肿瘤缺氧、血管生成及肺癌的关系的研究

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英文缩略词一览表

缩写英文全称中文全称

A absorbance 吸光度

CAIX carbonic anhydrases IX碳酸酐酶IX

DAB Diaminobenzidien 对氨基联苯胺

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid 乙二胺四乙酸

ELISA enzyme linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附试验

ES Endostatin 内皮抑素

H hour 小时

HE haematoxylin and eosin 苏木精－伊红染色

HRP horse radish peroxidase 辣根过氧化物酶

mAb monoclonal antibody 单克隆抗体

min minute 分钟

NSCLC non-small cell lung cancer 非小细胞肺癌

OD optical density 光密度

PBS phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液

S second 秒

S-P streptrsavidin-biotin-peroxidase 链霉亲合素－生物－过氧化物酶VEGF vascular endothelial growth factor 血管内皮生长因子

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独创性声明　

本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。　

学位论文作者签名：周文斌　

日期：　２００８　年　５　月　２７　日　

学位论文版权使用授权书　

本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。　

保密□　，在＿＿＿＿＿年解密后适用本授权书。　

本论文属于　

不保密□。　

（请在以上方框内打“√”　）　

学位论文作者签名：周文斌　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　指导教师签名：白明　　

日期：2008 年 5 月27 日日期：2008 年5月27 日　

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肿瘤缺氧、血管生成与肺癌的关系的研究

博士研究生：周文斌

导师：白明教授

中文摘要

研究背景原发性支气管肺癌(简称肺癌)是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，约占所有肿瘤的12.4%，且发病率一直呈上升趋势。近年来，尽管其诊疗水平有较大的提高，但5年生存率仅为8.9%。肺癌预后差，主要与其发生转移有关，虽然临床医生采取了以手术为主的多学科综合治疗，但大多数患者仍死于肺癌的局部复发或远处转移。因此有关肺癌的发病机理、预防、早期诊断、治疗及预后仍然是研究的重点和难点。

恶性肿瘤的生长、浸润及转移受多种因素的影响，缺氧和肿瘤血管的生长是两个重要的因素。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者存在缺氧，碳酸酐酶(carbonic anhydrases IX, CAIX)被认为是一种可靠的缺氧标记物。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前已知的唯一能特异作用于血管内皮细胞的血管生长因子，已有研究表明VEGF在肺癌等多种肿瘤组织中表达并调节其生物学行为。目前国内尚无有关肺癌患者CAIX表达的研究，也没有同时检测肺癌患者CAIX和VEGF表达的研究报道。

渗出性胸腔积液的常见病因为结核性和癌性，临床上二者的鉴别极为重要，将决定治疗和预后，但有时难以鉴别。研究表明VEGF是胸腔积液形成的关键介质，VEGF 在肺癌胸膜转移导致恶性胸腔积液生成中具有重要的作用，肺癌导致的恶性胸液中VEGF明显升高。endostatin是一种特异性内皮细胞增生抑制剂，具有很强的抑制血管生成的作用，是目前已知作用最强、最专一的血管形成抑制因子之一。目前国内外有关胸腔积液中endostatin的研究还很少，而且目前尚无同时检测胸腔积液中VEGF和endostatin的研究。同时检测胸腔积液中VEGF和endostatin水平可能有助于结核性胸腔积液和癌性胸腔积液的诊断与鉴别诊断。

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吸烟与肺癌的关系众所周知，研究表明，吸烟是肺癌的重要危险因素，每年大约有300万人由于吸烟而死于肺癌，但其机制仍不十分清楚。在吸烟者中如何早期发现肺癌是临床研究的热点。肺癌等肿瘤的生长和转移均依赖于肿瘤血管的生成。国内外研究发现肺癌患者血液中VEGF和endostatin水平升高，但未见研究吸烟者尤其是吸烟伴肺癌患者血液中VEGF和endostatin水平的报道。研究吸烟者血中VEGF和endostatin水平，有助于进一步探讨吸烟导致肺癌的分子机制，为肺癌的预防及早期诊断提供新的理论依据。

