2015微流控芯片技术在循环肿瘤细胞分离中的研究进展_吕晓庆1_李_

网络出版时间：2015-04-28 09:23网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.2161.Q.20150428.0923.001.html生物化学与生物物理进展

ProgressinBiochemistryandBiophysics2015,42(4):301~312

www.pibb.ac.cn

微流控芯片技术在循环肿瘤细胞

分离中的研究进展*

吕晓庆1)李

2)雷2)**陈红梅3)陈鹏4)**刘静2)

(1)天津医科大学基础医学研究中心转化肿瘤学实验室，天津300070；中国科学院理化技术研究所低温工程学重点实验室，低温生物医学工程学北京市重点实验室，北京100190；3)中国科学院半导体研究所集成光电子学国家重点联合实验室，北京100083；4)天津医科大学附属肿瘤医院，天津市肺癌诊治中心，天津300060)摘要循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells，CTCs)是指从原发肿瘤或转移灶脱落、发生上皮-间质转化进入患者外周血血液循环的恶性肿瘤细胞．CTCs在肿瘤研究和临床诊断上的作用逐渐得到认可，外周血中CTCs存在与否以及数量多少不但可以用于肿瘤的早期诊断，还可以用于评估肿瘤预后、监测肿瘤的转移和复发．微流控芯片作为一个高通量、小型化的细胞实验平台，已被应用于CTCs的分选当中．本文综述了用于CTCs捕获的微流控芯片系统的最新研究进展，着重介绍各类芯片的捕获原理、芯片结构和捕获效率，最后对微流控芯片技术在CTCs分选中的应用前景进行了展望．关键词微流控芯片，循环肿瘤细胞，肿瘤转移，细胞分选Q81，R73DOI:10.16476/j.pibb.2014.0309学科分类号恶性肿瘤已成为我国死亡率最高的重大疾病之一，90%以上的肿瘤病人死于肿瘤的转移和复发．循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells，CTCs)是从实体瘤或转移灶脱落，发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)进入外周血血液循环的恶性肿瘤细胞，被认为是肿瘤发生转移的必要前提[1-2]．微环境改变的条件下，CTCs又发生间质-上皮转化(mesenchymal-epithelialtransition，MET)而在远端器官中停留，生成新的肿瘤，从而导致肿瘤转移[3]．CTCs检测在新的肿瘤生物标志物的发现、肿瘤预后判断及个体化治疗方面存在很大的应用潜力，是国内外肿瘤研究的热点之一．然而，CTCs在血液中的数量非常少，109个血细胞中仅含有1～10个CTCs[4]，因此，CTCs研究的关键在于从含有大量血细胞的复杂血液样本中准确、高效地将其分选出来[5]，满足高捕获率、高纯度和高通量的要求，进而成为能够满足科研和临床需求的工具．a．高捕获率，即可以将样品中的CTCs尽可能多地分离出来；b．高纯度，

即希望分离出来的细胞只含有CTCs，其他细胞的含量很少或没有，收集到的CTCs可以进行表型和基因型分析；c．高通量，即能短时间内处理大量样品．目前，唯一通过美国食品和药品监督管理局(FDA)认证的CTCs分离和计数系统是CellSearch，它是一个依赖于免疫磁珠原理的半自动化工作系统．该系统通过连接了抗上皮细胞黏附分子抗体(epithelialcelladhesionmolecule，EpCAM)的磁珠和CTCs表面标志物EpCAM特异性结合，达到捕获CTCs的目的．CTCs的识别使用经典的免疫染色法．该系统分选CTCs效率为80%[6]．尽管

*中国科学院重点部署项目(KJZD-EW-TZ-L03-6)，天津市自然科学基金项目(13JCYBJC23600)，国家自然科学基金面上项目(61078074)和中国博士后科学基金(2014M550794)资助.**通讯联系人.

