TRIpure LS 总RNA抽提试剂操作方法及步骤说明书

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TRIpure Reagent LS 液体样本总RNA提取试剂

目录号：RN02 ?

试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成

TRIpure LS（4℃避光）

(RN0201)

50 ml

(RN0202)

100 ml

? 储存事项：

TRIpure LS在室温下能稳定保存12个月。尽管如此，为达到最佳效果，我们建议保存在2~8°C的环境下。

? 重要提示：

本品中含有苯酚，具有毒性和腐蚀性。如果吸入体内、接触皮肤、吞食等会导致中毒、灼伤以及其他身体伤害。使用本制品时应穿戴防护物品，如防护服装、手套、眼罩、面罩等。如果不小心接触，应立即用大量的水冲洗并前往医院治疗。

? 1.

注意事项：

样品用TRIpure LS匀浆后，如果不即刻加入氯仿之前，，置于-70°C下可放置一个月以上。保存在75%乙醇中的RNA沉淀，2-8°C可以保存一周，-20°C条件下可以保存1年。RNA半衰期比较短，容易降解，建议提取后尽快进行后续实验，如反转录成cDNA，Northern Blot等。

2. 若下游实验对DNA非常敏感，建议用 RNase free DNase I（货号：RN45）对RNA进行处理。

3. 自备试剂：氯仿、异丙醇（新开封或提取RNA专用）、75%乙醇(用DEPC处理过的水配制)、 RNase free water或者DEPC处理过的水。

4. 本公司生产TRIpure Reagent LS质量优异，可以完美替代Invitrogen的Trizol Reagent LS。提取质量和下游实验完全一样。

? RNA抽提操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）

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提示：用TRIpure LS抽提RNA时要戴手套和护眼罩。避免接触皮肤和衣服。在化学通风橱完成操作。避免呼吸道吸入。如无特殊说明，所有的操作应该在15~30°C的室温条件下。 1.

匀浆

a. 生物液体：每0.25ml液体样品(血清，血浆，脑脊液等等)加入0.75ml TRIpure LS，用加样枪吹打液体样品几次以帮助裂解样品中细胞。每5~10×106个细胞至少加入0.75ml TRIpure LS。TRIpure LS 和液体样品的终体积比总是3：1。 b. 动物组织：用glass或强力匀浆器搅匀组织样品，每50~100mg组织或者0.25ml组织悬液加0.75ml的TRIpure LS。一般50~100mg组织体积都要小于0.25ml，如果组织样品的体积小于0.25ml，加入灭菌水将组织样品体积调整到0.25ml以保证体积比例是3：1。

c. 单层生长细胞：直接往直径3.5 cm的培养板中加入0.3ml-0.4ml的TRIpure LS裂解细胞，用加样枪吹打帮助充分裂解细胞。依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的TRIpure LS量（每10cm2加0.3-0.4ml）。不需要往裂解物里面加水，因为培养板中附着残留的培养液已经充分稀释了TRIpure LS。 注意：贴壁培养细胞往往不能完全从培养瓶（皿）脱落，这并不意味着裂解不完全，此时细胞膜实际已经完全破裂开，并已释放出RNA，继续做即可。 d. 细胞悬液：通过离心来沉淀细胞。在TRIpure LS试剂中用移液管反复吹打来裂解细胞。每5~10×106的动物细胞，植物或酵母菌细胞或每1×107细菌加0.75ml的TRIpure LS。和步骤b一样用灭菌水调节样品体积到0.25毫升。在加入TRIpure LS前应避免洗涤细胞，因为那样会增加mRNA降解的可能性。破裂某些酵母菌和细菌可能需要使用匀浆器。

e. 植物组织：取新鲜植物组织在液氮中充分研磨或将植物组织剪碎后直接在TRIpure LS中迅速研磨，每50-100mg组织加入0.75ml TRIpure LS，和步骤b一样用灭菌水调节样品体积到0.25毫升，混匀。

2. 3.

将匀浆样品剧烈震荡后在室温条件下放置5分钟以使核蛋白体完全解离。 可选步骤： 在4°C的条件下以12,000 rpm的离心力离心10分钟，取上清。

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如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或肌肉，植物的块茎结节等可离心去除。离心后的沉淀中包含有细胞外膜，多糖，以及高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织的样品时，上层是大量油脂应除去。取澄清的匀浆液进行下一步。 4.

每0.75ml TRIpure LS加0.2ml氯仿。盖紧管盖，剧烈震荡15秒并将其在室温下放置2~3分钟。 5.

在4°C 12,000 rpm的离心力高速冷冻离心10-15分钟。离心后混合物分成三层：下层有机苯酚氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA无一例外地存在于水样层当中。水样层的容量大约为所加TRIpure LS容量的70%。 （有机层和中间层是蛋白和DNA，如果需要提取，请联系我们索取提取方法）。 6.

将水样层转移到一干净的离心管中，加入等体积异丙醇。 颠倒混匀后室温放置10分钟。

RNA沉淀在离心前通常不可见，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。 7. 8.

在室温或者4°C 12,000 rpm 离心10分钟，弃上清。

加入75%乙醇洗涤沉淀。每使用0.75ml TRIpure LS用1ml 75%乙醇对沉淀进行洗涤。 9.

在室温或者4°C 12,000 rpm离心3分钟，弃上清，注意不要丢失RNA沉淀。 注意：剩余的少量液体可短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。? 10. 室温放置2-3分钟，晾干。加入30-100μl RNase free水，充分溶解RNA，得到的

RNA保存在-70℃，防止降解。

注意：沉淀不要过分干燥，以免难于溶解。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/t83t.html