本课题分为以下三部分，现分述如下：

第一部分

碳酸酐酶Ⅸ和血管内皮生长因子在非小细胞肺癌中的表达及意义

【摘要】目的：探讨碳酸酐酶IX (carbonic anhydrases IX,CAIX)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及与临床病理参数的关系。方法：应用免疫组化方法检测84例NSCLC和20例正常肺组织中CAIX和VEGF的表达。结果：(1) NSCLC组织中CAIX和VEGF阳性表达率分别为71.4%(60/84)和66.7%(56/84)，均显著高于正常肺组织(P<0.01)，20例正常肺组织中未见CAIX和VEGF表达；(2) CAIX的表达与病理组织类型、肿瘤的大小、临床分期及淋巴结转移相关，鳞癌患者的CAIX阳性率明显高于腺癌患者(P<0.05)。且随临床分期Ⅰ～Ⅳ期的顺序明显上升(P<0.05)，同时有淋巴结转移组CAIX阳性表达率明显高于无淋巴结转移组(P<0.01)，CAIX的表达与肿瘤的分化程度无明显关系(P>0.05)。(3) VEGF的表达与肿瘤的大小、淋巴结转移及临床分期相关，有淋巴结转移组VEGF阳性表达率显著高于无淋巴结转移组(P<0.01)，临床分期中Ⅰ-Ⅱ期VEGF 阳性表达率明显低于Ⅲ-Ⅳ期(P<0.05)；VEGF的表达与肿瘤的分化程度及病理组织类型无明显关系(P>0.05)。(4) CA IX和VEGF的表达呈正相关(r=0.405, P<0.01)。结论：CAIX和VEGF高表达均与NSCLC的发生、发展和浸润转移有关，二者可能起协同作用。

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华　中　科　技　大　学　博　士　学　位　论　文【关键词】非小细胞肺癌；碳酸酐酶Ⅸ；血管内皮生长因子；免疫组织化学

第二部分

血管内皮生长因子和内皮抑素检测对结核性和癌性胸腔积液的诊断价值

【摘要】目的：检测胸腔积液中血管内皮生长因子(VEGF)和内皮抑素(endostatin)在癌性和结核性胸腔积液中的含量，探讨二者及其比值在结核性和癌性胸腔积液中的鉴别诊断价值。方法：采用酶联免疫吸附法、竞争性酶免疫法分别检测胸腔积液中VEGF、endostatin含量。结果：(1)、癌性胸腔积液VEGF、endostatin含量分别为(4.4±2.9)ng/ml和(3.9±2.5)ng/ml，明显高于结核性胸腔积液(P <0.01, P <0.05)；(2)、胸腔积液中VEGF和endostatin对癌性胸腔积液诊断的灵敏度分别是57.5%和50.0%，特异性分别是81.0%和90.5%；检测VEGF/endostatin比值可提高诊断的灵敏度和特异性至97.5%和90.5%。结论：胸腔积液中VEGF和endostatin的升高有助于癌性胸腔积液的诊断，检测胸腔积液中VEGF/endostatin比值可极大提高对癌性胸腔积液诊断的敏感性和特异性。

【关键词】胸腔积液；血管内皮生长因子；内皮抑素

第三部分

吸烟者血清VEGF和endostatin水平的变化及其意义

【摘要】目的：探讨吸烟者血清血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF) 和内皮抑素 (endostatin)水平的变化及其临床意义。方法：采用病例-对照设计方法对伴和不伴肺癌的164例吸烟者测定血清VEGF和endostatin水平，将20例不吸烟健康人作为正常对照组。结果：(1)、吸烟伴肺癌组(82例)血清VEGF水平明显高于吸烟无肺癌组(82例)及正常对照组(P均<0.01)。吸烟无肺癌组高于正常对照组(P<0.05)；(2)、吸烟伴肺癌组血清endostatin水平明显高于正常对照组(P<0.01)，但与

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吸烟无肺癌组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，吸烟无肺癌组高于正常对照组(P<0.05)；(3)、吸烟伴肺癌组血清endostatin/VEGF比值明显低于吸烟无肺癌组和正常对照组(P均<0.01)，但吸烟无肺癌组与正常对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。（4）、吸烟伴肺癌组和吸烟无肺癌组VEGF与endostatin均呈显著正相关(P均<0.01)。结论：吸烟可能是导致endostatin/VEGF失衡的重要因素，而endostatin/VEGF失衡又导致肺癌发生。吸烟者应定期检测血清VEGF、endostatin水平及endostatin/VEGF比值，endostatin/VEGF比值可能是吸烟者早期诊断肺癌的指标之一。

