时间特异性基因敲除：技术、造模及现状和未来

中国组织工程研究 第20卷 第18期 2016–04–29出版

Chinese Journal of Tissue Engineering Research April 29, 2016 Vol.20, No.18

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·综述·

时间特异性基因敲除：技术、造模及现状和未来 陈瑞君，黄晓峰，张方明(首都医科大学附属北京友谊医院口腔科，北京市 100050)

引用本文：陈瑞君，黄晓峰，张方明. 时间特异性基因敲除：技术、造模及现状和未来[J].中国组织工程研究，2016，20(18):2725-2730. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.18.021 ORCID: 0000-0002-6850-0250(黄晓峰)

文章快速阅读：

时间特异性基因敲除的意义 通过对模型动物生长发育各 基因敲除技时间特异性基因敲除动物个时期的持续观察研究探索 术通过目标模型利用诱导剂人为控制目标基因在模型动物胚胎发 基因同源重基因敲除的时间，克服了传育阶段、幼年、成年和老年各 组代替原有统基因敲除动物缺乏出生个阶段的作用，使得基因功能 基因的方后或成年动物模型的缺陷，的研究更加系统完整，对基因 式，人为地并且能够与组织特异性基 因敲除技术相结合，对基因与发育缺陷和遗传疾病、后天 改变了细胞功能进行深入研究。获得性疾病的病因学研究，以 内的基因。 及慢性疾病和癌症的基因研 究具有重大意义。 文题释义： Cre/loxp系统：包括Cre重组酶和Loxp位点两个部分，Cre重组酶由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，由343个氨基酸组成，不仅具有催化活性，而且跟限制酶相似，识别特异的DNA序列，如loxp位点，引起重组。

基因敲除：是20世纪80年代发展起来的，是建立在基因同源重组技术基础以及胚胎干细胞技术基础上的一种新分子生物学技术。基因敲除通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的。基因敲除克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，近年来，牛、羊、猪、猴等大型哺乳动物实现了基因敲除。

摘要

背景：传统基因敲除技术不能在特定时间敲除目标基因，动物模型往往在胚胎发育时期或出生后死亡，限制了基因功能的研究。

目的：综述时间特异性基因敲除技术的研究现状。

方法：以“gene knockout，inducer，Cre/loxP system”为关键词检索建库至2014年8月PubMed数据库。从初检文献中排除重复实验和与研究目的无关的文献，通过分析结果对时间特异性基因敲除技术的研究做出总结。

结果与结论：大多数个体全部细胞基因敲除动物在出生后往往不能存活，它们因为某个重要基因缺失后胚胎早期产生严重生理性缺陷而死亡。因此，对于某个基因在特定时间的功能、生物个体在特定发育时间段内的遗传特征、以及某些获得性疾病在特定时间内的治疗等一系列问题，由于研究方法的局限性至今进展有限。而条件性基因敲除动物，尤其是时间特异性基因敲除动物的出现为这些领域的研究提供了研究模型。文章总结了近几年国内外关于时间特异性基因敲除动物的研究、发展及其应用，阐明特定基因的时间特异性基因敲除技术在科学研究领域的重大意义和广阔前景。 关键词：

实验动物；基因敲除；遗传；同源重组；位点特异性；Cre/loxP系统；诱导剂；动物模型；综述

主题词：

基因敲除技术；基因缺失；嵌合体；细胞分裂

ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 陈瑞君，女，1986年生，

甘肃省兰州市人，汉族，首都医科大学附属北京友谊医院口腔科在读硕士研究生，主要从事口腔发育生物学研究。

通讯作者：黄晓峰，博士，教授，主任医师，首都医科大学附属北京友谊医院口腔科，北京市 100050

中图分类号:R318 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2016)18-02725-06 稿件接受：2016-02-16 http://WWW.crter.org

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Chen Rui-jun, Studying for master’s degree, Department of Stomatology, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, Beijing 100050, China

Corresponding author: Huang Xiao-feng, D.D.S., Ph.D., Professor, Chief physician, Department of Stomatology, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, Beijing 100050, China

基金资助：

国家自然科学基金项目(81170943)，北京市自然科学基金项目(7162053)

Time-specific gene knockout technology: model establishment, present and future

Chen Rui-jun, Huang Xiao-feng, Zhang Fang-ming (Department of Stomatology, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, Beijing 100050, China)

Abstract

BACKGROUND: The target gene cannot be deleted at specific time by using conditional gene knockout system. Most gene knockout animals cannot survive during embryonic development and after birth, which limits the study of gene function.

