微生物学实验技术指导书

实验须知

普通微生物学实验课的目的是，训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物学的基础知识；加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过实验；培养学生观察、思考、分析问题、解决问题和提出问题的能力；养成实事求是、严谨认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；树立勤俭节约、爱护公物的作风。

为了上好微生物学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项：

1.每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。

2.认真、及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。

3.实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。 4.实验时小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌试管或瓶不慎打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导老师，及时处理，切勿隐瞒。

5.实验过程中，切勿使乙醇、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火器。

6.使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放回原处。

7.每次实验完毕后，必须把所有仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用3%来苏尔液或5%石碳酸液覆盖0.5小时后擦去，如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具（如吸管、玻璃刮棒等）在洗涤前需浸泡在3%来苏尔液中进行消毒。

8.每次实验需进行培养的材料，应标明姓名、组别及处理方法，放于教师指定的仪器内培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。

9.每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告表中，力求简明准确，认真回答思考题，并及时汇交教师批阅。

10.实验结束后，整理桌面，物归原处，留人打扫室内卫生。 11.离实验室前，将手洗净，注意关闭火、煤气、灯、水管等。

微生物学实验室常用器皿

微生物学实验所用的器皿，大多要进行消毒、灭菌后用来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包装方法均有一定的要求。玻璃器皿一般要求硬质玻璃，才不受高温和短暂的烧灼而不至破裂；玻璃器皿的游离碱含量要少，否则会影响培养基的酸碱度；玻璃器皿的形状和包装方法要求能防止污染杂菌为准；洗涤玻璃器皿的方法不当，也会影响实验的结果。目前国外微生物学实验室中，有些玻璃器皿（如培养皿、吸管等）已被一次性塑料制品所代替，但玻璃器皿仍是重要的实验室用具。本节将主要对玻璃器皿做详细介绍，同时也对接种或转移微生物工具做相应的说明。

一、器皿的种类、要求与应用 1.试管（test tube）

微生物学实验室所用玻璃试管，其管壁必须比化学实验室用的厚些，这要在塞棉花塞时管口才不会破损。试管的形状要求没有翻口（图Ⅰ-1，A），不然，微生物容易从棉塞与管口的缝隙间进入试管造成污染，也不便于盖试管帽。有的实验要求尽量减低蒸发试管内的水分，则需要使用螺口试管，盖以螺口胶木塞或塑料帽（图Ⅰ-1，B，C）。培养细菌一般用金属（如铝）帽或棉塞（图Ⅰ-1，D，E）。也有的用泡沫塑料塞。

试管的大小可根据用途的不同，准备下列三种型号：（1）大试管（约18mm3180mm），可盛倒平板用的培养基；亦可作制备琼脂斜面用（需大量菌体时用）和盛液体培养基用于微生物的振荡培养；（2）中试管（约13-15mm3100-150mm），盛液体培养基培养细菌或作琼脂斜面用，亦可用于细菌、病毒等的稀释和血清学试验；（3）小试管（10-12mm3100mm），一般用于糖发酵或血清学试验，和其他需要节省材料的试验。

2.德汉氏小管（Durhamtube）

观察细菌在糖发酵培养基内产气情况时，一般在小试管内再套一倒置的小套管（约6mm336mm），（图Ⅰ-2，A）。此小套管即为德汉氏小管，又称发酵小套管。

3.小塑料离心管，又称Eppendorf管（图Ⅰ-2，B）。有1.5ml和0.5ml两种型号，主要用于微生物分子生物学实验中，小量菌体的离心、DNA（或RNA）分子的检测、提取等。

4.吸管（pipette）

（1）玻璃吸管（glass pipette）和吸气器（aspirator） ①玻璃吸管

微生物学实验室一般要准备1、5、10ml的刻度玻璃吸管。这种吸管一般有两种类型，一种是称之为血清学吸管（serological pipette），这种吸管刻度指示的容量包括管尖的液体体积，使要将所吸液体吹尽（图Ⅰ-3，A）；另一种类型