【关键词】肺肿瘤；血管内皮生长因子；内皮抑素；吸烟

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The study of tumor hypoxia and angiogenesis in lung cancer

Candidate for Ph.D: Zhou Wenbin

Supervisor: Prof. Bai Ming

Abstract

Background： Lung cancer is one of the highest incidence and mortality in all kinds of caner in the world，and it is the most common cause of death due to cancer. Recently，the incidence of lung cancer is rising step by step，especially in China. Non-small cell lung cancer (NSCLC) accounts for more than 75% of pulmonary carcinomas. Treatment of patients with NSCLC is a particular challenge in oncology, because more than one third of patients have distant metastases at diagnosis, allowing only palliative treatment. Tumor growth, invasion and metastasis are infuenced by a variety of factors, and most important of these factors are tumor hypoxia and angiogenesis. Carbonic anhydrases IX(CAIX) is considered as an reliable marker of tumor hypoxia. Considerable interest has been focused on angiogenic factors in the field of lung cancer. Angiogenesis represents the formation of new blood vessels from existing vasculature. Neovascularisation is a requirement for growth of solid tumours beyond 1~2 mm in diameter. The angiogenic process is a balance between stimulatory and inhibitory factors. The pro-angiogenic stimuli may be released by the tumour, stromal and inflammatory cells, by the extracellular matrix, or by the endothelial cells themselves. Tumour cells secrete or induce the release of growth factors which stimulate migration and proliferation of endothelial cells. Furthermore, these factors may be involved in capillary morphogenesis or release of proteolytic enzymes.

Vascular endothelial growth factor (VEGF) and endostatin are two of the most potent factors involved in angiogenesis. Clinical and experimental studies demonstrated significantly elevated serum and tissue levels of VEGF in patients with lung cancer, implicating VEGF in the pathogenesis of this disease.

Pleural effusion often remains a diagnostic problem after the biochemical and cytological analysis of the pleural fluid. In most series, malignancy is the most common cause of pleural exudates. Pleural effusions are common and important complications that

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may be produced by a wide variety of diseases especially malignancies. It is important to elucidate the precise etiology of the pleural effusion especially to discriminate benignfrom malignant effusions. Pleural effusion can present a challenging diagnostic problem which remains unsolved even after clinical and laboratory evaluation. The differential diagnosis is diverse, but most common causes include malignancy, tuberculous, congestive heart failure and empyema-related effusion.

VEGF is the most potent and endothelial specific angiogenic growth factor and it plays a pivotal role in formulation of PE, which has proved to be a useful marker to differentiate malignancy from a benign origin in exudative pleural effusions. Differing VEGF levels were found in malignant and tuberculous pleural effusions, implying a varying degree of influence on the process of fluid accumulation in the pleural space in different disease states. Tumor spreading has been associated with angiogenesis, a process tightly controlled by balance between angiogenesis factor and angiogenesis inhibitor. Pleural angiogenesis, increased vascular permeability, and leakage play a key role in the development of exudative pleural effusions. Although many known angiogenesis-inducing factors including VEGF are present within pleural fluid and these high levels are thought to induce vascular permeability, the relative levels of antiangiogenic factors such as endostatin in PE have been reported only by few studies. Endostatin induces endothelial cell apoptosis and inhibits the proliferation and migration of some types of endothelial cells, and in vivo it has potent anti-angiogenic activity. Although serum levels of endostatin have extensively been studied in patients with malignant diseases, endostatin in pleural effusion has not been fully evaluated. The respective determination of the concentrations of VEGF and endostatin has been proved helpful in differentiating between pleural effusion of malignant and tuberculous or benign origin.

The rel ationship between smoking and lung cancer is well understood, but the mechanism of the close association is not definitely known. However, heavy smoking has been demonstrated to affect serum VEGF levels. Therefore, we intend to implore whether there is an imblance of angiogenesis in sera of heavy smoking subjects.

The present study is divided into three parts as follows.