OBJECTIVE: To review the recent advances about time-specific gene knockout technology.

METHODS: An online search in PubMed was performed from the initial stage of database establishment to August 2014. The key words were gene knockout, inducer and Cre/loxP system. The repeated experiment and unrelated articles were excluded during primary search. A summary was made by analyzing time-specific gene knockout technology.

RESULTS AND CONCLUTION: Most important gene knockout animals could not survive after birth, or die at early embryonic stage due to serious physical defects induced by an important gene deletion. Therefore, the progress in the functionality of a gene at a particular time, the genetic characteristics of an individual organism in a particular developmental period, and the treatment of certain acquired disease at a given time have been limited because of the limitations of research methods. However, the occurrence of

conditional gene knockout animals, especially time-specific knockout animals, provides a research model for the study of these areas. This study reviewed the recent advances, development and application about time-specific gene knockout animals, and discussed the significance and broad prospects of time-specific gene knockout technology of specific genes in the field of scientific research.

Subject headings: Gene Knockout Techniques; Gene Deletion; Chimera; Cell Division

Funding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81170943; the Natural Science Foundation of Beijing City, No. 7162053

Cite this article: Chen RJ, Huang XF, Zhang FM. Time-specific gene knockout technology: model establishment, present and future. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(18):2725-2730.

0 引言 Introduction

基因敲除是建立在基因同源重组和胚胎干细胞基础之上的分子生物学技术。基因敲除技术通过目标基因同源重组代替原有基因的方式，人为地改变了细胞内的基因[1-11]。这项技术的发展为发育生物学、遗传疾病的机制和治疗的研究开辟了崭新的研究方向。随着对基因结构认识的逐步加深，学者们对遗传物质的兴趣逐渐倾向于基因功能的研究，而基因敲除技术是研究基因功能的重要方法。历经了近30年的发展，基因敲除技术不断深入，尤其是位点和时间特异性基因敲除系统的建立，使得基因的功能在时间和空间维度上能够更加准确地被人为控制。

检索数据库：Pubmed(http://www.ncbi.nlm.nih.

gov/pubmed)。

英文检索词：gene knockout，Cre/loxP system，

induce,homologous recombination。

检索文献类型：研究原著、综述。

1.2 入选标准

纳入标准：①关于基因敲除、Cre/loxP系统的研

究结果报道。②同一领域选择权威期刊或被引用次数多者。

排除标准：重复性实验。

1.3 质量评估 通过检索数据库获得相关文献233篇，去除重复后获得文献101篇，通过阅读题目和摘要初筛，排除与实验目的无关的、陈旧的文献以及重复实验，阅读全文复筛后获得文献60篇。文献[1-22]介绍传统基因敲除技术背景知识，文献[23-44]主要论述了组织特异性基因敲除技术的特点及其应用，文献[45-56]总结了时间特异性基因敲除技术的研究现状和存在问题，文献[57-60]介绍了基因敲除技术的一些

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1 资料和方法 Data and methods

1.1 资料来源

检索人：第一作者。 检索时间：2014年9月。

检索文献时限：建库至2014年8月。

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陈瑞君，等. 时间特异性基因敲除：技术、造模及现状和未来 新进展。