称之为测量吸管（measuring pipette），这种吸管刻度指示的容量不包括管尖的液体体积，使用时不能将所吸液体吹尽，而是到达所设计的刻度为止（图Ⅰ-3，B）。

除有刻度的吸管外，有时需用不计量的毛细吸管，又称滴管（图Ⅰ-3，C）来吸取动物体液和离心上清液以及滴加少量抗原、抗体等。

②吸气器

在使用刻度玻璃吸管时，一般可采用几种不同的吸气器。图Ⅰ-4中的三种类型目前都有市售。使用时，将吸管插入吸气器下端，通过旋动转盘键（图Ⅰ-4，A中的a），或按图Ⅰ-4，B中的不同部分（b、c、s），或按图Ⅰ-4，C中的d、e键来吸取或释放液体。如果嘴吸，则一定要在吸管上端塞有棉花。

用刻度吸量管取液体的体积时，以液体的凹面为准（图Ⅰ-3，D）。 （2）微量吸管（micropipette）又称微量加样器，主要用来吸取微量液体，规格型号很多，图Ⅰ-5表示其中的一种型号。每个微量吸管在一定范围内可调节几个体积，并都标有使用范围，例如：0.5～10μl、2～10μl、10～100μl、100～1000μl等。使用时：①将合适大小的塑料嘴（tip）牢固地套在微量吸管的下端；②旋动调节键（图Ⅰ-5，A），使数字显示器上（图Ⅰ-5，B）显示出所需要吸取的体积；③用大拇指按下调节键（图Ⅰ-5，C），并将吸嘴插入液体中；④缓慢放松调节键，使液体进入吸嘴，并将其移至接收试管中；⑤按下调节键，使液体进入接收管；⑥按下排出键，以去掉用过的空吸嘴或直接用手取下吸嘴。

除了可调的微量吸管外，也有不可调的，即一个吸管只固定一种体积。因应用范围受到限制，所以一般用得较少。

5.培养皿（petri dish）

常用的培养皿（图Ⅰ-6），皿底直径90mm，高15mm，皿底皿盖均为玻璃制成，但有特殊需要时，可使用陶器皿盖，因其能吸收水分，使培养皿表面干燥。例如测定抗生素生物效价时，培养皿不能倒置培养，则用陶器皿盖为好。

在培养皿内倒入适量固体培养基制成平板，可用于分离、纯化、鉴定菌种，活菌计数以及测定抗生素、噬菌体的效价等。

6.三角烧瓶（erlenmeyer flask）与烧杯（beaker）

三角烧瓶有100、250、500和1000ml等不同的大小，常用来盛无菌水、培养基和振荡培养微生物等。常用的烧杯有50、100、250、500和1000ml等，用来配置培养基与各种溶液等。

7.注射器（injector）

一般有1、2、5、10、20、25ml不同容量的注射器。注射抗原于动物体内，可根据需要使用1、2、5ml的；抽取动物心脏血或绵羊静脉血可采用10、20、50ml的。

微量注射器有10、20、50、100μl等不同的型号。一般在免疫学或纸层析、电泳等实验中滴加微量样品时应用。

8.载玻片（slide）与盖玻片（coverslip）

普通载玻片大小为75mm325mm，用于微生物涂片、染色、做形态观察等。盖玻片为15mm318mm。

凹玻片是在一块较厚玻片的当中有一圆形凹窝（图Ⅰ-7），做悬滴观察活细菌以及微室培养用。

9.双层瓶（double bottle）

由内外两个玻璃瓶组成（图Ⅰ-8），内层小锥形瓶放香柏油，供油镜头观察微生物时使用，以瓶盛放二甲苯，用以擦净油镜头。

10.滴瓶（dropper bottle）

用来装各种染料、生理盐水等（图Ⅰ-9）。 11.接种工具

接种工具有接种环（inoculating loop）、接种针（inoculating needle）、接种钩（inoculating hook）、接种铲（inoculating shovel）、玻璃涂布器（glass speader）等（图Ⅰ-10）。制造环、针、钩、铲的金属可用铂或镍，原则是软硬适度，能经受火焰反复灼烧，又易冷却。接种细菌和酵母菌用接种环和接种针，其铂丝或镍死直径以0.5mm为适当，环的内径为约2-4mm，环面应平整。

