黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钠实习报告 - 图文

目录

1前言 ................................................................................................................................ 2

1.1 葡萄糖酸钠概述 .............................................................................................. 2 1.2 葡萄糖酸钠的制备工艺 .................................................................................. 4 1.3 制备方法的比较 .............................................................................................. 6 1.4 葡萄糖酸钠的发展史 ...................................................................................... 6 2实验材料 ........................................................................................................................ 7

2.1菌种 ..................................................................................................................... 7 2.2培养基 ................................................................................................................. 7 2.3主要试剂 ............................................................................................................. 8 2.4主要仪器 ............................................................................................................. 8 3 试验方法 ..................................................................................................................... 8

3.1 发酵培养 .......................................................................................................... 8 3.2 检测 .................................................................................................................. 8

3.2.1 DNS测定总糖和还原糖 ....................................................................... 8 3.2.2 氨基氮的测定 ....................................................................................... 10 3.2.3 菌浓测定：离心体积和干重 ............................................................... 11 3.2.4 葡萄糖酸钠含量的测定 ....................................................................... 11

4实验结果与讨论 .......................................................................................................... 12

4.1 葡萄糖含量 .................................................................................................... 12 4.2 总糖和还原糖含量 ........................................................................................ 12 4.3 氨基氮 ............................................................................................................ 13 4.4 葡萄糖酸钠 .................................................................................................... 14 4.5 菌体浓度的测定 ............................................................................................ 15 4.6 菌体生长情况 ................................................................................................ 15

4.7 在线检测 ........................................................................................................ 16 5 展望 ............................................................................................................................. 19

1前言

1.1 葡萄糖酸钠概述

葡萄糖酸钠又称五羟基己酸钠，是一种白色或淡黄色结晶粉末，易溶于水，微溶于醇，不溶于醚。其分子式为C6H11O7Na ，相对分子质量为218.14。葡萄糖酸钠是葡萄糖的深加工产品，也是制备葡萄糖酸内酯、葡萄糖酸盐(锌、铜、亚铁盐) 等的基础原料。该产品热稳定性好，无潮解性，由于其优良的螯合性能而被广泛用于水质处理、电镀、金属与非金属的表面清洗及水泥生产等多种工业部门，在化工、食品、医药、轻工等行业有着广泛的用途。工业级的葡萄糖酸钠是建筑工业上混凝土的塑化剂，食品级的葡萄糖酸可作为食品行业的酸味剂。另外葡萄糖酸钠的毒性和腐蚀性极小，能与某些二价或三价金属离子形成水溶性络合物，因此在医疗和化工行业作为清洗剂被利用。美国及日本等国在20世纪50年代就开始工业化生产，我国自1955年由轻工业部上海工业试验所试制葡萄糖酸成功后发展迅速，目前全国已有几十家葡糖酸。葡萄糖酸钠的主要用途有：

用作钢铁表面清洗剂

钢铁表面如需要镀钵、镀铬、镀锡、镀镍以适应特殊用途时，如制造马口铁，镀锌板，表面镀铬（电度）等，其钢坯表面均需经过严格清洗，使镀层物与钢铁表面牢固结合，这时候其清洗药剂中添加葡萄糖酸钠将会达到十分理想的效果。这一点已经被国际上制造马口铁的大公司所证实。

用作水泥掺合剂

水泥中添加一定数量葡萄糖酸钠后，可增加混凝土的可塑性和强度，且有阻滞作用，即推迟混凝土的最初与最终凝固时期，例如添加0.15%的葡萄糖酸钠，可将 混凝土的初凝 固时间延长10倍以上，也就是将混凝土的可塑时间从几小时延长至几天，而不影响其牢 度。可塑性与延缓最初凝固时间在混凝土作业中是非常重要的问题，如在高温度季节施工及大型的工程作业中，延缓最初凝固时间则是个难题，葡萄糖酸钠可圆满解 决这个问题。另外高温时胶接油井是比较困难的，添加了葡萄糖酸钠后的混凝土在170℃高温下，在几个小时内可塑，因此也能圆满解决上述问题。因此葡萄糖酸 钠作为水泥掺合剂在国外已大量应用于重要的建筑工程，如中东的大量桥梁工程中。但是我们国内在这方面应用也还