2 结果 Results

2.1 基因敲除技术 基因敲除技术通过改变目标基因来研究基因的功能。研究者通过观察对比基因敲除生物和正常生物之间的差异，从而研究基因在个体发育、疾病、再生等过程中的功能[12-14]。同源重组是基因敲除技术的理论基础，在正常细胞分裂过程中，同源重组的发生率很高。人为构建与靶基因有极强相似性的细菌染色体[15-17]、经过标记的质粒或其他DNA结构作为载体[18]，将载体通过电穿孔法引入胚胎干细胞[19]，由于载体和靶基因的高度相似，在细胞分裂过程中产生同源重组现象，人工鉴别并分离出这些发生同源重组的胚胎干细胞，并且通过显微注射或胚胎融合等方法将这些胚胎干细胞导入受体动物早期胚胎中[20-21]。这些经过基因修饰的胚胎干细胞有可能发育成嵌合体动物的生殖细胞，经过修饰的遗传信息也会随之遗传给后代。嵌合体动物与野生型动物杂交后产生第一代拥有基因突变的杂合动物，这些杂合动物的后代会有一定概率产生纯合子动物，经过鉴定和功能评价，并能稳定培育后代，确定基因敲除动物[22]。

为了研究不同组织中特定基因的功能，传统的所有体细胞基因敲除技术有一定的局限性，这就需要控制特定组织中特定基因的表达。Tsien等[23]在1996年培养出了第一例组织特异性基因敲除动物，这也是第一次报道条件性基因敲除技术。这项技术的基础是Cre/loxP系统，Cre(源于大肠杆菌噬菌体P1的位点特异性重组酶)基因能够诱导Cre重组酶的表达，Cre重组酶的表达实现了组织或细胞特异性基因敲除[24-32]。近几年这项技术被广泛应用于疾病相关的基因功能研究、遗传性疾病的基因学研究以及基因在组织或器官发育过程中的作用[33-44]。

个体所有细胞和组织特异性基因敲除技术可以研究某基因在个体发育过程中的作用，但是重要基因敲除的动物往往在胚胎发育阶段死亡，胚胎后期以及出生后的个体该基因的功能就不能在这些基因敲除模型上进行研究。事实上，缺乏出生后的基因敲除动物模型使研究基因与疾病的关系变得困难。因为同一基因在不同时期，特别是出生后和胚胎发育中的功能可能是不同的。因此，与时间相关的基因敲除动物模型就比较重要。

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2.2 时间特异性基因敲除动物 时间特异性基因敲除动物是Shimizu等[45]在2000年首先报道的。它克服了传统基因敲除技术不能在需要的时间内剔除特定基因的限制，培养出成年基因敲除动物模型[46-48]，并且可以和组织特异性基因敲除技术结合将靶基因的失活局限在某一种特定的细胞和组织中，这样就可以对目标基因在动物不同发育时期的功能进行全面研究[49-53]。

时间特异性基因敲除技术同样以Cre/loxP系统为基础，通过诱导剂来控制Cre的时间表达，达到时间诱导。在Cre/loxP小鼠体内，Cre基因在特定时间被诱导表达以激活Cre重组酶。目前应用于时间特异性基因敲除动物模型的诱导剂大都通过与四环素抑制子(tet，来源于大肠杆菌E.coliTn10转位子)相互作用完成诱导过程。在没有四环素类药物诱导时，四环素控制的转录激活蛋白(tetracycline-controled transactivator，tTA)与tet 操纵子(teto)结合，下游基因发生转录；有四环素时这种结合消失，下游基因不能转录。而逆向四环素转录激活蛋白(reverse tetracycline-controled transactivator，rtTA)的功能则与此相反，在四环素诱导下，rtTA与teto结合，下游基因出现转录活性；无四环素类药物时rtTA不能与teto结合，故无转录活性[54](图1)。

图1

时间特异性基因敲除模式图

图注：四环素 (Tet)作为诱导剂与逆向四环素转录激活子(rtTA)

