mirRNA引物设计2
更新时间:2023-10-05 11:48:01 阅读量:1 综合文库 文档下载
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miRNA常用实验方法;一、miRNA的检测方法;miRNA的realtime-PCR检测方法;1、realtime-PCR引物设计;miRNArealtime-PCR引物设计方法:;1)stem-loopRT引物设计:基于通用的茎;GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG;2)realtime上游引物设计:miRNA序列;3)下游引物是通用的,序列miRNA常用实验方法
一、 miRNA的检测方法 miRNA的realtime-PCR检测方法 1、 realtime-PCR引物设计
miRNA realtime-PCR引物设计方法:
1)stem-loop RT引物设计:基于通用的茎环结构,只需要按照不同的miRNA序列修改最末端
6
个碱基即可。通用茎环结构序列为:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC 例如设计miR-1(UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU)的RT引物,只需在通用茎环序列后架上miRNA3’末端的6个碱基的反向互补序列,即
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATACAT 2)realtime 上游引物设计:miRNA序列除去3’端6个碱基的剩余部分作为上游引物,如miR-1的上游引物为(注意把U改为T):TGGAATGTAAAGAAGT.检查引物的Tm值(一般参考DNAMAN),如果Tm值较低,则在5’端加GC使Tm值接近60度。因此miR-1的上游引物可设计为:GCGCTGGAATGTAAAGAAGT,61.4度。
3)下游引物是通用的,序列为GTGCAGGGTCCGAGGT。
4)引物设计好后,需要通过预试验检测引物的特异性。一般需要做溶解曲线来检测引物的特异性;同时最好将PCR产物进行电泳检测产物是否单一(因产物长度很小,需要3%以上的琼脂糖胶)。 2、 miRNA反转录
miRNA的反转录与一般基因的反转录过程基本相同。因为其产物很短,用最普通的逆转录酶即可。我们一般使用的是TIANGEN的MLV,逆转录体系为: RNA 500ng~2ug 5xbuffer 2ul dNTP 0.25ul
DDT 0.25ul RRI 0.25ul MLV 0.25ul RT primer 0.5ul
H2O(RNase free) 补至10ul
程序为(PCR仪中通常命名为CTFRT)16度,30min;42度,60min;85度,5min;4度,hold。 !!做miRNA的反转录时,注意不要忘记内参的RT,即一个样品至少要做目的miRNA和内参两管反转录反应。 3、 realtime-PCR实验
miRNA逆转录完成后得到的cDNA即可进行下一步PCR。在确认引物的特异性后,我们可以进行正式实验。一般每个样品至少需要3个平行孔。Realtime PCR体系为(ABI定量PCR仪 需要加ROX dye II, Biorad 定量PCR仪不需要加ROX): 2X SYBR 10 ul
ROX II 0.4ul (Biorad 不加) Primer 1ul Template 1ul
H2O 7.6ul (Biorad 8ul)
需要注意的几点:1)在配制PCR体系时,请一定配制总体系,逐步分装。每步分装前充分混匀。这一点是PCR平行性的保证。2)配制体系尽量在冰上进行。3)请选用比较准确的枪进行体系配制,并注意体系的冗余。一般来说,配制一整个96孔板的PCR体系,我会配制100个反应的总量,保证分装到最后稍有剩余。
PCR 程序:95度,1min;95度,5s;60度,34s(此步在读取荧光值)。40到45个循环。
4、realtime PCR结果分析
realtime PCR反应结束后返回Ct值,可以利用定量PCR仪软件自带的程序进行分析,也可以利用EXCEL表格进行相对定量计算。具体的计算方法:将三个平行孔的数值拷入到EXCEL表格的相应位置,即可自动计算出相对值。注意,第
一组样品的值将被默认为归一为1。其他的样品与之相比得出相对值。EXCEL表格公式见附件。 二、 miRNA靶基因的预测 miRNA靶基因预测软件简介
1、 TargetScan:http://www.targetscan.org/
首先选择预测的物种,如果要预测小鼠的miRNA和靶基因,则点击右上角的“ Go to
