分子生物学实验指导(2005)

实验内容

实验一、从植物组织中制备基因组DNA 实验二、从哺乳动物组织中制备基因组DNA 实验三、质粒DNA的提取、酶切与电泳鉴定 实验四、DNA片断的纯化与定量

实验五、重组DNA分子的构建、筛选与鉴定 实验六、PCR扩增DNA技术

实验七、PCR扩增产物的限制性长度多态性（PCR-RFLP） 实验八、随机扩增多态性DNA技术（RAPD） 实验九、微卫星DNA技术

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实验一、从植物组织中制备基因组DNA

1．仪器

1．台式离心机 2．恒温水浴器

3．紫外分光光度计 4．琼脂糖凝胶电泳系统 5．紫外透射仪 6．微量移液器 2．材料

1．三羟甲基氨基甲烷（Tris） 2．乙二胺四乙酸（EDTA） 3．十六烷基-三甲基-溴化铵（CTAB） 4．氯仿

5．异戊醇 6．氯化纳 (NaCl) 7．β-巯基乙醇 8．乙醇 9．醋酸铵 10．液氮 11．陶瓷研钵 12．离心管 3．试剂

1．2%CTAB提取液 2. 氯仿：异戊醇：体积比24：1 3. 7.5M醋酸铵 4. TE缓冲液

3.操作步骤 （一）DNA的提取

1．每组取1g新鲜叶片放入预先经过冷处理的研钵中，在液氮中研磨成粉末状。 2．将细粉末转移到1.5 ml的Eppendorf管中，分别加入1ml CTAB提取液，充分混匀，置于65℃水浴中保温1 h。

3．从水浴中取出离心管，12 000 rpm离心10 min，将上清液转移至另一新离心管中。

4．每管中加入1/2体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻缓地颠倒混匀，12 000 rpm离心5 min，上清液转至另一新离心管中。

5．每管中加入1/10体积的7.5 M醋酸铵和等体积的冰乙醇（100%），混匀，放置在-20℃冰箱中30 min或在室温下过夜。

6．12 000 rpm离心15 min获得DNA沉淀，70%乙醇洗2次，风干沉淀。 7．加入30ul TE缓冲液（含有10ug/ml RNase A）溶解DNA，并贮存在4℃冰箱中。

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（二）紫外分光光度法测定DNA含量

1． 吸取2ul DNA样品，加水至2 ml，混匀后，转入石英比色皿中， 2． 紫外分光光度计先用2 ml纯水校正零点，

3． 在260nm和280nm分别读出光密度，DNA样品的浓度为OD260×核酸稀释浓度×50/1000；浓度为ug/ul。 （三）琼脂糖凝胶电泳检测 1． 制备1%的琼脂糖凝胶；

2． 取2 ul样品，加3ul上样缓冲液（含溴酚蓝）和12ul无菌水，混匀； 3． 取一系列浓度不同的2ul标准样品（0.5-50ug/ml），分别加入3ul上样缓冲液和12ul无菌水，混匀后小心上样，开始电泳；

4． 将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液中染色，然后在紫外透射仪上观察结果，比较样品DNA和标准DNA的荧光强度，并估算出待测样品中的DNA浓度。