李雷.Tel:010-82543766,E-mail:lileilei@mail.ipc.ac.cn陈鹏.Tel:022-23340123,E-mail:chenpengdoc@sina.com收稿日期：2015-02-02，接受日期：2015-03-05

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CellSearch已通过FDA批准，但该系统还存在一些缺点，比如暂未实现全自动分选、假阳性比率高[7]、富集后的CTCs没有生物活性等，更重要的是，CellSearch捕获到的CTCs仅仅是EpCAM阳性的类型，而许多恶性程度很高的CTCs并不表达EpCAM，从而无法被检测出来．微流控芯片是一个集样品制备、反应、分离、检测等功能于一体的小型分析实验平台，它通过微加工技术，在硅、玻璃、聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)等材料上，根据实际需求，制作出各种结构的、尺寸在微米量级的管道进行实验．将原来需要在一个综合实验室内完成的工作简化到一个微小的芯片上，不仅减少了耗材和试剂的消耗、大大降低了成本，而且提高了检测的灵敏度和分析速度，具有自动和高效的优点．随着微流控芯片技术在细胞生物学中的应用不断扩展，微流控芯片具有的可集成样品预处理和分析为一体的优势，在DNA测序[8-9]、蛋白质检测[10-11]、细胞操控和胞内成分分析[12-13]等研究领域显示出巨大的应用潜力．由于微流控芯片管道尺寸在微米量级和细胞尺寸匹配，非常适合应用于细胞分选，近些年来，有越来越多的研究者将该技术应用在CTCs的分选上．微流控芯片分选和富集CTCs的原理主要分为4类：a．利用抗原抗体亲和性进行分选；b．利用细胞物理特征的不同进行分选，比如细胞大小、变形性以及不同大小的细胞在流场中的力学特性；c．利用免疫磁珠具有磁性兼连接抗体的作用进行分选；d．利用不同细胞的电学性能差异进行分选等．本文依据不同的CTCs分选原理，总结了近年来利用微流控芯片分离、富集CTCs的研究现状和最新进展．1亲和性分选法利用亲和性反应(affinityreaction)原理进行细胞分选是微流控芯片上最经典、最常用的方法之一(图1a)，具体步骤是在芯片内部的微通道或微结构上修饰能够与目的细胞表面抗原结合的特异性抗体

(a)A

抗原抗体亲和性红细胞白细胞(c)F免疫磁珠GB注射泵芯片(b)C

血液

物理特征注射器样品收集管循环肿瘤细胞免疫磁珠抗上皮细胞黏附分子抗体磁铁(d)双向电泳10滋mE

间距不等的微柱

D

过滤

确定性侧向位移

Fig.1TheschematicofvariousCTCscapturingmicrofluidicchips图1

微流控芯片捕获CTCs各类芯片结构示意图

(a)亲和性分选法(A:亲和性分选芯片原理示意图;B:亲和性分选芯片系统装置及芯片内部微柱显微照片).(b)物理特征分选法(C:大小-变形性分选微柱捕获示意图;D:大小-变形性分选微孔捕获示意图;E:确定性侧向位移芯片示意图).(c)免疫磁珠分选法(F:免疫磁珠捕获原理示意图;G:磁珠和大小-变形性方法结合捕获示意图，细胞与磁珠结合后，尺寸增加，更有利于细胞被捕获).(d)双向电泳分选法示意图.

2015;42(4)吕晓庆,等：微流控芯片技术在循环肿瘤细胞分离中的研究进展

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或适配体，比如上皮细胞黏附分子，当样品流经微

通道时，目的细胞表面抗原与微通道或微结构上的特异性抗体或适配体结合，细胞被固定在芯片内，其他细胞随缓冲液流出芯片；再用合适的方法，比如更换缓冲液，洗脱并收集目的细胞进行下游分析.