TargetScanMouse”。第二个选项可输入基因名(有时不识别别名),点击submit即可,此操作可预测可能靶向该靶基因的miRNA;或者输入miRNA的名字,点击submit,此操作可以预测该miRNA的靶基因。 2、 Pictar:http://pictar.bio.nyu.edu/
输入网址后进入pictar主页,下面有几个可选用的数据库,一般选用最后两个数据库即可。点击进入预测界面。选择物种,选择要预测的miRNA(注意:如果你感兴趣的miRNA在下拉菜单中未列出,则不可预测,可考虑换用其他软件)并点击search for targets of a miRNA或输入gene ID(注意:与targetscan不同,pictar一般不识别基因名,最好输入gene号:NM_*****)点击search for all miRNAs predicted to target a gene.进行预测。
3、 Mirbase:http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/cgi-bin/targets/v5/search.pl 分别输入miRNA名或基因名即可进行预测。其他选项不用更改。 预测结果的处理和分析
我们通常会将三种不同软件的分析结果做比较,选取两种以上软件预测的交集部分作为我们候选的靶基因。如果这样的结果仍然过多,可以选取三种软件预测的交集进行下一步筛选。如果三种软件预测的结果没有交集部分,可以取并集,然后从中按功能提示进行挑选。 三、 miRNA的过表达和敲低 1、 过表达
过表达miRNA一般可采用两种方法:a 构建过表达载体;b 人工合成成熟miRNA。 a 构建过表达载体 1)获取
miRNA
基因的序列及旁侧序列
进入
Ensembl(http://www.ensembl.org/index.html)主页。
输入miRNA名,点击进入。在export data页面上选择输入5’flanking sequence和3’flanking sequence 分别为200bp(见下图),然后点击next即可得到包括前体和左右侧翼200bp的序列。
2)基于这段序列,我们可以设计该miRNA的表达序列。引物设计原则:扩增产物包括前体,并左右各有至少70bp的侧翼序列,长度一般在200bp-500bp。其他同一般引物设计。载体可以选用任意使用RNA polII识别的启动子的载体,包括T7,CMV等。常用的是pcDNA3.1,不要带标签的。注意:如果miRNA位于cluster中,则扩增长度要控制,避免同时包括两个或两个以上的miRNA。完成表达载体的克隆并测序确认后,转入到细胞中进行表达检测。如果目的miRNA的表达明确,则载体构建完成。
b合成成熟的miRNA序列查出miRNA的准确序;2、敲低;目前做内源性miRNA的敲低一般使用人工合成的m;报告基因实验方法;一、miRNA靶基因筛选;荧光素酶报告基因实验;1、荧光素酶报告基因质粒的构建;载体质粒为经过改造的pcDNA3.1,其图谱见下;NotI.;XhoI;XbaI;靶基因3’UTR的获得;2、荧光素酶实验;构建好荧光素酶报告基因实验后
b 合成成熟的miRNA序列 查出miRNA的准确序列,请公司合成成熟的序列。常用的公司有:上海吉凯;invitrogen等。
2、 敲低
目前做内源性miRNA的敲低一般使用人工合成的miRNA的反义链,即成熟miRNA的序列的反义互补序列。如mir-x 序列为 UCACACAACCCACCACCAUUG,则其inhibitor 序列为CAAUGGUGGUGGGUUGUGUGA. 将该序列送交公司合成即可。
报告基因实验方法 一、 miRNA靶基因筛选
荧光素酶报告基因实验
1、荧光素酶报告基因质粒的构建
载体质粒为经过改造的pcDNA3.1,其图谱见下图。可用的酶切位点为NotI,XhoI及XbaI. 推荐优先使用XhoI和XbaI两个酶切位点。如过不能用,可用
NotI. XhoI XbaI
靶基因3’UTR的获得。3’UTR序列是指从Mrnaz终止密码子后的第一个碱基开始到mRNA最后一个碱基(通常是polyA结尾)。模板可采用相应物种的cDNA或基因组。在选择模板时要注意:一般来讲,cDNA适于所有的3’UTR扩增,但有时3’端AT过多导致引物设计困难时,可以考虑用基因组做模板。但是基因组做模板的前提是靶基因3’UTR由一个外显子组成。相关信息可以从ensembl中查阅外显子信息可以知道。一般尽可能全面的扩增3’UTR,但如果3’UTR过长或引物设计困难,可以选取包括miRNA结合位点的一段3’UTR。引物设计的原则同一般引物设计。
2、荧光素酶实验
构建好荧光素酶报告基因实验后,准备开始做报告基因实验前,你还需要准备以下材料:1)TK质粒,作为共转染的内参。2)miRNA的过表达质粒或合成的miRNA。质粒的浓度尽量在500ng/ul以上,合成的miRNA稀释到20uM。3)状态良好的细胞。
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