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实验二、从哺乳动物组织中制备基因组DNA

1．仪器

手术剪刀、眼科剪刀、酒精灯、台式高速离心机、电泳仪、电泳槽、微量移液器、凝胶成像系统、恒温培养箱、恒温水浴锅、电子秤量器、摇床、离心管、枪头、乳胶手套等

2．材料

猪冷冻肌肉组织、GL2000分子量标记。

3．溶液及试剂

1）化学试剂

TE 缓冲液、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、70%乙醇 2）酶类

蛋白酶K、RNA酶 4）电泳类试剂

1×TBE电泳缓冲液、6×蔗糖上样缓冲液、溴化乙锭溶液（EB）、琼脂糖凝胶

4．操作步骤

1.用剪刀剪取猪冰冻肌肉组织0.2～0.5g于1.5ml离心管内。

2．立即加入700ul STE液（含RNA酶），同时加入77ul 10％SDS液（总体积1/10），用眼科剪刀剪碎组织样品。

3．加入16ul蛋白酶K(20mg/ml),指弹混匀。

4．56℃消化8小时以上，直到肌肉组织颗粒消化完毕。 5．加700ul Tri饱和酚，置脱色摇床抽提2小时。 6．8000rpm离心5分钟，取上清液于另一1.5ml离心管中。 7．加700ul 酚氯仿(1:1)于离心管中，置于脱色摇床抽提1小时。 8．8000rpm离心5分钟，取上清液于另一1.5ml离心管中。 9．加700ul氯仿－异戊醇（24:1），置于脱色摇床抽提1小时。 10．8000rpm离心5分钟，取上清液于另一1.5ml离心管中。 11．加750ul异丙醇充分摇匀沉淀DNA。 12．8000rpm 离心3分钟沉淀DNA。

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13．倒掉上清液，加入1ml 70％冷乙醇指弹洗涤DNA沉淀。

14．12000 rpm 离心8分钟充分沉淀DNA,倒掉上清液，室温自然干燥DNA沉淀。 15．待DNA沉淀完全干燥，加200ul TE液溶解DNA，再加入2ul RNA酶，室温30min后放入4℃保存备用。若要长期保存，放入-20℃冰箱冻存。

16．配制0.8%琼脂糖胶（方法与实验一相同），取5ul DNA样品与适量溴酚篮（1ul）混匀后电泳。

5.电泳检测

1）1%琼脂糖凝胶的配制

称取1g琼脂糖，置于三角瓶中，加入100ml TBE工作液，混匀后将该三角瓶置于微波炉加热煮沸10sec，加入20ul（约一滴）溴化乙锭（1mg/mL），混匀后室温降温至50℃左右。用挡板封住胶板，在固定位置放上梳子，将凝胶缓慢倒入胶板，室温下静止30min左右，待凝胶凝固后，轻轻拔出梳子。拔掉挡板，将凝胶板放入含有TBE缓冲液的电泳槽中。 1）点样

取5ul提取的植物和动物基因组DNA，分别与适量的溴酚篮（样品的1/5）混匀后，点入凝胶孔内。同时将分子量标记5ul（DGL2000）也点入凝胶第一孔位置内。

注：DGL2000分子量标记分别是：2000bp, 1600bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp, 100bp。 2）电泳

接通电源后，将电泳仪的电压调至150V，电泳2小时左右，溴酚篮移动距点样孔3cm左右，停止电泳。 3）观察和拍照

将凝胶从凝胶板上取下，放到紫外观察箱中，打开紫外观察灯254nm，可见到大分子量的植物和动物基因组DNA。凝胶DNA的拍照采用凝胶成像仪（在植病重点实验室进行）。

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实验三、质粒DNA的提取、酶切与电泳鉴定

1．仪器

台式高速离心机、电泳仪、电泳槽、微量移液器、凝胶成像系统、恒温培养箱、冰箱、电子秤量器、摇床、离心管、枪头、乳胶手套等

2．材料

JM109大肠杆菌细胞、pMD 18-T 载体、含有猪MC1R基因的pMD 18-T重组质粒、猪MC1R基因插入片断和DGL2000分子量标记。

3．溶液及试剂

1）化学试剂

TE 缓冲液、溶液I（GET）、溶液II（裂解液）、溶液III（乙酸钾）、Tris饱和酚、氯仿（三氯甲烷）、异丙醇、70%乙醇、乙醇 2）细菌培养类试剂

LB液体培养基、LB固体培养基、氨苄青霉素、IPTG、X-Gal 3）酶类

EcoRI、PstI限制性内切酶、RNA酶 4）电泳类试剂

1×TBE电泳缓冲液、6×蔗糖上样缓冲液、溴化乙锭溶液（EB）、琼脂糖凝胶

4．操作步骤

1.质粒DNA的提取（碱法）

1）培养质粒：在LB固体培养基中，用灭菌枪头挑选含有猪MC1R基因的pMD 18-T重组质粒的大肠杆菌（JM109）单克隆，接种到含有氨苄青霉素（50ug/mL）的LB液体培养基3ml中，37℃震荡培养8h～16h。