图Ⅰ-11表示一个简易地制作接种环的方法。接种某些不易与培养基分离的放线菌和真菌有时用接种钩或接种铲，其丝的直径要粗一些约1mm。用涂布法在琼脂平板上分离单个菌落时需用玻璃涂布器，是将玻璃棒弯曲（图Ⅰ-12）或将玻璃棒一端烧红后压扁而成。

二、玻璃器皿的清洗方法

清洁的玻璃器皿是实验得到正确结果的先决条件，因此，玻璃器皿的清洗是实验前的一项重要准备工作。清洗方法根据实验目的、器皿的种类、所盛的物品、洗涤剂的类别和玷污程度等的不同而有所不同。现分述如下：

1.新玻璃器皿的洗涤方法

新购置的玻璃器皿含游离碱较多，应在酸溶液内先浸泡数小时。酸溶液一般用2%的盐酸或洗涤液（见附录Ⅶ）。浸泡后用自来水冲洗干净。

2.使用过的玻璃器皿的洗涤方法

（1）试管、培养皿、三角烧瓶、烧杯等可用瓶刷或海绵沾上肥皂或洗衣粉或去污粉等洗涤剂刷洗，然后用自来水充分冲洗干净。热的肥皂水去污能力更强，可有效地洗去器皿上的油污。洗衣粉和去污粉较难冲洗干净而常在器壁上附有一层微小粒子，故要用水多次甚至十次以上充分冲洗，或可用稀盐酸摇洗一次，再用水冲洗，然后倒置于铁丝框内或有空心格子的木架上，在室内晾干。急用时可

盛于框内或搪瓷盘上，放烘箱内烘干。

玻璃器皿经洗涤后，若内壁的水均匀分布成一薄层，表示油垢完全洗净，若挂有水珠，则还需用洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水充分冲洗。

装有固体培养基的器皿应先将其刮去，然后洗涤。带菌的器皿在洗涤前先浸在2%煤酚皂溶液（来苏水）或0.25%新洁尔灭消毒液内24小时或煮沸0.5小时，再用上法洗涤。带病原菌的培养物应先行高压蒸汽灭菌，然后将培养物倒去，再进行洗涤。

盛放一般培养基用的器皿经上述方法洗涤后，即可使用，若需精确配置化学药品，或做科研用的精确实验，要求自来水冲洗干净后，再用蒸馏水淋洗三次，晾干或烘干后备用。

（2）玻璃吸管 吸过血液、血清、糖溶液或染料溶液的玻璃吸管（包括毛细吸管），使用后立即投入盛有自来水的量筒或标本瓶内（量筒或标本瓶底应垫有脱脂棉花，否则吸管投入时容易破损），免得干燥后难以冲洗干净，待实验完毕，再集中冲洗。若吸管顶部塞有棉花，则冲洗前先将吸管尖端与装在水龙头上的橡皮管连接，用水将棉花冲出，然后再装入吸管自动洗涤器内冲洗，没有吸管自动洗涤器的实验室，可用冲出棉花的方法多冲洗片刻，必要时再用蒸馏水淋洗。洗净后放搪瓷盘中晾干，若要加速干燥，可放烘箱内烘干。

吸过含有微生物培养物的吸管亦应立即投入盛有2%煤酚皂溶液，或0.25%新洁尔灭消毒液的量筒或标本瓶内，24小时后方可取出冲洗。

吸管的内壁如果有油垢，同样应先在洗涤液内浸泡数小时，然后再行冲洗。 （3）载玻片与盖玻片 用过的载玻片与盖玻片如滴有香柏油，要先用皱纹纸擦去或浸在二甲苯内摇晃几次，使油垢溶解，再在肥皂水中煮沸5-10分钟，用软布或脱脂棉花擦拭，立即用自来水冲洗，然后再稀洗涤液中浸泡0.5-2小时，自来水冲去洗涤液，最后用蒸馏水换洗数次，待干后浸于95%乙醇中保存备用。使用时在火焰上烧去乙醇。用此法洗涤和保存的载玻片与盖玻片清洁透亮，没有水珠。