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Part I

Expression and significance of carbonic anhydrases IX and vascular endothelial growth factor in non-small cell lung cancer

【Abstract】Objective: To explore the expression and role of carbonic anhydrases IX (CAIX) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in non-small cell lung cancer. Methods: The expression of CAIX and VEGF in 86 pathologically diagnosed non-small cell lung can cer and normal lung tissue was detected using immunohistochemical technique. The immunostaining data was compared with clinical pathological parameters. Results: Among the 84 specimen of malignant cases, expression of CAIX was detected in 60(71.4%) and VEGF in 56(66.7%). Both CAIX and VEGF were expressed maximally on the luminal surface of tumors and around regions of necrosis in tumors. No positive staining of CAIX and VEGF were found in normal lung tissue. The expressions of CAIX and VEGF were related to tumor size, clinical stage and status of lymphatic node. There was an association between CAIX and VEGF(r=0.405,P<0.01). Conclusion: The hypoxia and angiogenesis are important markers of carcinoma. CAIX and VEGF were involved in the tumorgenesis and progression of non-small cell lung cancer. CAIX and VEGF might play synergetic roles in invasion and metastasis of the disease.

【Key Words】non-small cell lung cancer; carbonic anhydrase; vascular endothelial growth factor; immunohistochemistry

Part II

The detection of vascular endothelial growth factor and endostatin in malignant and tuberculosis pleural effusions

【Abstract】Objective: To explore changes and clinical significance of VEGF and endostatin in malignant and tuberculosis pleural effusions. Methods: Eighty-two effusion samples, 42 from patients with lung cancer and 40 from patients with tuberculosis, were analyzed. VEGF and endostatin concentrations were determined by enzyme linked immunoabsent assay (ELISA) or competitive enzyme immunoassay. And sensitivity, specificity and accuracy for diagnosing the malignant pleural effusion were compared.

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Results: The concentrations of VEGF and endostatin were significantly higher in malignant than those in nonmalignant effusions(P both <0.01). For VEGF, sensitivity, specificity and accuracy to diagnose the malignant pleural effusion were57.5%, 81.0%, and 69.5%, respectively. Similarly, for endostatin, the sensitivity, specificity and accuracy to diagnose the malignant pleural effusion were50.0%, 90.5%, and 70.7%, respectively. Unexpectedly, when VEGF/endostatin ratio was analysed, sensitivity, specificity and accuracy were significantly rising up to 97.5%, 90.5%, 93.9%. Conclusion: These findings suggest that elevated levels of VEGF and endostatin in pleural effusions are helpful to make the diagnosing of malignant pleural effusions and differentiate malignant from tuberculosis pleural effusions, especially VEGF/endostatin ratio can increase sensitivity, specificity and accuracy.

【Key words】Pleural effusion; Vascular endothelial growth factor; Endostatin

Part III

Changes of levels of sera vascular endothelial growth factor and endostatin in smokers

【Abstract】Objective: To explore the changes and clinical significance of levels of serum VEGF and endostatin in smokers. Methods: In a case-control study, levels of serum VEGF and endostatin were determined in 82 smokers with lung cancer, 82 pair-matched smokers without lung cancer and 20 healthy non-smokers by enzyme linked immunoabsent assay (ELISA) or competitive enzyme immunoassay. Results: The levelss of serum VEGF in smokers with lung cancer (16.1±7.9ng/L) were markedly higher than those in the other two groups (both P <0.01). And the levels of serum VEGF in smokers without lung cancer were significantly higher than those in healthy nonsmokers (P <0.05). The levels of serum endostatin in smokers with lung cancer were significantly higher than those in healthy nonsmokers (P <0.01), but were not significantly different from those in smokers without lung cancer (P >0.05). Notably, the ratio of endostatin to VEGF in smokers with lung cancer (1.3±0.5) was significantly lower than that in other two groups (both P <0.01). However, there was no significant difference in it between smokers without lung cancer and healthy nonsmokers (P >0.05). Conclusion: These findings suggest that smoking may

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result in imbalance of levels of serum endostatin and VEGF leading to tumorigenesis. The ratio of endostatin to VEGF can be considered as an early diagnostic markers of lung cancer in smokers. Periodic determination of levels of serum VEGF and endostatin as well as the ratio of endostatin to VEGF is of clinical importance.