2）取液体培养基1.5mL于1.5ml离心管中，转速12,000/min离心15sec，去上清夜，加入100uL含有RNA酶的溶液I（GET），充分混匀后在室温下放置5min。 3）加入200uL新配置的溶液II（裂解液），立即颠倒5～10次，使细菌裂解，室温放置2min。

4）加入350uL溶液III（乙酸钾）溶液，颠倒5～10次，使其充分中和，室温放置2min。

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5）用台式高速离心机，转速为12,000r/min离心5min，将上清夜移入另一干净1.5ml离心管中。

6）加入700uL酚氯仿溶液（1:1），震荡混匀，12,000rpm离心5min，取上层液至另一干净离心管中。

9）加入700ul 异丙醇，震荡混匀，在室温下静置2min，15,000r/min离心8min，弃上清夜。

10）离心管中加入1mL 70%冷乙醇，用漩涡振荡器将沉淀悬浮洗涤30sec，15,000r/min离心5min，弃上清夜。 11）在室温下使沉淀自然干燥（约30min）。

12）待沉淀完全干燥后，加入30ul TE缓冲液或灭菌蒸馏水溶解沉淀，4℃放置30分钟以上，使DNA充分溶解，-20℃保存备用。

2．质粒DNA的酶解

用EcoRI和PstI双酶解提取的重组质粒DNA，可获得2.6kb的质粒DNA片断和0.5kb的插入片断。

4）酶解反应液的配制（总体积30ul） 按以下顺序在0.5ml离心管中加入试剂： 试剂 灭菌水

1× 14ul

2× 28ul 6ul 3ul 3ul 40ul

4× 56ul 12ul 6ul 6ul 60ul

8× 112ul 24ul 12ul 12ul 160ul

10×酶解缓冲液 3ul EcoRI (10U/ul) 1.5ul PstI (10U/ul) 合计

1.5ul 20ul

按每管20ul分装，每管加入新提取的质粒DNA 10ul

2）将配制好的酶解反应液放置恒温培养箱37℃酶解过夜（8h～16h）。

3．电泳检测

1）1%琼脂糖凝胶的配制

称取1g琼脂糖，置于三角瓶中，加入100ml TBE工作液，混匀后将该三角瓶

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置于微波炉加热煮沸10sec，加入20ul（约一滴）溴化乙锭（1mg/mL），混匀后室温降温至50℃左右。用挡板封住胶板，在固定位置放上梳子，将凝胶缓慢倒入胶板，室温下静止30min左右，待凝胶凝固后，轻轻拔出梳子。拔掉挡板，将凝胶板放入含有TBE缓冲液的电泳槽中。 5）点样

取5ul提取的质粒DNA及5ul酶解后的质粒DNA，分别与适量的溴酚篮（样品的1/5）混匀后，点入凝胶孔内。同时将分子量标记5ul（DGL2000）也点入凝胶第一孔位置内。

注：DGL2000分子量标记分别是：2000bp, 1600bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp, 100bp。 6）电泳

接通电源后，将电泳仪的电压调至100V，电泳2小时左右，溴酚篮移动距点样孔3cm左右，停止电泳。 7）观察和拍照

将凝胶从凝胶板上取下，放到紫外观察箱中，打开紫外观察灯254nm，可见到分子量3.1kb的质粒DNA和2.6kb与0.5kb的质粒酶解片断。凝胶DNA的拍照采用凝胶成像仪（在植病重点实验室进行）。