检查过活菌的载玻片与盖玻片应先在2%煤酚皂溶液或0.25%的新洁尔灭消毒液中浸泡24h，然后按上述洗涤与保存。

三、空玻璃器皿的包装 1.培养皿的包装

培养皿常用旧报纸密密包紧，一般以5-8套培养皿作一包，少于5套工作量太大，多于8套不易操作。包好后行干热或湿热灭菌。如将培养皿放入金属（不锈钢）筒内进行干热灭菌，则不必用纸包，金属筒有一圆筒型的带盖外筒，里面放一装培养皿的框架（图Ⅰ-13），此框架可自圆筒内提出，以便装取培养皿。

2.吸管的包装

观察。

五、思考题

（1）哪个物镜的工作距离最短？哪个最大？ （2）哪些部件控制着到达物镜的光量？ （3）有哪些方法可以提高显微镜的分辨力？

（4）为什么在高倍镜和油浸镜观察标本之前要先用低倍镜观察？

实验二、酵母菌细胞形态观察、死活细胞的染色鉴别

一、目的要求

1.通过观察了解酵母细胞的形态结构。 2.掌握鉴别酵母细胞死活的染色方法。 二、实验材料 1.菌种：酵母菌菌悬液 2.染料：0.1%的美兰染色液

3.其他：显微镜、载玻片、盖玻片、滴管、擦镜纸、吸水纸等。 三、基本原理

酵母菌细胞较大，不必染色即可用显微镜观察其形态。

用美兰染色液可对酵母细胞进行死活细胞染色鉴别。美兰是一种弱氧化剂，氧化态呈蓝色，还原态呈无色。活的酵母细胞，因新陈代谢的不断进行，具有一定的还原能力，能将进入细胞的美兰还原，而细胞不被染色。因此，用美兰对酵母细胞染色一定时间后，无色的为活细胞，呈蓝色的则为死亡细胞。需要注意的是，一个活酵母菌的还原能力是一定的，必须严格控制染料的浓度和染色时间。

四、方法与步骤 1.酵母菌细胞形态的观察

取洁净的载玻片一块，用滴管取酵母悬浊液滴于载玻片中央，取盖玻片一块，小心的将盖玻片一端与菌液接触，然后缓慢的将盖玻片放下，以避免产生气泡。至此，一片酵母菌水浸标本就制成了。（如图2-1）

先用低倍镜观察，再用高倍镜观察。观察时注意酵母细胞的形状及出芽情况。 2.死活酵母细胞的染色鉴别

取0.1%美兰液一滴，滴在一块洁净的载玻片中央，加一滴酵母菌悬液，混合均匀，染色3-5分钟后加盖玻片制成水浸标本片，镜检。

五、实验内容

1.制片观察所给酵母菌的细胞形态。 2.用美兰液对酵母菌死活细胞进行染色鉴别。 六、实验结果与思考题

1.绘图表示所观察的酵母，注明菌名和放大倍数。

2.用美兰对酵母菌死活细胞进行染色鉴别时，为什么要控制染料的浓度和染色时间？

实验三、酵母菌细胞大小的测定

一、目的要求

了解测量微生物大小的原理，学习并掌握接目测微计的校正方法及微生物大小的测定方法。

二、材料

1.菌种：啤酒酵母菌悬液

2.其他：显微镜、接目测微计、镜台测微计、载玻片、盖玻片。 三、基本原理

微生物细胞个体较小，其大小的测量一般是在显微镜下用专用的测量工具—接目测微计来进行。

接目测微计是一块圆形玻片，其中央刻有精确的等分线。测量时，将其放入目镜的隔板上，也有专用的目镜，里面已安放好接目测微计。由于接目测微计所测量的是微生物经过显微镜放大后所成像的大小，而接目测微计每一小格所代表的实际长度随目镜和物镜的放大倍数而改变，所以，在测量前必须用镜台测微计对接目测微计进行校订，确定此时接目测微计每小格所代表的实际长度，镜台测微计是中央部分刻有精确等分线的载玻片。刻度总长为1mm，被等分成100格，每小格长是1μm，镜台测微计专用于对接目测微计进行标定。