【Key words】Lung neoplasma; Vascular endothelial growth factor; Endostatin; Smoking

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论文正文

肿瘤缺氧、血管生成与肺癌的关系的研究

前言

原发性支气管肺癌(简称肺癌)是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，约占所有肿瘤的12.4%，且发病率一直呈上升趋势。近年来，尽管其诊疗水平有较大的提高，但5年生存率仅为8.9%。有关肺癌的发病机理、预防、早期诊断、治疗及预后仍然是研究的重点和难点。

恶性肿瘤的生长、浸润及转移受多种因素的影响，缺氧和肿瘤血管的生长是两个重要的因素。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者存在缺氧，碳酸酐酶(carbonic anhydrases IX, CAIX)被认为是一种可靠的缺氧标记物。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前已知的唯一能特异作用于血管内皮细胞的血管生长因子，已有研究表明VEGF在肺癌等多种肿瘤组织中表达并调节其生物学行为。目前国内尚无有关肺癌患者CAIX表达的研究，也没有同时检测肺癌患者CAIX和VEGF表达的研究。本研究采用免疫组化技术研究NSCLC的CAIX和VEGF 的表达，探讨它们与NSCLC生物学行为的关系。

渗出性胸腔积液的常见病因为结核性和癌性，临床上二者的鉴别极为重要，将决定治疗和预后，但有时难以鉴别。研究表明VEGF是胸腔积液形成的关键介质，肿瘤、炎症等病变胸膜组织均可产生大量的VEGF，因此，VEGF在肺癌胸膜转移导致恶性胸腔积液生成中具有重要的作用，肺癌导致的恶性胸液中VEGF明显升高。近年来，国内外研究均表明胸腔积液中VEGF的检测有助于结核性胸腔积液和癌性胸腔积液的诊断与鉴别诊断。endostatin是一种特异性内皮细胞增生抑制剂，具有很强的抑制血管生成的作用，是目前已知作用最强、最专一的血管形成抑制因子之一。国内外许多研究发现癌症患者血清endostatin水平升高，血清endostatin水平可能是肺癌患者的肿瘤标志物之一。目前有关胸腔积液中endostatin的研究还很少，而且目前尚无同时检测胸腔积液中VEGF和endostatin的研究。因此，本研究同时检测胸腔积液VEGF

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和endostatin水平，旨在探讨VEGF和endostatin在结核性与癌性胸腔积液中的作用及其鉴别诊断意义，为临床更好地诊断和治疗胸腔积液提供理论依据。

吸烟与肺癌的关系众所周知，研究表明，吸烟是肺癌的重要危险因素，每年大约有300万人由于吸烟而死于肺癌，但其机制仍不十分清楚。在吸烟者中如何早期发现肺癌是临床研究的热点。肺癌等肿瘤的生长和转移均依赖于肿瘤血管的生成，VEGF 是目前所知作用最强的促血管内皮生长的细胞因子，它能促进肿瘤血管形成，而endostatin等血管生成抑制因子抑制肿瘤血管形成。国内外研究发现肺癌患者血液中VEGF和endostatin水平升高，可能具有诊断和判断预后的价值。但未见研究吸烟者尤其是吸烟伴肺癌患者血液中VEGF和endostatin水平的报告。有鉴于此，本研究按病例对照方法对吸烟伴和不伴肺癌患者采用酶联免疫法(ELISA)、竞争性酶免疫法测定血清VEGF和endostatin水平，以探讨吸烟者肺癌的高危因素，为实施积极干预提供实验依据。

本课题分为三部分：(1) 采用免疫组化技术对84例NSCLC组织标本和20例正常肺组织中的CAIX和VEGF的表达进行研究，探讨它们与NSCLC生物学行为的关系；(2) 采用ELISA、竞争性酶免疫法实验技术同时检测胸腔积液VEGF和endostatin 水平，探讨VEGF和endostatin在结核性与癌性胸腔积液中的鉴别诊断意义；(3) 采用ELISA实验技术、竞争性酶免疫法检测吸烟者血清VEGF和endostatin的浓度，以求进一步探讨血管生成失衡在吸烟与肺癌关系中的作用。