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实验四、DNA片断的纯化与定量

1．仪器

台式高速离心机、电泳仪、电泳槽、微量移液器、凝胶成像系统、恒温水浴锅、电子秤量器、离心管、枪头、乳胶手套等 2．材料

pMD18-T 线性质粒(2.6kb)、猪MC1R基因的插入片断（0.5kb）、DGL2000分子量标记、单面刀片等。

3．溶液及试剂

UNIQ-10柱式DNA胶回收与纯化试剂盒 2）电泳类试剂

1×TAE电泳缓冲液、6×蔗糖上样缓冲液、溴化乙锭溶液（EB）、琼脂糖凝胶

4．操作步骤

1．纯化线性质粒2.6kb与插入片断0.5kb（实验一酶解所得），采用DNA快速纯化/

回收试剂盒（上海生工）

1）电泳：制备1%琼脂糖凝胶，用TAE缓冲液和大孔梳子制胶，将实验一酶解质粒产物（30ul）与4ul溴酚篮混匀后点样至点样孔内，同时点入5ul DGL2000分子量标记。100V电泳2h后，在紫外灯下可见一条2.6kb的线性质粒和0.5kb的插入片断。

2）用琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，然后用干净的手术刀割下含需回收DNA的琼脂块，放入1.5ml离心管中。判定DNA片段的位置时尽可能使用长波长紫外光，在紫外光下照射的时间应尽可能短。在紫外观察灯下，用单面刀片切取含2.6kb线性质粒和0.5kb插入片断的琼脂糖凝胶（在保证全部切取DNA片段的前提下，切取的琼脂糖凝胶应尽可能小），将该凝胶放入1.5ml离心管内，称重。

3）按每400μl/100mg琼脂糖凝胶的比例加入Binding Buffer,置于50︿60oC水浴中10分钟，使胶彻底融化。加热融胶时，每2分钟混匀一次。

4）将融化的胶溶液转移到套放于收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2分钟。8000rpm离心1分钟。

5）取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，

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加入500μl Wash Solution,8000rpm室温离心1分钟。 6）重复步骤4一次。

7）取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，12000rpm离心30秒。

8）将UNIQ-10柱放入一根新的1.5ml离心管中，在柱子膜中央加30μl Elution Buffer或水(PH>7)，室温或37oC放置2分钟。

9）12000rpm室温离心1分钟，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20oC备用。

2．DNA片段的定量

方案一：电泳法与标准分子量marker比较。

1）制备好凝胶后，在点样孔点入5ul分子量标记（DGL2000），取所需定量的DNA样品1ul和2ul分别加入9ul和8ul TE，与适量的溴酚篮（2ul）混匀后点入点样孔。

2）100V电泳2h，在紫外灯下比较需定量的DNA片段与分子量标记条带的亮度，推算纯化的DNA片段的浓度。

3）分子量标记（2000bp, 1600bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp, 100bp）每条带的浓度约为50ng。

4）取1ul和2ul样品估测的平均数即为DNA片段的定量结果。 方案二：用核酸/蛋白定量仪进行定量（具体操作结合仪器讲解）。

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实验五、重组DNA分子的构建、筛选与鉴定

1．仪器与耗材

台式高速离心机、PCR仪、电泳仪、电泳槽、微量移液器、凝胶成像系统、恒温培养箱、恒温水浴锅、摇床、培养皿、离心管、枪头、乳胶手套等

2．材料

纯化后的pMD 18-T 线性质粒(2.6kb)、纯化后的猪MC1R基因的插入片断（0.5kb）、DGL2000分子量标记。

3．溶液及试剂

1）细菌培养类试剂

LB液体培养基、LB固体培养基、SOC培养基、氨苄青霉素、IPTG、X-Gal 2）酶类 T4 DNA连接酶 3）电泳类试剂

1×TBE电泳缓冲液、6×蔗糖上样缓冲液、溴化乙锭溶液（EB）、琼脂糖凝胶

4．操作步骤

1． 重组DNA分子的构建

1）用灭菌水将实验二纯化的线性质粒DNA（2.6kb）和DNA插入片段（0.5kb）稀释至20ng/ul左右

2）按以下反应体系配制连接反应

插入片段:质粒1×

(3:1) 灭菌水

10×连接缓冲液 线性质粒 插入片段 T4 DNA连接酶 总体积

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插入片段:质粒1×

(1.5:1)

6ul 1ul 1ul 1ul 1ul

灭菌水 10×连接缓冲液 线性质粒 插入片段 T4 DNA连接酶

5ul 1ul 2ul 1ul 1ul 10ul

10ul 总体积

3）在室温（22℃左右），反应2h以上。

2、细胞转化

1) 在冰上溶解50ul感受态细胞JM109.