He等[14]设计了一种由TiO2纳米颗粒制备的具有生物相容性纳米薄膜，在玻璃基底中旋涂这种纳米薄膜，再在薄膜上修饰EpCAM抗体，样品通过芯片时，CTCs结合在纳米薄膜上而留在芯片中．该研究将人结肠癌细胞HCT116混入健康人血液作为待测样品，成功分离出HCT116细胞，其效率约为80%．这种由纳米颗粒组成的纳米薄膜可以增加抗体和细胞表面抗原之间的接触机率．通过加大流体剪切力可将约50%的被捕获细胞洗脱下来，洗脱下来的细胞具有生物活性，可进行体外培养．Sheng等[15]制作了几何增强混合(geometricallyenhancedmixing)芯片，简称“GEMchip”，芯片大小与载玻片相同，芯片中有很多鱼脊形或V形结构，8个并联管道用以加大通量．这种芯片通过内部的鱼脊形或V形结构形成涡流，从而提高细胞与抗体之间的接触机率，有利于目的细胞与芯片结构内修饰的抗体结合，从而高效捕获CTCs．该研究将人胰腺癌细胞混入健康人血液作为待测样品进行实验，捕获效率高达90%，同样，被捕获的肿瘤细胞可以被洗脱并继续培养进行后续实验．Launiere等[16]设计了一种内部连接EpCAM和E选择素(E-selectin)的双抗体芯片，E选择素用于加大肿瘤细胞在所受流体剪切力作用下的捕获效率，与其结合的白细胞可以用一种螯合钙的缓冲液洗脱下来，肿瘤细胞则留在芯片内．文中还用只修饰EpCAM抗体的芯片作为对比，证明这种方法的捕获效率是只修饰EpCAM抗体的芯片捕获效率的1.9倍．Nagrath等[17]设计了具有微柱阵列结构CTCs捕获芯片，实验了不同癌细胞系EpCAM表达水平，对于人非小细胞肺癌细胞系NCI-H165的PBS悬液捕获效率高达99%，对于116例肿瘤转移患者(包括前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌和结肠癌)血液，有115例捕获到了数量不等的CTCs．其他利用亲和性原理捕获CTCs的微流控芯片整理列于表1．Table1捕获单元

TiO2纳米颗粒制备的纳米薄膜鱼脊形或V形结构直线型微管道微柱阵列PDMS鱼骨形结构曲线PMMA微管道金纳米孔PMMA微管道纳米多孔聚碳酸酯膜

硅纳米柱子

-：文章中未提．SummaryofaffinitymethodtocaptureCTCs

亲和性分选法捕获CTCs文献总结

样品

HCT116细胞混于血液L3.6pl细胞混于血液MCF-7细胞PBS悬液

NCI-H165细胞PBS悬液，癌症病人血液

PC-3细胞混于血液15例转移性前列腺癌病人血液

MCF-7细胞混于血液中PANC-1细胞混于血液PC-3细胞混于白细胞MCF-7、PC-3、T-26细胞混于血液

26例前列腺癌病人血液

捕获效率/%

8090959991.897-7095

参考文献[14][15][16][17][18][19][20][21][22]

表1抗体类型Anti-EpCAMAnti-EpCAMAnti-EpCAMAnti-EpCAMAnti-EpCAMAnti-EpCAMAnti-EpCAMAnti-EpCAMAnti-EpCAM

亲和性分选法有特异性高的优点，能有效分选形状、大小相似的不同种类细胞．目前大部分研究者采用EpCAM作为CTCs的表面特异性抗原[14-22]，但是在不同的肿瘤亚型中，EpCAM的表达各不相同，例如乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231的EpCAM表达水平不同[23]，并且当肿瘤细胞通过上

皮间质转化(EMT)作用传播时，EpCAM和角蛋白(CKs)的表达下调，波形蛋白(vimentin)和N-钙黏素(N-cardherin)表达上调[24]．依赖EpCAM的CTCs分选芯片会丢失不表达或低表达EpCAM的CTCs，然而这些CTCs具有更大的浸润性和侵入性[25]．因此，缺乏公认的表面标志物限制了亲和性分选在