结合后， rtTA激活四环素操纵子(tetO),使得下游Cre基因表达。Cre基因表达产生的 Cre重组酶介导靶基因两侧的loxP位点间产生切除效应，

将靶基因切除，从而达到时间特异性基因敲除。

在理论上，时间特异性基因敲除技术是比较成功的，但是在实际应用过程中，如何通过四环素类药物高效地控制基因敲除的起止时间是问题的关键。Perl

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陈瑞君，等. 时间特异性基因敲除：技术、造模及现状和未来 等[55]给怀孕的转基因母鼠在不同时间喂饲含有强力霉素的食物或水可以成功地构造时间特异性基因敲除小鼠模型，但是给出生后的转基因小鼠喂饲强力霉素却几乎不能诱导基因敲除，给成年鼠喂饲3周强力霉素同样也很难发现目标基因的表达变化。然而，Xie等[56]给出生后的小鼠，无论是哺乳期还是断奶后的小鼠，喂饲强力霉素，都会诱导基因敲除，并且可以看到基因敲除后的表现型变化，在停用强力霉素两三天后，这种诱导效果消失了。之所以会产生这种不同的诱导效果，可能与Cre重组酶的活性、rtTAmRNA的稳定性和四环素类药物的药效学等因素有关。

时间特异性基因敲除技术的另一个重要问题是提供诱导剂后何时会产生有效的基因敲除，即确定基因敲除的时间。在Perl等[55]的实验中，喂饲强力霉素48 h后Cre很容易在所有的上皮细胞中被发现，其分布与Cre的mRNA一致。Cre的mRNA和蛋白质的广泛表达在去除强力霉素后48 h急剧减少，96 h后几乎消失。这提示基因的时间性诱导和停止发生在48 h左右。Kistner等报道了诱导剂强力霉素，在该系统中，动物饮用强力霉素水后迅速诱导荧光素酶报告基因的表达，其活性在前4 h就以指数速度增长，喂饲24 h后观察，大多数器官诱导完全[54]。因此不同研究的结果并不一致。

同时，时间特异性诱导基因敲除的结果不只是存在“有”或“无”的极端状态，其效果是逐渐产生的。在Perl等[55]的实验中，E(embryonic day)6.5-13.5和E6.5-PN(postnatal day)7.0连续喂饲强力霉素，在被诱导细胞中可以发现AP染色和绿色荧光蛋白荧光标记，提示基因被敲除。有趣的是，每2 d观察这些荧光标记可以发现，E0-2.5呈斑驳状并局限于组织周边，E2.5-4.5范围扩大，E4.5-6.5和E6.5-8.5被完全标记。因此，诱导剂产生的基因敲除结果是逐渐产生的。那么确定何时进行基因功能的研究就需要谨慎，四环素类药物的药效学和诱导的有效性需要充分考虑。

尽管目前已经开始使用时间特异性基因敲除动物进行科学研究，但是，这项技术目前还不是十分稳定。这种不稳定通常表现为不同谱系的动物之间甚至同窝出生的仔鼠之间具有差异性，以及基因敲除不彻底。原因可能与靶器官的组织差异性、Cre重组酶的活性与表达时间、四环素类药物的药效学、loxP在染色体上的位臵等因素有关[56]。这有待于今后优化rtTA对诱导剂的敏感性，以及进一步的深入

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研究。

3 展望 Prospects

基因敲除是转基因技术的一个分支技术，条件性基因敲除技术的成功为特定组织和特定时间敲除特定基因，从而更好地研究目标基因在不同时间，不同组织中的功能，以及RNA与蛋白质之间相互作用的探索奠定了动物模型的基础[57-59]。Chaiyachati等[60]报道了利用他莫昔芬进行基因敲除后反转，为基因敲除的应用提供了更多选择。各种条件性基因敲除技术的发展和应用，必然会为研究人类遗传机制提供新工具，带来生命科学和医学科学领域的进一步发展。

作者贡献：第一作者搜集资料，分析文献，通讯作者与第一作者共同完成对本文的撰写。

利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。 伦理问题：文章没有与伦理道德冲突的内容。 文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。

文章外审：本刊实行双盲外审制度，文章经国内小同行外审专家审核，符合本刊发稿宗旨。

作者声明：文章第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。

文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。

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