2) 待细胞溶解后，加入5ul连接反应液（约2ng/ul），轻微指弹混匀，不可剧烈震荡。

3）在冰中放置30min。 8）42℃水浴锅中放置45sec. 9）立即移入冰中放置2min. 10） 11）

3．重组子的检测

1）制备含氨苄青霉素的LB固体培养基平板：在500ml试剂瓶中，加入7.5g细菌培养用琼脂粉与500ml已配制的LB液体培养基，高压灭菌，待液体冷却至55℃左右时（瓶底不烫手背），加入500ul氨苄青霉素（50mg/ul），混匀后适量（约30ml～50ml）倒入培养皿中，静置直到液体凝固为止（约2h左右）。

2）在平板表面加入X-gal 20ul和IPTG 4ul，用无菌玻璃涂棒将试剂均匀涂布于整个平板表面，置37℃ 1h 直至所有液体蒸发。

3）取50ul和250ul细菌培养液加在平板的表面，用无菌玻璃涂棒将菌液均匀涂布于整个平板表面，将平板放置于37℃培养15min，至液体被吸收。 4）倒置平板于37℃培养12h～16h，可出现菌落。

5）于4℃将平板放置1h，使蓝色充分显色。用灭菌牙签挑选单个白色菌落置2ml LB液体培养基（含氨苄青霉素）中，37℃摇床培养8h～12h。

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加入预先保存在37℃的SOC培养基940ul. 37℃振荡培养1h.

实验六、PCR扩增DNA技术

1．仪器

台式高速离心机、PCR基因扩增仪、电泳仪、电泳槽、微量移液器、凝胶成像系统、离心管、枪头、乳胶手套等。

2．材料 猪基因组DNA（15ng/ul）。 3．溶液及试剂

1)）引物

PCR扩增哺乳动物磷酸酯转移蛋白基因（PLTP） 上游引物PLTPF2: TGAAGGGTAGGACAAGACAG 下游引物PLTPR1: GTTGAGGAGGAAGCGCATC 2）化学试剂

10×PCR buffer，MgCl2（25mM），dNTPs（10mM），石蜡油 3）Taq酶（购自上海生工）5U/ul 4）电泳类试剂

1×TBE电泳缓冲液、6×蔗糖上样缓冲液、溴化乙锭溶液（EB）、琼脂糖凝胶

4．操作步骤

1）按以下顺序配制PCR反应混合物（总体积25ul）

dH2O 10×Buffer 2+Mg (25mM) PLTPF2 (10nM) PLTPR1(10nM) dNTP (10 mM) Tag (5U/ul) 合计 1× 16.8 2.5 1.5 0.75 0.75 0.5 0.2 23 2× 33.6 5 3 1.5 1.5 1 0.4 46 5× 84 12.5 7.5 3.75 3.75 2.5 1 115

按每管23ul分装后，分别加模板DNA 2ul (约30ng)。最后每管加一滴石蜡油覆盖反应混合物，防止液体挥发。

2）PCR反应条件

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预变性：94℃ 3min 变性：94℃ 45sec

退火：58℃ 45sec 40 cycles 延伸：72℃ 45sec 后延伸：72℃ 5min 3）电泳检测

用1%的琼脂糖胶检测（胶的配制及电泳方法与实验一相同），取5ul PCR产物与适量溴酚篮（1ul）混匀后电泳。

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实验七、PCR扩增产物的限制性长度多态性（PCR-RFLP）

1．仪器

台式高速离心机、PCR基因扩增仪、电泳仪、电泳槽、微量移液器、凝胶成像系统、离心管、枪头、乳胶手套等。

2．材料

猪基因组DNA（15ng/ul）。

3．溶液及试剂

1)）引物

PCR扩增哺乳动物磷酸酯转移蛋白基因（PLTP） 上游引物PLTPF2: TGAAGGGTAGGACAAGACAG 下游引物PLTPR1: GTTGAGGAGGAAGCGCATC 2）化学试剂