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材料与仪器

一、主要生化试剂及来源

(1)免疫组化SP试剂盒北京中山试剂公司

(2)VEGF ELISA试剂盒深圳晶美生物工程有限公司

(3)endostatin 竞争性酶免疫法试剂盒深圳晶美生物工程有限公司

(4)鼠抗人VEGF单克隆抗体北京中山生物技术有限公司

(5)鼠抗人CAIX单克隆抗体北京中山生物技术有限公司

(6)EDTA抗原修复缓冲液PH9.0 福州迈新生物技术有限公司

(7)柠檬酸抗原修复缓冲液PH6.0 福州迈新生物技术有限公司

(8)PBS磷酸盐缓冲液PH7.2 福州迈新生物技术开发公司

(9)DAB显色剂北京中山生物技术有限公司

(10)复染剂苏木素福州迈新生物技术有限公司

(11)多聚赖氨酸防脱片剂北京中山生物技术有限公司

(12)封片剂中性树胶北京中山生物技术有限公司

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二、主要仪器和器材

SW-CJ-IB 标准型净化工作台苏州净化设备厂

台式离心机北京医用离心机厂LD4-2A型

RM2135型轮转式组织切片机德国莱卡公司

ZD-II型微波炉上海中达医学应用研究所

电热鼓风干燥箱上海沪南科学仪器厂科通101-2型微量加样器美国Eppendorf公司

BMJ-III型病理组织包埋机常州中威电子仪器厂

病理组织漂烘处理仪(PHY-Ⅲ) 上海仪器厂

96微孔板NUNK公司

病理图象分析系统重庆天海PIPS-2020

ELX808酶标仪美国宝特公司

电子石英定时计锡山市金城仪器厂

紫外分光光度仪美国Beckman公司

蛋白图像分析系统德国Kontron公司真彩图像分析仪低温冰箱日本三洋公司MDF-3821型

普通冰箱中国青岛海尔电器

温度指示控制仪(WMZK-01) 上海医用仪表厂

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第一部分

碳酸酐酶Ⅸ、血管内皮生长因子在非小细胞肺癌中的表达及意义

前言

恶性肿瘤的生长、浸润及转移受多种因素的影响，缺氧和肿瘤血管的生长是两个重要的因素。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者存在缺氧，碳酸酐酶(carbonic anhydrases IX, CAIX)被认为是一种可靠的缺氧标记物[1~4]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前已知的唯一能特异作用于血管内皮细胞的血管生长因子，已有研究表明VEGF在肺癌等多种肿瘤组织中表达并调节其生物学行为[5,6]。目前国内尚无碳酸酐酶在NSCLC中表达的研究，本研究采用免疫组化技术对84例NSCLC组织标本和20例正常肺组织中的CAIX和VEGF的表达进行研究，研究CAIX和VEGF在NSCLC组织中的表达及与肺癌临床病理特征的关系，从而为阐明CAIX在肺癌发生、发展中的作用及其可能机制，提供理论依据，同时，研究肿瘤血管生成除了阐明其在肿瘤发生发展中的意义和作用外，更重要是针对血管生成因素，抑制血管生成，为NSCLC的治疗提供一些参考。

材料与方法

一、临床资料

84例NSCLC标本均取自2004年9月~2007年3月在胸外科手术的非小细胞肺癌患者，纳入标准：1、术前未接受放、化疗等其他任何抗肿瘤治疗；2、术后病理证实为肺癌，组织学分类明确；3、术后石蜡标本保存完好，有足够待测组织。排除标准：1、术前作过放疗或化疗者；2、术后病理诊断不明确，组织学分类不清楚者；3、术后石蜡标本保存不完整者。84例NSCLC中男56例，女28例，年龄27~70(平均47.9)岁；其中鳞癌57例，腺癌27例；分化程度：高分化39例，中分化33例，低分化12例；临床分期按1997年国际抗癌联盟(UICC)的分期标准，其中Ⅰ期17例，Ⅱ期26例，Ⅲ期36例，Ⅳ

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期5例；有淋巴结转移52例，无淋巴结转移32例；肿瘤直径<3cm者40例，=3cm者44例。选取20例同期手术切除的正常肺组织作为对照组。对照组20例中男14例，女6例，年龄29~73(平均52.7)岁。所有肺组织标本均经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，所有标本连续切片厚4µm，均经病理确诊。

二、实验试剂

鼠抗人CAIX单克隆抗体(一抗)，浓缩型，R＆D公司产品，购自北京中山生物技术有限公司，使用浓度1:100，4℃冰箱保存；鼠抗人VEGF单克隆抗体(一抗)，浓缩型，购自北京中山生物技术有限公司，使用浓度1:100，4℃冰箱保存；S-P免疫组化试剂盒、DAB显色系统均购自北京中山生物技术有限公司；多聚赖氨酸防脱片剂，购自北京中山生物技术有限公司，4℃冰箱保存。用已知宫颈鳞癌CAIX阳性切片、膀胱癌VEGF阳性切片分别作阳性对照。按照SP试剂盒所附说明书进行操作。