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CTCs分选中的应用．另外，亲和性分选法要在通量和效率之间权衡，流速越大，CTCs和抗体反应的时间越少，这会导致分选效率降低．亲和性分选法与大小变形性分选法相结合，或使用多抗体修饰的芯片分选CTCs也许是个不错的解决办法，但不同种类抗体的反应缓冲液以及反应条件各不相同，实验成本也会随之增加．因此，增加芯片内部结构与细胞接触的面积和机率，在芯片内部修饰多种抗体捕获不同蛋白质表达的CTCs，是利用亲和性分选法原理分离CTCs的微流控芯片发展的主要方向．另外这种方法非常适合分选已知表面抗原的目的细胞，比如血液中的一些免疫细胞等．Hosokawa等[29]则用微腔阵列(microcavityarray，MCA)系统捕获CTCs，该系统的核心结构由100伊100个8～9滋m直径的圆孔阵列组成，芯片下面连接蠕动泵．实验中，NCI-H358细胞混在血液中，蠕动泵将样品从蓄液池吸入芯片，血细胞通过圆孔随缓冲液流出，肿瘤细胞则由于负压作用被固定在圆孔上从而被成功分离．该系统可将混在1ml血液中的10个肿瘤细胞在15min内完全捕获，并且保持细胞活性．染色鉴别结果证明其分选效率高达97%，大大高于同一实验样本采用CellSearch系统的分选效率．Jin等[30]设计了一种不同间距的“棘齿”型微柱阵列捕获芯片，间距依次从18滋m到2滋m递减，进入芯片的样品呈振荡流，与垂直方向的液流耦合，通过调整压力和流速，肿瘤细胞和血细胞在芯片内实现分离，人膀胱癌细胞掺在健康人血液中的样品分离效率在70%以上．Lv等[31]设计了一种间距渐变式捕获芯片，该芯片结构分为过滤和捕获两个部分．过滤部分的作用是滤掉血液中的杂质，最大限度减少芯片堵塞；捕获部分则设计了不同间距微柱，间距从12滋m到4滋m递减，血细胞可通过微柱，而肿瘤细胞则被捕获，肿瘤细胞混入磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline，PBS)悬液样品的捕获效率高达90%以上．其他基于细胞大小和变形性差异原理捕获循环肿瘤细胞的微流控芯片整理列于表2．基于细胞大小和变形性差异分选法捕获CTCs的优势在于：a．操作过程简单，样品只需用缓冲液稀释，不需要进行染色标记，检测时直接将稀释后的全血通入芯片，在出口处收集细胞即可；b．捕获效率高；c．能够实现高通量分选；d．成本远远低于CellSearch；e．无需依赖表面标志物，分选出的CTCs可以用多种抗体进行标志物鉴别．该方法存在的问题是仅仅基于细胞尺寸和变形性不同而进行过滤式分选，由于CTCs尺寸和白细胞有重叠部分，CTCs有可能会通过滤网或微柱的间隔，然而这些CTCs由于经历了EMT作用而具有间质细胞特性，更容易发生转移，恶性程度更高[32]；而且在较大的机械力作用下，CTCs随着缓冲液流过微柱或者滤网时容易破裂[33]．这些因素会对分离纯度和细胞活性造成一定影响，这类芯片在设计内部捕获单元时应避免使用带棱角的微柱，比如三角形、长方形、正方形等，而改用圆形、椭圆形等微柱，减少对细胞的损伤．2物理特征分选

微流控芯片进行CTCs分选，常根据CTCs与血细胞物理特性(如变形性、大小、流体力学特性等)的差异，通过在芯片中设置不同的微结构单元将其从血液中分离出来，常用的微结构包括微孔、微过滤网和微柱等．2援1基于细胞大小和变形性差异