未推广应用，据说有在造纸废水中提炼纤维素磺 酸钠，其效果与葡萄糖酸钠根本是不可相提并论的。

此外还可在电镀，胶卷制造工业中应用

作为一种多羟基羧酸型优良的缓蚀阻垢剂葡萄糖酸钠，由于具有上述诸多特异性质，如能在应用技术上肯下功夫，必将会被开发成一个很大的产业。

葡萄糖酸钠在建筑工业中的应用

混凝土是一种组合物料，由水泥、集料、掺合剂和水制成。混凝土是所有人工制造的物料中最大量的。混凝土中四分之三是集料，然而在混凝土中最具活性的成分是 水泥浆。混凝土的性质和性能主要决定于水泥浆的性质。混凝土中的掺合剂能提供一些有益的作用如加速凝固，延缓凝固，使空气成气泡状存在，减少用水量和增加 塑性等等。通常在水泥中同时使用数种掺合剂，各种不同的掺合剂在一些应用中能互相强化。葡萄糖酸钠可以作为掺合剂用在混凝土中，它在混凝土中的功能如下：减水剂和缓凝剂葡萄糖酸钠一般是单独使用，但是也可以与其它缓凝剂如碳水化合物和磷酸盐配合起来使用。葡萄糖酸钠是一种结晶的粉末。是在妥善规定和控制的条件下生产出来的。此化合物是化学纯的并且无腐蚀性。质量是恒定的。这些特点能保证它在应用中有可靠的和重复性的结果。

葡萄糖酸钠作为减水剂

通过加入减水剂，水对水泥比（W/C）能够减小。 通过加入葡萄糖酸钠能够获得如下的效果： 1、 增进工作性 在水对水泥比（W/C）不变的情况下，加入葡萄糖酸钠能增进工作性。这时，葡萄糖酸钠是起增塑剂的作用。在葡萄糖酸钠加量在0.1%以下时，其改进工作性 的程度与加入量成正比。 2、 增进强度 当水泥含量保持不变而混凝土中的水含量可降低（即W/C降低）。当葡萄糖酸钠的加入量为0.1%时，加水量可减少10%。 3、 降低水泥含量 水和水泥含量以同比例降低，W/C比保持不变。此时，葡萄糖酸钠作为水泥减量剂。 一般情况下，下列两方面对混凝土的性能说很为重要：收缩和产生热量。

葡萄糖酸钠作为缓凝剂

葡萄糖酸钠能够显著延缓混凝土的起始的和终了的凝固时间。在用量为0.15%以下时，起始凝固时间的对数与配加量成正比例关系，即配加量加一倍，起始凝固 的时间延迟到十倍，这就使能工作的时间从很少几个小时延长到几天而无损于强度。 特别是在热天和需要放置的时间较长时，这是一项重要的优点。

用作玻璃瓶专用清洗剂

饮料工业，食品工业，酿造工业的日数以亿万计的玻璃瓶，如汽水瓶，啤酒瓶，牛奶瓶，罐头瓶，酱油瓶，酒瓶等，其清洗工作是一项十分重要的事情，清洗剂的药 剂配方是一项难度较高的技术工作。目前国内尚未出现一种比较理想的药剂。主要存在问题有：去垢力不强，易堵塞洗瓶机的喷咀及管路；对瓶贴及瓶颈铁锈去染力 不理想；洗后微量残留物对食用安全性不理想（如磷酸盐残留）；洗涤水排放成公害（不能符合国家规定之标准）。如在其玻璃瓶清洗剂的药剂配方中改用葡萄糖酸 钠为主体，则上述问题均能迎刃而解。（八十年代已在上海汽水厂，上海啤酒厂做大型试验，有鉴定证明）这方面的应用国内尚未开发，若形成市场，潜力很大。