四、方法和步骤 1.接目测微计的标定

（1）取出目镜，旋开其上的透镜，将接目测微计放在目镜的光阑上（有刻度一面向下），然后旋上透镜，插入镜筒。

（2）将镜台测微计固定在显微镜的载物台上，使有刻度的一面向上，不可放反。

（3）将低倍镜转入光路，调准焦距后，转动接目测微计，使两个接目测微计的刻度线相平行，调节镜台测微计，使接目测微计的一条刻度线与镜台测微计的一条刻度线相重合，再寻另一重合线（见图3-1），分别数出其间接目测微计及镜台测微计的格数。计算接目测微计每小格所代表的实际长度。例如：若在两条重合刻度线之间，接目测微计为45格，镜台测微计为10格，那么，此时接目测微计每小格所代表的实际长度=（10格310μm）/45格=2.2μm。

（4）再以高倍镜按上述方法对接目测微计进行标定。 2.酵母菌细胞大小的测定

取下镜台测微计，换上菌体水浸片。用接目测微计测量菌体细胞的长和宽各占几格，然后计算其实际大小。为了尽量减少实验误差，应在同一标本片上进行测量5-10个菌体，取其平均值作为该菌的大小。

五、实验结果

1.接目测微计校正的结果填入下表 放大倍数 目镜3物镜 10310 10340 16310 16340

2.将酵母菌细胞大小值填入下表 细胞序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均值

六、思考题

为什么随着显微镜放大倍数的改变，接目测微计每格代表的实际长度也会改变？你能找出这种变化的规律吗？

长（μm） 宽（μm） 两条重合刻度线之间格数 接目测微计 镜台测微计 接目测微计 每小格代表的 实际长度（μm） 实验四、酵母菌细胞总数及出芽率的测定

一、目的要求

了解血球计数板的构造，掌握利用血球计数板进行微生物计数的方法。 二、材料

1.菌种：啤酒酵母菌悬液

2.其他：显微镜、血球计数板、滴管、吸水纸、擦镜纸 三、基本原理

利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数法。此法是将经过适当稀释的菌体细胞或孢子悬液，注入血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数的。由于加盖盖玻片之后的血球计数板的计数室的容积是一定的，所以可根据在显微镜下观察到的菌数或孢子数换算成单位体积试样中的菌数。此法所计得数值为死菌与活菌的总和，故又称为总菌计数法。

血球计数板由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成（见图4-1），玻片上有4条凹槽，构成三个平台，中间的平台较宽，其中央又被一短槽分割成两半，每个半边上面各刻有一个方格网。每个方格网被划分为九个大格，其中央大格再划分为若干中格，每个中格的四周刻有双线，作为中格的界限，在显微镜下便于区分。中央大格又称为计数室，微生物计数就在此计数室中进行。

计数室的规格有两种：目前常用的是25316型，其计数室被分成25个中方格，每一中方格又分成16个小方格。另一种是16325型，其计数室被分成16个中方格，每一中方格又分成25个小方格。无论哪种规格，计数室的小方格数都是相同的，即16325=400个小方格。

中央大格的边长为1mm，面积为1mm2，计数室与盖玻片间的深度为0.1mm，所以计数室的体积为0.1mm3。

计数时，如用25316型计数板，通常数对角线上的5个中方格（即左上、右上、左下、右下、中央共80个小方格）的细胞总数。如用16325型的计数板，通常数对角线上的4个中方格（即左上、右上、左下、右下共100个小方格）的细胞总数，然后根据下列公式求得菌液的浓度：

25316型：

细胞总数/ml=（80小方格内的菌数/80）3400310003103稀释倍数 16325型：

细胞总数/ml=（100小方格内的菌数/100）3400310003103稀释倍数 三、方法与步骤

1.取一块洁净的血球计数板，在计数室上面加盖一块专用的厚盖玻片。 2.用滴管吸取菌悬液滴于盖玻片的边缘，让菌液靠毛细作用渗入计数室，注意不能有气泡产生。将计数板置显微镜的载物台上，静止5min，使细胞全部沉

