大多数工业微生物育种的重要技术【2】。传统诱变技术包括应用各种物理化学方法,例如紫外诱变,X射线,NTG诱变,由于其低廉的成本及简单的使用方法,仍然是目前大多数菌体选育首选且使用最多的方法,现有用来进行诱变育种的出发菌株应对诱变剂敏感,变异幅度大,经诱变处理过的高产菌株,并一定是继续提高产量潜力大的菌株。这是因为,诱变获得的高产菌株再诱变时易出现负突变,继续提高产量较为困难【3】。本实验利用紫外线进行诱变,得到D1/D2=6:1的诱变菌株,相较于未诱变前D1/D2=8:3酶活力显著提高为原来的2.25倍,可用于进一步的发酵复筛。 1、材料与方法 1.1材料
1.1.1原料 初筛并保藏的菌种 1.1.2 培养基
1)LB发酵液体培养基 : 蛋白胨:10.0g;酵母膏:5.0 g;氯化钠:10.0g;蒸馏水:1000mlpH到 7.0。
2)初步筛选固体培养基 : 脱脂奶粉:5.0g;酵母膏:2.0 g;琼脂:20.0g;蒸馏水:1000mlpH: 7.0。 3)LB斜面保藏固体培养基: 蛋白胨:10.0g;酵母膏:5.0 g;氯化钠:10.0g;琼脂:20.0g;蒸馏水:1000ml;pH到 7.0。
1.1.3 实验仪器:接种环,摇床,1000uL移液枪,离心机,离心管,振荡器,酒精灯,擦手酒精棉,无菌空培养皿,超净工作台,秒表,磁力转子,涂布器,直尺,报纸,比色卡
1.1.4 试剂:生理盐水, 1mol/L NaOH溶液 1.2方法
1.2.1菌种活化 接种环挑取斜面保藏培养基中的菌种,置于LB活化培养基中37。C摇床培养12h。 1.2.2离心
1.2.2.2微量移液器移取9ml活化菌液于10ml离心管中,振荡,两组平行,3000r/min 10m离心10min。
1.2.2.2 移去离心管中的上清液,加入4ml生理盐水,振荡器振荡至菌体溶于其中,两组平行,3000r/min离心10min。
1.2.3紫外线照射
1.2.3.1将离心所得样品移去上清液,加入4ml生理盐水,振荡器振荡至菌体溶解,将两组混在一起.
1.2.3.2移取3ml菌液加入空培养皿中,加入一个洁净的磁转子,两组平行,编号为1、2,剩余2ml加入留作对照。 1.2.3.3将1、2两个3ml菌液培养皿移去皿盖,暗室中在15W紫外灯下分别照射1min、3min,距离30cm。对照组不做照射。
1.2.4培养皿培养 分别从1、2号培养皿中移取1ml菌液,梯度稀释至10-6,取10-3~10-6各100ul涂布于固体牛奶培养基中,用报纸将其完全包装,黑暗环境中37。C培养24h。(此步操作于黑暗环境中红光灯下进行) 2结果与分析
2.2分析
对照组未经紫外线照射,其余条件均与试验组条件相同。在其结果中,-3培养基中有较多菌落,-5水平培养基中仅有一株菌落,-4,-6水平均无菌落。经分析讨论认为,出现此种情况的原因是实验过程中出现过大的失误,导致实验结果与预
期结果出现较大偏差。实验组中,1组经紫外照射1min,2组经三分钟紫外照射,实验结果:1组中,-3、-4、-5水平均出现突变菌株,-6水平未出现菌落,推测其可能原因是菌体浓度过小,也存在偶然因素。2组中均未长出菌株,最可能原因是照射时间过长。再有突变生长的1组中,-3、-5水平中的菌落直径较小,但其透明水解圈较大,均达到D1/D2=6:1,-4水平培养基中菌落较大,但其透明水解圈的直径相对较小,本组选取-3水平培养基中的菌株YB1,进行LB斜面培养基进行保藏,用以进行复筛。
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