用作水质稳定剂

由于葡萄糖酸钠具有优异的缓蚀阻垢作用，所以被广泛用于水质稳定剂，例如作为石油化工企业循环冷却水系统，低压锅炉，内燃机冷却水系统等处理药剂。因为它 有以下特异优点： ⑴具有明显的协调效应。适用于钼、硅、磷、钨、亚硝酸盐等配方，由于协调效应影响，缓蚀效果大大提高。 ⑵缓蚀率随温度升高而增加。一般缓蚀剂随着温度升高而缓蚀率下降，甚至完全失去作用。但葡萄糖酸钠恰恰相反，缓蚀率在一定范围内随温度升高而提高，例如对 炭钢等材质的试验中，温度从77℃F于上升到120℃F，其缓冲率平均提高5%以上。所以葡萄糖酸钠这种奇异的特性，对较高温度的体系或从低温到高温的变 温体系 ，作缓蚀剂使用 是十分理想。 ⑶阻垢能力强：对钙，镁，铁盐具有很强的络合能力，所以阻垢能力很强，特别对Fe3+有极好的螯合作用，甚至在全PH范围内部有作用。 ⑷灭公害。使用葡萄糖酸钠作为循环冷却水缓蚀阻垢剂，达到灭公害，这是目前所使用的其他缓蚀阻垢剂无法比拟的优点。

用于医药方面

调节人体内酸碱平衡，以恢复神经正常作用，亦可基于同样目的， 用于食品添加剂。

1.2 葡萄糖酸钠的制备工艺

目前葡萄糖酸钠的生产方法主要有生物发酵法、相化学氧化法、 电解氧化法、 多相催化氧化法。

生物发酵法

该方法包括真菌发酵和细菌发酵，另外还有固定细胞发酵工艺， 其中较普遍采用的是黑曲霉菌发酵制葡萄糖酸钠工艺。

该方法是在240-300g/L 的葡萄糖溶液中加入一定量的营养物质，灭菌，冷却至适宜温度，接种体积分数为10%的黑曲霉种子液，开动搅拌，通气流，调整发鞘夜pH值维持在6.0 - 6.5，温度保持在32 - 34OC 。发酵过程中滴加消泡剂，以消除发酵过程中所产生的泡沫。 整个发酵过程约需20h，当残糖降至1g/L时可以认为发酵结束。菌体与发酵液分离后，发酵液经真空浓缩、结晶可得葡萄糖酸钠晶体， 或经喷雾干燥后制得葡萄糖酸钠粉状产品。该方法具有发酵速度快、 发酵过程易于控制、产品易提取等特点，但同时也有一定缺陷，如产品色泽不易控制、无菌化要求程度高等。

均相化学氧化法

结晶葡萄糖加水溶解后加入催化剂，控制一定的温度，滴加次氯酸钠溶液， 同时滴加离子膜液碱来控制反应体系的p H 值，使平衡向生成葡萄糖酸钠的方向移动。通过测定残糖量来确定反应终点，然后过滤，将反应液浓缩，利用氯化钠溶解度比葡萄糖酸钠溶解度低的特性，浓缩后先析出氯化钠，后析出葡萄糖酸钠来进行提纯，可得葡萄糖酸钠含量在95%( 质量分数)以上的产品。

采用次氯酸钠氧化法生产葡萄糖酸钠具有转化率高、工艺过程简单、成本低的优点，但是其中间步骤多，副产物多，产物难于分离， 因此在应用上受到了限制。

高树桐等在国外改进的次氯酸钠氧化法的基础上，又进行了改进，提高了物料浓度并在室温进行反应，具备了工业化生产的条件。于1989年10月在石家庄东华化工厂建成了100t/a中试装置，收率在90%左右。但是副产物氯化钠混在产品中，不易分离。为此必须将氧化后的反应液用酸酸化，使生成的葡萄糖酸钠转化为内酷，蒸出水后再用有机溶剂萃取，使氯化钠与内醋分离，然后再用碱中和，使内醋转化为葡萄糖酸钠。流程繁琐，成本较高。