三、实验方法

1、VEGF免疫组化步骤：

(1) 将切片脱蜡水化：PBS缓冲液冲洗3次，每次5min。EDTA高温抗原修复96℃15min；

(2) 双氧水阻断：用3% H2O2室温孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性；

(3) PBS冲洗3次，每次5 min；

(4) 血清封闭：甩去切片上的PBS缓冲液，每张切片上滴加50ul封闭液(正常山羊血清封闭非特异性位点，减少特异性结合)，湿盒内室温孵育15 min；

(5) 一抗孵育：倾去多余的血清，不洗，每张切片滴加50 ul 1:100稀释的一抗(兔抗人抗体)，置湿盒中，于4℃冰箱；

(6) 冰箱内取出湿盒在室温下复温30min，再用PBS缓冲液冲洗切片3次，每次5min；

(7) 二抗孵育：甩去切片上的PBS缓冲液，每张切片上滴加50ul生物素标记的二抗(抗兔的IgG抗体)，置于湿盒内，37℃孵育30 min；

(8) PBS冲洗3次，每次5 min；

(9) 甩去切片上的PBS缓冲液，滴加50ul链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，置

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于湿盒内37℃孵育15 min；

(10) PBS冲洗3次，每次5 min；

(11) DAB显色：甩去切片上的PBS缓冲液，每张切片上滴加约100ul新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3~10min，控制反应时间；

(12) 清水充分冲洗；

(13) 苏木素复染：将切片浸入苏木素90s，流水冲洗5min；

(14) 用l%盐酸酒精分化后充分水洗；

(15) 1%氨水返蓝后充分水洗；

(16) 梯度酒精脱水，二甲苯透明；

(17) 中性树胶封片。

2、CAIX主要实验步骤：

(1) 切片脱蜡和水化，将切片置3%过氧化氢溶液孵育10min，阻断内源性过氧化物酶的活性，高温高压抗原修复，5min×2次；

(2) 滴加正常山羊血清封闭液，室温20min；

(3) 再滴加一抗(浓度为3µg/ml)，置4℃冰箱过夜；

(4) PBS冲洗，2min×3次；

(5) 滴加生物素化山羊抗兔IgG，室温30min；

(6) PBS冲洗，2min×3次；

(7) 滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，20~37℃20min；

(8) PBS冲洗，5min×4次；

(9) DAB显色，镜下控制显色时间；

(10) 清水充分冲洗。

(11) 苏木素轻度复染；

(12) 梯度酒精脱水，透明；

(13) 中性树胶封片。

四、免疫组化染色结果的判断

由2位以上病理医生在不知患者临床和病理资料情况下对免疫组化染色结果进行

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华　中　科　技　大　学　博　士　学　位　论　文

评价。CAIX在细胞膜或细胞浆染色，阳性标准为染成棕黄色；每张切片免疫组化染色后发现不同肺癌组织CAIX染色强度各有差异，有的呈棕黄色，有的呈淡黄色，因此参照Swinson等[2]的方法，以细胞膜着色为基准作为判断标准：无着色或淡黄色为阴性，棕黄色为阳性。VEGF在细胞浆染色，所有的肺癌组织VEGF染色强度均较高，呈棕褐色。VEGF阳性染色判别参照Stefanoup等[6]的方法，在显微镜下随机取5个视野进行阳性细胞计数，计算阳性细胞所占比例。阴性表达(－)：阳性细胞数<10%；阳性表达(+)：阳性细胞数>10%。

五、统计学处理

采用SPSS 12.0统计软件包进行X2检验及Pearson相关分析，统计结果以P<0.05为差异有显著性

结果

一、CAIX与VEGF在肺癌组织和正常肺组织中的表达与分布

肺腺癌及鳞癌的HE染色见图1和图2。VEGF阳性表达主要见于肺癌细胞的细胞浆，表现为棕褐色颗粒，肺癌组织周边部表达下降，肺癌组织内巨噬细胞、部分血管内皮细胞及成纤维细胞也呈阳性表达(图3,4)。CAIX主要在肿瘤细胞的细胞膜染色，也可见细胞浆染色，表现为棕黄色颗粒(图5,6)。正常肺组织CAIX与VEGF均呈阴性表达。

本组84例肺癌组织中，CAIX阳性表达率为71.4%（60/84），与正常肺组织相比较，阳性率明显增高(X2=9.33, P<0.01)。VEGF阳性表达率为66.7%(56/84)，明显高于正常肺组织，二者间有显著差异(X2=7.29, P<0.01)。

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