10×PCR buffer，10×HaeIII buffer, MgCl2（25mM），dNTPs（10mM），石蜡油

3）Taq酶与限制性内切酶HaeIII

Taq酶（5U/ul）与限制性内切酶HaeIII（10U/ul）（上海生工）。 4）电泳类试剂

1×TBE电泳缓冲液、6×蔗糖上样缓冲液、溴化乙锭溶液（EB）、琼脂糖凝胶

4．操作步骤

1）PCR扩增猪PLTP基因（条件与实验六相同）。 2）酶切反应

按以下顺序配制酶切反应混合物（反应总体积20ul） 反应物 灭菌水 10×酶解缓冲液

1× 13ul 2ul

2× 26ul 4ul 2ul 32ul

4× 52ul 8ul 4ul 64ul

HaeIII (10I/ul) 1ul 合计

16ul

按每管16ul分装，分别加PCR产物4ul(约100ng)。 3）酶切反应条件

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在恒温培养箱37℃ 4h 以上。 4）电泳检测

用1.5%的琼脂糖胶检测（胶的配制及电泳方法与实验一相同），取全部20ul 酶切产物与适量溴酚篮（4ul）混匀后电泳。

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实验八、随机扩增多态性DNA技术（RAPD）

1．仪器

台式高速离心机、PCR基因扩增仪、电泳仪、电泳槽、微量移液器、凝胶成像系统、离心管、枪头、乳胶手套等。

2．材料

猪基因组DNA（15ng/ul）。

3．溶液及试剂

1)引物

单条随机引物S357（上海生工生物工程技术服务有限公司） S357：ACGCCAGTTC 2）化学试剂

10×PCR buffer，MgCl2（25mM），dNTPs（10mM），石蜡油 3）Taq酶

Taq酶(5U/ul)购自上海生工生物工程技术服务有限公司， 4）电泳类试剂

1×TBE电泳缓冲液、6×蔗糖上样缓冲液、溴化乙锭溶液（EB）、琼脂糖凝胶

4．操作步骤

1）按以下顺序配制RAPD反应混合物（总体积10ul）

dH2O 10×Buffer 2+Mg (25mM) S357 (10nM) dNTP (20 mM) Tag (5U/ul) Total in each 1× 5.5 1 0.8 0.4 0.2 0.1 8 2× 11 2 1.6 0.8 0.4 0.2 16 5× 27.5 5 4 2. 1 0.5 40 按每管8ul分装后，分别加模板DNA 2ul (30ng)。最后每管加一滴石蜡油覆盖反应混合物，防止液体挥发。

2）RAPD反应条件

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预变性：94℃ 3min 变性：94℃ 1min

退火：36℃ 1min 40 cycles 延伸：72℃ 1.5min 后延伸：72℃ 8min 3）电泳检测

用1.5%的琼脂糖胶检测（胶的配制及电泳方法与实验一相同），取10ul RAPD产物与适量溴酚篮（2ul）混匀后电泳。

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实验九、微卫星DNA技术MIC-DNA

1．仪器

台式高速离心机 PCR基因扩增仪 电泳仪 微量移液器 凝胶成像系统 离心管 枪头 乳胶手套 竖式电泳槽 枪头 手套 移液管 透明胶 水平脱色摇床 染色盘

2．材料

猪基因组DNA（15ng/ul）。

3.溶液及试剂

1)引物

上游引物SWR136F: TTCTCTGCCGTCACTCACTG 下游引物SWR136R: CTGGGACCCTCCATATGATG 2）化学试剂

10×PCR buffer，MgCl2（25mM），dNTPs（10mM），石蜡油， 丙烯酰胺， 10%过硫酸铵(用前配制)， 甲醛， 无水乙醇， HNO3 ， AgNO3， Na2CO3 HAc， Na2S2O3 ， TEMED ， 琼脂糖。 3）Taq酶