电解氧化法

该方法是在电解槽中加入一定浓度的葡萄糖溶液，再加入适宜的电解质，在一定温度、一定电流密度下恒电流电解。其工业参数的确定因加入电解质的不同而异。例如，以溴化钠为电解质时， 葡萄糖浓度为23.5%(质量分数)温度控制在40℃，电流密度为1 A .dm-2 ， 电解质浓度为2%(质量分数)，电解过程中碳酸钠可一次性加入。电解结束后电解液经浓缩、结晶，可得葡萄糖酸钠晶体。

电解氧化法虽然克服了生物发酵法和均相化学氧化法的某些缺点，但在工业生产中能耗大，不易控制，因此工业化生产中很少采用。

多相催化氧化法

配制一定量的葡萄糖溶液加入于四口 烧瓶中， 称取适量催化剂加入到此烧瓶中，恒温。向溶液中通入空气，并不断滴加一定浓度的NaOH 溶液来维持一定的pH值。反应后的溶液经冷却、抽滤（催化剂回收)，滤液减压蒸馏浓缩、结晶，风干后得到葡萄糖酸钠晶体。

该法工艺简单，反应平稳，易于控制，反应条件温和，其葡萄糖转化率在95%左右。缺点是所用催化剂在循环使用一定次数后，催化效率下降，使葡萄糖转化率降低，反应时间延长甚至基本无催化活性， 催化剂必须报废更新，相应提高了单位产品催化剂耗量，也使葡萄糖酸钠产品生产成本较高。由此可见，催化剂性能的好坏是使用此法的关键。催化氧化法还是目前国内葡萄糖酸钠生产的主要方法，其产量占到80%以上。 1.3 制备方法的比较

葡萄糖氧化制备葡萄糖酸钠的4 种方法，目前在中国均有广泛研究。在工业化生产上，生物发酵法和多相催化氧化法应用较多。其中多相催化氧化法具有工艺过程简单、反应条件温和(各种气-液-固三相混合的反应器在常压均可采用，反应温度一般控制在60 ℃以下)反应时间短、转化率高、三废少且易处理的特点，此法关键是催化剂的性能及循环使用的次数。只要选择合适的催化剂体系，通过催化剂多次套用，克服贵重金属价格昂贵和催化剂失活的缺点，多相催化氧化法将具有较大的优越性和应用潜力。

葡萄糖酸钠生产作为一种传统行业，其主要生产方法有发酵法，电解氧化法及催化氧化法。其中发酵法有真菌发酵法，细菌发酵法，细菌发酵以及固定细胞发酵法等。目前行业中普遍采用的是采用的是黑曲霉发酵制葡萄糖酸钠的工艺。葡萄糖酸钠由葡萄糖经葡萄糖糖化酶催化生成葡萄糖酸再经氢氧化钠中和生成。生产过程中多采用黑曲霉，以葡萄糖为底物进行发酵生产。从化学反应方程式来看在合成途径中生成一分子FADH2，FADH2在呼吸链中以氧为受体被氧化。在葡萄糖酸快速合成的过程中需要氧的供给。 1.4 葡萄糖酸钠的发展史

葡萄糖酸钠行业作为新兴产业，发展迅猛，有报道称：2003-2009年国内葡萄糖酸钠行业的产量保持了33.14%的复合增长率，中国已成为全球重要的生产国和出口国。中国目前有超过四十家葡萄糖酸钠生产企业，大部分分布在玉米主产区，主要产地分布在山东、浙江、河南、湖北、广东、江苏、 江西、 安徽等地。年总产能超过60万吨 ，不包括广东、浙江等南方地区葡萄糖酸钠水剂产品，

如计算在内将会超过70万吨。仅山东就超过7家，全部采用发酵法生产，总产能超过40万吨，浙江也超过7家，少数采用发酵法生产，总产能超过10万吨左右。 其他省份生产厂家较少，规模小，大多采用多相催化氧化法，以生产水剂产品为主。