大多数上皮来源的CTCs直径从14～26滋m不等，而白细胞直径从8～20滋m不等[26]．通过在芯片内部设计不同的小于CTCs直径的微孔、微过滤网、微柱等结构(图1b(C、D))，当含有CTCs的样品流经芯片时，CTCs由于直径大而被卡在结构内，血细胞则随缓冲液一起流出，较大的白细胞被结构捕获时，由于CTCs比白细胞变形性小，加大缓冲液流速时，白细胞被冲走，CTCs则留在芯片内，从而达到分离目的．Abnova公司的ClearCell誖CXSystem[27]就是基于此原理分离CTCs的代表，该系统还可以动态监测CTCs的捕获过程．芯片主要结构由圆柱形微柱构成，每个捕获单元由三个圆柱排列组成一个“爪形”结构．捕获后的CTCs可以进行染色鉴别和计数，亦可被重新收集继续培养进行后续实验，如研究CTCs的分子生物学特征、建立动物模型、临床个体病例研究等．Lim等[28]设计了一种微筛芯片，该芯片由硅片加工而成，其捕获单元为包含105个小孔的微阵列，蠕动泵将血液样品从芯片上方泵入进行捕获．该系统捕获掺在健康人血液中的MCF-7和HepG2细胞的效率在80%以上．该作者又用8例癌症病人血液样品进一步验证了该系统的可靠性，成功从病人血液中分离出CTCs，整个处理过程仅需1.5h.

2015;42(4)吕晓庆,等：微流控芯片技术在循环肿瘤细胞分离中的研究进展

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Table2

捕获单元微过滤器

管道特征硅材料微孔微腔阵列

Summaryofsize鄄deformabilitybasedmethodtocaptureCTCs表2基于细胞大小和变形性差异捕获CTCs文献总结

捕获间距10滋m8～9滋m

样品

MCF-7、HepG2细胞混于血液、癌症病人血液TheA549,HCC827,NCI-H358,NCI-H441,PC-14,

DMS79,NCI-H69和NCI-H82细胞混于血液，肺癌病人血液

PC3、DU145细胞混于血液LNCaP、MCF-7细胞混于血液

RT4、T24、J82、HT-1080、LNCaP、MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3细胞混于血液,转移癌症病人血液

UM-UC13细胞混于血液THP-1细胞PBS悬液

SK-N-MC、SK-N-AS、SK-N-SH,SHSY5Y、BE(2)-M17、MDA231、SW620、HEK293细胞混于血液MCF-7细胞混于血液，转移癌症病人血液THP-1细胞混于血液捕获效率/%

8097

参考文献[28][29]

parylene-C微柱薄膜双层Parylene微孔薄膜Parylene微孔薄膜

5～7滋m8滋m8滋m

约9086.5依5.3>90

[34][35][36]

间距不同的微柱“棘齿”型微柱阵列

PDMS微柱PDMS微柱PDMS微柱PDMS微柱

2～18滋m4～12滋m5～20滋m8～16滋m4～41滋m

7090-95-

[30][31][37][38][39]

-：文章中未提．2援2基于细胞力学性质差异2援2援1基于惯性力

近年来，有研究者利用惯性力与微流控芯片结合的惯性微流技术(inertialfocusing)进行CTCs分选，该方法的分离原理简述如下：当流体在直线型微通道内呈层流流动时，悬浮在其中的细胞会受到梯度剪切升力(shear-gradientliftforce)和管壁效应升力(walleffectliftforce)的作用，在二者的共同作用下，大小不同的细胞产生不同的流动特性，再结合不同的芯片内部结构设计，便可达到捕获CTCs的目的．Sollier等[40]设计了一种具有8联排并联管道、每条管道有8个储液囊的高通量分选芯片．样品流经芯片管道时，细胞受到管壁效应升力和梯度剪切升力共同作用，一旦细胞流经储液囊，管壁效应升力就会减弱，直径较大的肿瘤细胞受较大的梯度剪切升力远离管道中心分界线进入储液囊，直径较小的血细胞留在主流体中．该系统分离人乳腺癌细胞MCF-7和肺癌细胞A549掺入健康人血液样品的效率可达85%，作者还用该系统成功地从癌症病人的血液样本中分离出CTCs．2援2援2确定性侧向位移