实验十三、培养基的配制及灭菌

一、目的要求

1.掌握培养基的配制方法。

2.掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌的操作方法。 二、材料

根据实验需要确定。 三、基本原理

培养基是人工配制的适合于微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。其中含有碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等。并需调整在一定的酸碱度范围之内。

灭菌是指杀死一定环境中所有微生物。微生物实验室常用的灭菌方法包括直接灼烧、恒温干燥箱灭菌、高压蒸汽灭菌、间歇灭菌、煮沸灭菌等方法。这些方法的基本原理是通过加热使微生物体内的蛋白质凝固变性，从而达到杀菌的目的。

四、方法和步骤 1.培养基的配制

（1）称药品：取少于总量的水于烧杯中，称取培养基成分（琼脂除外），逐一加入水中。对于牛肉膏、酵母膏等原料，在称量后要连同称量纸一起投入水中，待原料被洗下后，再将称量纸取出。

（2）加热溶解：将烧杯放在石棉网上，用文火加热，并不断搅拌，待各药品完全溶解后再补充水分至所需容量。

（3）调节pH：培养基的酸碱度可用精密pH试纸或酸度计等进行测定。调整可用10%NaOH或10%HCl溶液进行，调整时应避免调整过头再回调，因为这样容易影响培养基的体积和渗透压。

（4）过滤：液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基则可用4层纱布趁热过滤。但是供一般使用的培养基，这步可省略。

（5）分装：

A．分装三角瓶：将液体培养基倒入三角瓶中，其装量以不超过三角瓶总容量的3/5为宜，然后每瓶中加入1.5-2.5%的琼脂（视培养基的要求和琼脂的质量而定），用这种方法可使融化琼脂和灭菌同步进行，以节省融化琼脂的时间。另一种方法是先称取琼脂于液体培养基中，待烧杯内的琼脂完全融化后再分装三角瓶。

B．分装试管：将融化的固体培养基趁热加至漏斗上（装置见图13-1）。分装时左手并排地拿数根试管，右手控制弹簧夹开关，将培养基依次加入各试管。用于制作斜面培养基时，装量不超过试管高度的1/5。分装时谨防培养基沾在管

口上，以免使棉塞沾上培养基而造成染菌。

（6）加棉塞：试管口和三角瓶口塞上用普通棉花制作的棉塞，棉塞的形状、大小和松紧要合适，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。加塞时应使棉塞总长的3/5塞入试管口或瓶口内，以防止棉塞脱落。若三角瓶口较大，而棉花纤维又短，则可在制好的棉塞外包一层纱布，这样的棉塞既耐用又便于操作。

（7）包扎：在棉塞外包一层牛皮纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应先把试管扎成捆后，再于棉塞外包一层牛皮纸，然后贴上标签，注上培养基名称、日期及组别后进行灭菌。

2.灭菌（高压蒸汽灭菌锅的操作过程）

（1）使用前先在灭菌锅内加入适量的水，然后把要灭菌的物品放入锅内，盖上锅盖，对称的拧紧螺栓，以防漏气。

（2）在灭菌锅底部加热，同时打开排气阀，待自排气阀冒热气3-5min后关闭。至压力表所示压力升至所需压力时开始计时。通过调整热源而维持一定的压力。达到灭菌时间后停止加热。

（3）待锅内蒸汽全部排完后，方可打开排气阀打开锅盖，取出灭菌物。如需制成斜面，则最好待试管内培养基降至50-60℃时再摆。摆得过早会产生过多的冷凝水（见图13-2）。