微生物发酵法生产葡萄糖酸钠在我国发展于 60年代，当时上海微生物研究 所上了我国第一家微生物生产该产品技术，当时主要是作为口服葡萄糖酸钙等食品级产品生产；1955年轻工业部上海工业是实验所陈陶等选出黑曲霉360，以葡萄糖为碳源转化率88.5%，以后山东新华制药厂投入工业化生产；60年代江苏大丰、浙江温州、江西赣南、浙江仙居也陆续投产；1992年上海工业微生物所孙智凤等高糖发酵葡萄糖酸中试成功[19]。进入21世纪初，产品应用研究很活跃，应用效果十分显著。2005年5月，青岛科海改造衣康酸生产线，以淀粉原料采用发酵工艺单效蒸发装置生产2万吨葡萄糖酸钠；2006年10月，山东凯翔与山东省食品发酵工业研究设计院合作采用发酵工艺和多效蒸发技术建成3万吨葡萄糖酸钠生产线，2010年扩至5万吨，蒸发技术已申请国家专利并获授权，技术指标和质量指标处于国内领先水平；2007年济南华明采用发酵法投产2万吨生产线；2009年开始西王集团在赖氨酸生产线上改建20万吨葡萄糖酸钠；2010--2011年德州福洋、兖州百盛相继投产5万吨葡萄糖酸钠生产线 。这一时期内，其他省份，发酵法上马葡萄糖酸钠的企业极少。至此，山东省内以淀粉、淀粉乳为原料发酵法生产葡萄糖酸钠的总产能超过40 万吨，占全国产量的半壁江山。

为了对黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钠进行过程放大，本实验在50 L发酵罐中以黑曲霉作为菌种发酵生产葡萄糖酸钠。 2实验材料 2.1菌种

黑曲霉 Aspergillus niger 2.2培养基

发酵培养基 （25 L）：玉米粉糖化液 140 g/l，玉米浆 1.2g/l， KH2PO4 0.3 g/l， (NH4)2HPO4 1.0 g/l， MgSO4 0.11 g/L， polyether defoamer 0.2 ml/l

培养基糊化、液化、糖化后灭菌，可防止培养基结团。

补料培养基 （8L）：350 g/l 葡萄糖，0.3 g/l KH2PO4， 0.3 g/l (NH4)2HPO4， 0.2 g/l MgSO4

2.3主要试剂

玉米粉、玉米浆为市售。

MgS04·7H20、KH2P04 、(NH4)2HPO4为国产分析纯。 2.4主要仪器

电子天平 上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂 真空干燥箱 上海第三分析仪器厂 紫外可见分光光度计 上海第三分析仪器厂 真空泵 巩义市英峪予华仪器厂 安捷伦液相色谱仪 美国Agilent公司 台式恒温摇床 江苏太仓市实验设备厂 电热式压力蒸汽消毒器 无锡第二医疗器械厂 超净工作台 苏州空气净化设备厂 pH计 北京Hanna公司

W501升降恒温水浴锅 上海申顺生物科技有限公司 高压液相 3 试验方法 3.1 发酵培养

将茄子瓶斜面用50 mL无菌水洗下，以0.6%的接种量接入培养基，其他控制条件参考过程中具体控制参数。 3.2 检测

3.2.1 DNS测定总糖和还原糖

葡萄糖标准液（1 g/L）

预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取0.5 g葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至500 mL容量瓶中，定容，摇匀，备用。

3，5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）

将5.0 g 3，5-二硝基水杨酸溶于200 mL 2N NaOH溶液中（不适宜用高温促溶），接着加入500 mL含130 g酒石酸钾钠的溶液，混匀。再加入5 g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解后，定容至1000 mL。暗处保存备用。

还原糖测定 DNS法操作规程

还原糖 测定 加稀释样液 ml 补水到 ml DNS ml 沸水浴显色 min 冷却后补水到 ml 550nm ABS 总糖测定

总糖 测定 加稀释样液 ml 补水到 ml 1 0.7加盐酸（6M） ml 沸水浴 min 冷却加氢氧化钠(6M) ml 加DNS ml 沸水浴显色 min 冷却后补水到 ml 550 nm ABS 样品稀释到0.05%含量进行测定