基于确定性侧向位移法(deterministiclateral

displacement，DLD)设计的微流控芯片原理是芯片内具有相对于流体流动方向呈一定角度的微柱阵列，尺寸不同的颗粒在流动过程中具有不同的运动轨迹，尺寸大的颗粒会发生侧向位移向一侧汇聚，尺寸小的颗粒会按原轨迹运动，在芯片上设计相应的两个出口，即可收集到相应的细胞(图1b(E))．Morton等[41]和Davis等[42]的研究证明此方法适用于直径从30nm～100滋m范围内的颗粒分离；Loutherback等[43]第一次证明使用此方法可以在数分钟内分离CTCs．芯片整体尺寸为2.5mm宽、25mm长，微结构中三角柱边长58滋m、间距42滋m，排列与液流方向呈1/20弧度角．和圆形柱相比，三角柱更有利于防止堵塞．液体流过具有一定排列角度的微柱时，直径较大的肿瘤细胞会向芯片侧壁富集，随液体流出，通过收集侧壁出口处的液体，即可得到肿瘤细胞．该系统分离混有人乳腺癌细胞MCF-7的PBS悬液样品效率在85%以上．将MDA-MB-231细胞掺入健康人血液进行实验，捕获后的细胞可保持活性，可用于继续培养和实验分析．除以上提到的几种典型的分离方法之外，其他基于细胞力学性质差异捕获CTCs的微流控芯片整理于表3．

2015;42(4)吕晓庆,等：微流控芯片技术在循环肿瘤细胞分离中的研究进展

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生物化学与生物物理进展Prog.Biochem.Biophys.2015;42(4)

AdvancesinIsolatingCirculatingTumorCellsWithMicrofluidicChips*

L譈Xiao-Qing1),LILei2)**,CHENHong-Mei3),CHENPeng4)**,LIUJing2)

(1)ResearchCenterofBasicMedicalScience,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China;

2)

KeyLaboratoryofCryogenics,TechnicalInstituteofPhysicsandChemistry,ChineseAcademyofSciences&

BeijingKeyLaboratoryofCryo-BiomedicalEngineering,Beijing100190,China;

3)InstituteofSemiconductors,ChineseAcademyofSciences,Beijing100083,China;4)CenterforLungCancerDiagnosisandTreatment,TianjinMedicalUniversityCancerInstituteandHospital,Tianjin300060,China)

Circulatingtumorcells(CTCs)areshedbyprimaryormetastatictumors,undergotheAbstractepithelial-mesenchymaltransition,andenterintotheperipheralbloodofpatientswithmetastaticcancers.Itscriticalrolesincancerresearchandclinicaldiagnosticsaregraduallybeingrecognized.ThepresenceofCTCs,especiallythenumberinperipheralbloodcannotonlybeusedforearlydiagnosisofcancerbutalsobeusedtoassessprognosis,andmonitortumormetastasisandrecurrence.Microfluidicchipasahigh-throughput,miniaturizedcellexperimentalplatformhasbeenusedinCTCssorting.Inthisreview,wehighlightrecentprogressesofCTCscapturingofmicrofluidicchipsystemandfocusonthecapturetheory,chipstructureandcaptureefficiencyofvarioustypesofchips.Atlast,weprospectfortheapplicationforegroundofmicrofluidicchiptechnologyinCTCsisolation.Keywordsmicrofluidicchip,circulatingtumorcells(CTCs),tumormetastasis,cellsortingDOI:10.16476/j.pibb.2014.0309*ThisworkwassupportedbygrantsfromKeyResearchProgramoftheChineseAcademyofSciences(KJZD-EW-TZ-L03-6),NaturalScienceFoundationofTianjin(13JCYBJC23600),TheNationalNaturalScienceFoundationofChina(61078074)andChinaPostdoctoralScienceFoundation(2014M550794).**Correspondingauthor.LILei.Tel:86-10-82543766,E-mail:lileilei@mail.ipc.ac.cnCHENPeng.Tel:86-22-23340123,E-mail:chenpengdoc@sina.comReceived:February2,2015

Accepted:March5,2015

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/t5k.html