特别应注意的是，如不待压力降至零点，便打开排气阀或锅盖，轻则会使容器内的培养基因突然减压而剧烈沸腾，沾污棉塞，重则会造成严重的人身伤亡事故。

（4）使用完毕后，应及时将锅内的水放出，以防生锈。

高压蒸汽灭菌锅种类和规格很多，以上操作步骤适用于手提式高压蒸汽灭菌锅。其他种类的灭菌锅在使用时应严格按操作说明书操作。

附录：

恒温干燥箱灭菌的操作过程：

（1）把要灭菌的物品放在箱内，堆积时要留有空隙，勿使接触器壁、铁壳，关闭箱门。

（2）接通电源，把位于箱顶的通气口适当打开，使箱内湿空气能溢出，至箱内温度达到100℃时关闭。

（3）调节温度控制器旋钮，直至箱内温度达到所需要的温度为止。观察温度是否恒定。若不稳定，再行调节，稳定后不可再拨动调节旋钮和通气孔，保持140-160℃，2-3h。

（4）灭菌结束后切断电源，待箱内温度降至60℃时，才能打开箱门，取出灭菌物品，同时应将温度调节旋钮调到零点，并打开通气孔。

实验十四、微生物的纯培养技术

一、目的要求

掌握无菌操作的基本环节及各种分离、接种方法。 二、材料 根据实验需要确定 三、基本原理

分离微生物最常用的有三种方法：平板划线法、涂布平板法和倾注平板法。在划线过程中随着接种环在琼脂表面往返划动，微生物细胞从接种环上转移到平板上，可使每个细胞在培养基表面形成一个菌落。平板划线法是目前使用最广泛的一种分离技术。而平板涂布技术和倾注平板法则都是先将样品进行稀释，而后用固体培养基使合适稀释液中的菌体定位。

在微生物的研究工作中，为了使微生物不断延续其生命，需一次次的将其接种到新培养基上。接种操作决不允许不需要的微生物进入培养基而造成污染。将污染降到最低限度的接种技术称为无菌操作技术。它是微生物工作中的一种最重要而又最基本的操作。

四、方法和步骤 1.接种的操作方法 （1）斜面接种：

A．操作前，先用75%酒精擦手，待酒精挥发后，才能点燃酒精灯。 B．用斜面接种时，将菌种管和培养基管握在左手的大拇指和其他四指之间，使斜面向上，并处于水平位置。

C．先将两支试管的棉塞旋转一下，以便于接种时拔出，并把棉塞握住，不得任意放在台子上，或与其他物品相接触，再以火焰烧管口。

D．将上述在火焰上灭过菌的接种环伸入菌种管内，接种环先在试管内壁上或未长菌苔的培养基表面接触一下，使接种环充分冷却，以免烫死菌种。然后用接种环在菌苔上轻轻接触，刮出少许培养物，将接种环自菌种管中抽出，抽出时勿与管壁相碰，也勿使再通过火焰。

E．迅速的将沾有菌种的接种环伸入培养基试管口，在斜面上划线（波浪或直线），使菌体粘附在培养基上。划线时勿用力，否则会划破培养基表面。

F．将接种环抽出，灼烧管口，塞上棉塞。

G．接种环放回原处前，要经火焰灼烧灭菌，同时需将棉塞进一步塞紧，以免脱落。

以上操作过程参见图14-1。 （2）液体接种：

A．由斜面菌种接入液体培养基：基本操作方法与前相同，但使试管口略高

一些，以免培养基流出。接入菌体后，使接种环与管口壁轻轻地研磨使菌体擦下。接好种后，塞上棉塞。将试管在手掌中轻轻敲打，使菌体充分分散。

B．由液体菌种接入培养基平板

菌种为液体时，接种除用接种环外，还可用无菌吸管或滴管。只需在火焰旁拔去棉塞，将试管口通过火焰灭菌，用无菌吸管吸取菌液0.1-0.2ml，注入平板后，用无菌的玻璃棒在平板表面均匀涂布（图14-2）。

（3）穿刺接种：

穿刺接种系把菌种用穿刺的方法接种到固体深层培养基中，此法用于厌氧性细菌接种，或为鉴定细菌时观察生理性能用。

A．操作方法与上相同，但使用的接种针要挺直。

B．将沾有菌种的接种针自培养基中心刺入，直至接近管底，但勿穿透，然后按原穿刺线慢慢拔出（图14-3）。

2.分离的操作方法 （1）平板划线分离：

A．倒制平板：将融化的琼脂培养基冷却到45℃左右，在酒精灯火焰旁以右手的无名指与小手指夹持棉塞，左手打开打开无菌培养皿的盖的一边，右手持三角瓶向皿里注10-15ml培养基。将培养皿稍加旋转摇动后，置于水平位置待凝。