1.0 1.5 5 10 5 20 1 1.5 5 10 C%?(Ai+0.0297)1??0.05?D0.5813V取

Ai ： 测得的吸光度

V取 ：稀释后样品测定时的取样量 D ：样液的稀释倍数 3.2.2 氨基氮的测定

(1)实验原理

氨基酸具有两性性质，不能直接用酸碱滴定，但与甲醛反应后使氨基封闭而羧基的酸性增强，可用强碱滴定。氨基酸与甲醛反应生成二羟甲基氨基酸，这个反应是中和法测定氨基酸和定量的依据，称为甲醛滴定法(formol titration)。

R-CH-COOH + 2HCHONH2R-CH-COO-+ H+N(CH2-OH)2

(2)试剂配制

Ⅰ、0.1%甲基红指示剂：0.1 g指示剂溶于100 mL 60%乙醇中。 Ⅱ、0.1%酚酞指示剂： 0.1 g指示剂溶于100 mL 60%乙醇中。 Ⅲ、0. 05 N氢氧化钠标准溶液的配制与标定 A、配制

称取氢氧化钠2 g，加新煮沸的冷蒸馏水至1000 mL。 B、标定

精确称取105℃干燥至恒重的苯甲酸氢钾基准物5.10525 g，加蒸馏水至250 mL，即为0.1 N苯甲酸氢钾标准溶液。精确吸取苯甲酸氢钾标准溶液10 mL，加酚酞指示剂2~3滴，用0.05 N氢氧化钠溶液滴定至粉红色。

C、计算

NNaOH =0.1×10/VNaOH N-氢氧化钠标准溶液浓度

V-滴定消耗氢氧化钠标准溶液毫升数。 Ⅳ、18%中性甲醛

取36~40%甲醛加1倍蒸馏水稀释，加酚酞指示剂2~3滴，用0.1 N氢氧化钠中和至微红色。

(3)测定方法

准确吸取发酵离心上清液10-25 mL于250 mL三角瓶中，加蒸馏水50 mL，甲基红指示剂2滴，用0.1 N盐酸调至红色，再用0. 05 N氢氧化钠调至橙黄色，加18%中性甲醛4 mL，摇匀放置10 min，加酚酞指示剂8滴，用0.05 N氢氧化钠标准溶液滴定至微红色。

计算：氨基氮（mg/100 mL）=N*V×0. 014×100 ×1000/5 3.2.3 菌浓测定：离心体积和干重

用50ml尖底离心管，用分析天平先精确称其重量，取50ml发酵液4000rpm离心10min，将上清倒出至另一离心管中备用测其他参数，大概读取菌体沉淀体积，得到离心体积百分比。将沉淀用去离子水洗涤一次再次在相同条件下离心，弃上清，于80摄氏度烘箱中烘干至恒重，利用差重法得到发酵液DCW。 3.2.4 葡萄糖酸钠含量的测定

葡萄糖酸钠含量通过HPLC法测定。测定条件为，色谱分离柱：C18柱(4.6mm×250mm，5μm) ；流动相：水:甲醇:1%磷酸溶液150mL:10%四丁基氢氧化铵=324:25:150:1；检测波长：210nm；流速：1mL/min；柱温：26℃；进样量：20μL。

4实验结果与讨论 4.1 葡萄糖含量

图 1 葡萄糖含量曲线

由图1可以看出，发酵前期孢子处于活化萌发期，属于延滞期。8h后葡萄糖的含量直线下降，21h左右时降为0，这主要是由于黑曲霉菌是以葡萄糖作为碳源的，主要用于菌体的生长和维持；另外葡萄糖酸的合成前体也是葡萄糖。因此，在发酵过程中葡萄糖不断地被利用，直至消耗完。由发酵综合曲线可知，在22h时开始流加碳源，因此曲线上显示葡萄糖的含量有所上升，但又被短时间内耗竭。