Taq酶(5U/ul)购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

4）溶液（配置见附页）：前处理液 固定液 染色液 显影液 定影液 5xTBE 6x蔗糖缓冲液

4．操作步骤

（一）PCR反应

1）按以下顺序配制PCR反应混合物（总体积10ul）

dH2O 10×Buffer 2+Mg (25mM) SWR136F(10nM) SWR136R(10nM) dNTP (10 mM) Tag (5U/ul) 合计 1× 5.5 1.0 0.6 0.3 0.3 0.2 0.1 8 10× 55 10 6 3 3 2 1 80

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按每管8ul分装后，分别加模板DNA 2ul (约30ng)。最后每管加一滴石蜡油覆盖反应混合物，防止液体挥发。

2）PCR反应条件 预变性：94℃ 3min 变性：94℃ 30sec

退火：56℃ 30sec 40 cycles 延伸：72℃ 30sec 后延伸：72℃ 5min

（二）制胶

1）用胶带和1%的琼脂糖封闭玻璃板与垫片间的缝隙

2）用移液管取30%丙烯酰胺13.35ml于小烧杯中，加入5XTBE10 ml,定容至50ml 3）向烧杯中加入350μl过硫酸铵和25μlTEMED混合后，立即灌胶。 4）然后插梳子，聚合1h （三）上样、电泳

1）凝胶聚合后，拔出梳子，并用去离子水洗点样孔； 2）加电泳工作液； 3）点样；

4）电泳：接通电源(150V 1h或小电压过夜) （四）染色

1）玻璃板的分离 电泳结束后，关闭电泳仪，小心地揭开玻璃板，将凝胶剥离后放入已准备好的入有双蒸水的干净的瓷盘中，将瓷盘放在摇床上轻摇1min 2）凝胶的固定 倒掉瓷盘中的水，加入固定液，在摇床上缓缓摇动15min 3）洗胶 倒掉瓷盘中的固定液，用双蒸水洗2次，共计1min

4）凝胶的氧化 倒掉瓷盘中的水，加入前处理液氧化化，在摇床上缓缓摇动15min 5）洗胶 倒掉瓷盘中的前处理液，用双蒸水洗2次，共计1min

6）凝胶的染色 倒掉瓷盘中的水，加入染色液，在摇床上缓缓摇动20min 7）洗胶 倒掉瓷盘中的染色液，用双蒸水洗2次，共计1min

8）凝胶的显影 加少量显色液冲洗15s，再加一定体积显色液，轻摇瓷盘直到

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CTAB沉淀液

1%(w/v) CTAB 1g CTAB

50mmol/L Tris·HCl 5ml 1mol/L Tris·HCl, pH8.0 10 mmol/L EDTA 2ml 0.5mol/L EDTA 加水定容至100mL 葡萄糖溶液 1mol/L

在90ml H2O中溶解18g葡萄糖

加水定容至100mL用0.22μm滤膜过滤除菌

蔗糖溶液 1mol/L

在70ml水中溶解34.2g 蔗糖

加水定容至100ml，用0.22μm滤膜过滤除菌

乙酸钾溶液（KAc），5mol/L pH4.8 29.5ml 冰乙酸

KOH颗粒调校至pH4.8（约3g）加水至100ml

溶液I（GET缓冲液） 10ml 1mol/L葡萄糖 4ml 0.5mol/L EDTA

5ml 1mol/L Tri·Cl, pH8.0加水定容至100Ml，用前加溶菌酶4mg/mL

溶液II（变性液） 0.2 ml 10mol/L NaOH 1ml 10% SDS

加水至10ml用前现配

溶液III (乙酸钾溶液) 60ml 5mol/L乙酸钾溶液 11.5ml 冰乙酸 28.5ml H2O

银染试剂的配制

固定液（10%乙醇）：量取50ml无水乙醇，加超纯水定容至500ml。 前处理液（1%HNO3）：取5ml HNO3，加超纯水定容至500ml。

染色液（0.2%AgNO3）：取1g AgNO3, 用超纯水定容至500ml ，临用前加入100ul

甲醛。

显影液（3%Na2CO3）：取15gNa2CO3溶于450ml 超纯水，临用前加1000ul甲醛和

500ulNa2S2O3(10mg/ml), 定容至500ml。

定影液（10%HAc）：取50ml HAc用 超纯水定容至500ml。

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