B．划线分离：在酒精灯火焰上灼烧接种环，待其冷却后，以无菌操作取一环待分离的菌液。

划线时，琼脂平板可放在台子上，也可持在手中（图14-4）。左手握琼脂平板，在火焰附近稍抬起皿盖，右手持接种环伸入皿内，在平板上第一区域“之”字形来回划线。划线时，使接种环与平板表面成30-40度角轻轻接触，以腕力使接种环在琼脂表面作轻快地滑动，勿划破表面。

灼烧接种环，待其冷却后，将手中培养皿旋转70°角，用接种环在划过线的第一区域接触一下，然后在第二区域进行划线，并依次对第三和第四区域进行划线（图14-5）。

划线完毕后，在皿底用记号笔注明样品名称、日期、姓名（或学号），将整个培养皿倒置放入28-30℃恒温培养箱中培养。

48-72小时后，观察并记录单菌落的生长和分布情况。 （2）倾注平板法：

A．编号：取6支盛有4.5ml无菌水的试管排列于试管架上，依次标上10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6字样。

B．稀释:以1ml无菌吸管按无菌操作从样品管中吸取0.5ml菌液于10-1试管中，然后用另一吸管在10-1试管中来回吹吸三次，使其混合均匀，制成10-1稀释液。再用此吸管从10-1管中吸取0.5ml稀释液注入10-2管中，依次制成10-2，10-3，

10-4，10-5，10-6稀释液。

C．加样：用1ml无菌吸管分别吸取10-4，10-5，10-6稀释液1ml注入已编好号的10-4，10-5，10-6号无菌培养皿中（图14-6）。

D．倾注平板：将融化后冷至45℃左右（以手持三角瓶，不觉烫手为宜）的琼脂培养基，向加有稀释液的各培养皿中分别倒入10-15ml，迅速旋转培养皿，使培养基与稀释液充分混合，水平放置，待其凝固后，倒置于28-30℃恒温箱中培养。

48-72小时后，观察并记录各平板上菌落生长和分布情况。哪个稀释度最合适？

（3）涂布平板法：

A．平板制备：制备三套无菌平板，并分别写上10-4，10-5，10-6。 B．稀释：同倾注平板法。

C．加样：用无菌吸管分别吸取10-4，10-5，10-6稀释液0.2ml对号注入编好号的琼脂平板中。

D．涂布：用无菌涂棒在各平板表面进行均匀涂布。待涂布的菌液干后，将培养皿倒置于28-30℃恒温箱中培养。

E．48-72小时后，观察并记录菌落生长和分布情况。 五、思考题

1.为什么要把培养皿倒置培养？ 2.接种前和接种后为什么要灼烧接种环？

3.为什么要待接种环冷却后才能用其与菌种接触?是否可以将接种环放在台子上待其冷却？你怎样才能知道它是否已经冷却？

附一、无菌操作环节

（1）接种室应保持清洁，用煤酚皂液擦洗台面和墙壁，定期用乳酸或甲醛熏蒸。每次使用前，均应用紫外灯灭菌。定期对接种室作无菌程度的检查。

（2）进入接种室前，应先做好个人卫生工作，在缓冲间内要更换工作鞋帽、工作衣、戴口罩。工作衣、工作鞋、口罩只准在接种室内使用，不准穿到其他地方去，并要定期更换、消毒。

（3）接种的试管、三角瓶等应做好标记，注明培养基、菌种的名称、日期。移入接种室内的所有物品，均须在缓冲间用70%酒精擦拭干净。

（4）接种前，双手用70%酒精或新洁尔灭消毒，操作过程不离开酒精灯火焰，棉塞不乱放；接种工具使用前后均需火焰灭菌。

（5）培养箱应经常清洁消毒。 附二、接种室的消毒方法

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