4.2 总糖和还原糖含量

图 2 总糖含量曲线

图 3 还原糖含量曲线

由图2和图3可知，总糖和还原糖含量与葡萄糖含量曲线基本保持一致。这是由于本次发酵只用了一种糖即葡萄糖。可能发酵过程中，三种参数会有微小的差异。 4.3 氨基氮

图 4 发酵液中氨基氮含量的测定

由图4可知，发酵前期菌处于延滞期，含量变化不大，8h后菌体开始生长，耗氮比较多，到16h黑曲霉菌开始合成产物葡萄糖酸，后期有微幅增长，可能是测量误差引起。

4.4 葡萄糖酸钠

表4.1 HPLC测定葡萄糖酸钠含量

时间(h)

峰面积

出峰时间(min)

8 16 20 32 40 标准葡萄糖酸

- 175.946 209.938 125.527 121.743 452.344

- 2.813 2.809 2.812 2.811 2.813

葡萄糖酸含量(g/L)

- 62.234 148.516 177.602 215.310 1.600

图 5 葡萄糖酸含量的测定

由图5可知，到8h后菌体开始产酸及葡萄糖酸，通过流加碱达到控制PH恒定，同时产物发生中和反应生成葡萄糖酸钠。放灌时，产物仍在积累，说明菌体还处于稳定期，可以稍微延长发酵时间，以便得到更多的产品。

4.5 菌体浓度的测定

图 6 菌体浓度的测定

由图6可知，第一次测定可能有误，菌体一直处于增长状态，这其实不利于获得更多的产品。或许可以调整发酵条件来使后期的菌体生长放缓 4.6 菌体生长情况

在0~32 h内每隔8 h取样，对菌体进行拍照，菌体生长情况如下图所示，由图可知，在0~8 h内在显微镜下无法观察到菌体，在16 h以后可以观察到较明显的菌丝。

0 h 100倍

16 h 100倍

4.7 在线检测

8 h 100倍 32 h 400倍

图 7 在线检测曲线

由图7可知：

(1) 0h到8h期间，接入发酵罐的菌体处于延滞期，因此菌浓、溶氧基本不变。4h时发酵罐进行了一次性补水5L

(2) 4~5h之间，向罐内补加5L水：①由于补加水的温度低于发酵液温度，从而导致发酵液温度下降；②发酵液体积增加，料液被稀释，pH上升，溶氧DO有些微上升。

(3) 9h左右：①电容值增加表明细胞量在增加，菌体进入生长阶段；②菌体利用底物糖进行生长需要消耗O2，从而导致溶氧DO下降；③菌体生长会消耗O2，释放CO2，因此O2消耗速率OμR和CO2释放速率CER上升；④RQ值在开始不断下降，说明此时O2消耗速率OUR的增大速率要大于和CO2释放速率CER的增大速率，因为O2除了用于菌体生长外，还作为葡萄糖酸合成的底物被利用，因此CER/OUR的值会减小。

(4) 10h左右，发酵液pH有所下降，此时开始流加NaOH：①pH下降说明此时产酸已经开始；②为了在发酵过程中积累葡萄糖酸，发酵液pH需控制在5.0~5.5，若低于4.0则菌体代谢开始积累柠檬酸，因此要流加NaOH以维持发酵液的pH；③发酵液电导率开始上升是流加NaOH的结果，此时葡萄糖酸生成葡萄糖酸钠，游离的Na+使得发酵液电导率上升；

(5) 13h左右，提高了转速和空气流量：①由于DO降到20%以下，不利于菌体的生长和发酵过程的继续，所以采取上述措施使得溶氧DO上升；②溶氧迅速下降主要是有两部分原因，一是菌体生长会消耗氧，二是菌体生产葡萄糖酸时氧是作为底物的，因此溶氧会下降；③由于采取适当的措施使得溶氧DO恢复，因此菌体可以继续正常的生长，细胞量(电容值)继续上升，OUR、CER也处于上升的阶段；

(6) 18h左右：溶氧突然上升，OUR、CER迅速下降，细胞量(电容值)基本无变化，并维持了一段时间，说明此时碳源被耗尽，并没有继续补入碳源，菌体生长和葡萄糖酸积累停止；另外，RQ值突然上升，也是由于此原因。

(7) 22h左右，降低转速，并开始流加补入少量底物糖：①此时发酵液体积增加；②电容值增加即细胞量增加，菌体继续生长；②溶氧DO由于补入底物糖而迅速下降；③OUR、CER由于菌体生长时的呼吸作用也随之上升，RQ值有所下降；④电导率上升说明此时葡萄糖酸继续合成。

(8) 23~24h，补糖停止：溶氧DO上升，CER、OUR下降，RQ值有所上升，细胞量(电容值)基本不变，说明菌体很快就将补入的糖消耗完了；

(9) 24h左右，补糖速率不断增加：①由于底物糖的量增加，细胞生长和合成葡萄糖酸的速率增加，导致溶氧开始下降；②细胞量(电容值)增加明显，细胞生长继续，OUR、CER也随之上升，但幅度明显低于生长对数期，此时菌体的生长已经放缓，RQ值下降缓慢；③电导率升高说明产酸量增加；④发酵液体积随糖液的补入而增加；

(10) 29h左右，降低了转速：①溶氧DO值降低接近于0；②细胞量(电容值)维持在一定水平上，说明此时菌体已进入静止期，OUR、CER有所下降，菌体主要进行葡萄糖酸的合成；

(11) 35h左右，①细胞量(电容值)降低，说明菌体生长已出现衰退或自溶；②电导率不变，说明产酸已接近停止；

(12) 36h左右，增加了转速：①溶氧DO上升；②细胞量(电容值)略微升高，即溶氧的上升使得细胞生长有有些微的恢复，OUR、CER也随之升高；③电导率有所上升，说明产酸也些微的恢复；

(13) 40h左右，电容值下降，细胞量减少，溶氧上升，，发酵已达终点，可以结束发酵，放罐。

5 展望

目前国内发酵法生产葡萄糖酸钠的企业初糖浓度超过30%，周期不足30h，蒸汽单耗2吨左右，电耗达到450kwh以内，发酵设备由初期的50m3发展到400m3，供风采用国外高压离心式压缩机；发酵搅拌采用半气升式节能装置，大大减少了发酵能耗；提取设备由原来单效蒸发、间歇降温结晶，变为多效连续蒸发结晶工艺，使蒸发每吨水的蒸汽耗量降到0.2吨左右。新制订的葡萄糖酸钠行业标准征求意见稿的指标显示：多项指标已经超过FCCⅥ等国际标准，特别是2005年以来新投产企业，借助国内谷氨酸和柠檬酸的成功经验，基础设施和设备选型、工艺配置起点较高、技术先进，使发酵法生产葡萄糖酸钠的生产技术上了一个新台阶。

葡萄糖酸钠作为一个新兴行业，混凝土市场用量大，特别是近年发酵法生产 的应用给行业发展注入活力，发酵法的特点具有高糖、高温、低周期、生产线路短的巨大优势，其制造成本低廉，是所有有机酸行业中少有的。葡萄糖酸钠的呈味性和独具的功能，完全可以替代价格更高的苹果酸钠、柠檬酸钠、乳酸钠等有机酸盐产品，用于调节PH，改善呈味性等，同时可以代替食盐制作低盐食品，应用空间很大。葡萄糖酸钠市场和应用领域进一步扩大，原有企业将扩大产能，并不断有新企业上马

葡萄糖酸用途广泛，在多个行业均有广泛应用前景，市场需求大。其主要生产方法有发酵法，电解氧化法及催化氧化法。生物发酵法不仅经济节约而且相对环保。目前阻碍生物发酵法生产葡萄糖酸的主要障碍是产量以及成本。因此，要使得生物发酵法生产葡糖酸使用更加广泛，必须提高葡糖酸产量。提高葡糖酸产量包括菌种改造，工艺优化等。

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