细胞培养实验报告

细胞培养实验报告

细胞培养主要包括细胞复苏、细胞传代和细胞冻存三个过程。

一、实验仪器及用品

（一）超净台：

1. 枪头：10 mL、5 mL、1 mL、200 μL、10 μL； 2. 移液枪：同上，及相应的支架；

3. 离心管：50 mL、15 mL、1.5 mL，及相应支架与盛皿； 4. 记号笔； 5. PBS缓冲液； 6. 酒精棉；

7. 废液杯×2：一个装枪头，一个装废液； 8. 封口膜； 9. 排枪卡槽； （二）细胞间：

1. 离心机：中型、小型；

2. 培养瓶：透气的用于培养，密封的用于运输，培养皿； 3. 灭菌离心管、枪头、冻存管等备用；

4. 毛巾、手套、口罩、酒精喷壶、灭菌超纯水、除菌滤膜； 5. 100 μL排枪； 6. 血球计数板、载玻片； 7. 水浴锅； （三）冰箱： 1. 双抗、环丙沙星；

2. 4℃：DMEM、1640、PBS、已配培养基； 3. -20℃：MTT、MTS、DMSO、血清、胰酶； （四）缓冲间： 1. CO2罐、液氮罐； （五）换衣间

1. 实验服、拖鞋、手套、口罩、酒精喷壶；

二、实验前准备

（一）实验前将需要带入的物品洗净、高温灭菌、喷酒精，放入传送窗，将传送窗与细胞间紫外开启杀菌半小时；

（二）半小时后关闭紫外，开启风阀与空调，散去臭氧，双手用洗手液洗净擦干后进入换衣间，换上隔离服（若不使用超净台，换实验服即可），戴上口罩、手套喷酒精，进入缓冲间风浴1-3 min；

（三）进入细胞间，冰箱中取出所需溶液（胰酶、培养基等）置于超净台中，开启超净台紫外，关闭传送窗紫外，将物品取出后喷酒精后放于应处位置；注：若是冬天，溶液应在37℃水浴后再使用，所有物品放入超净台前均需再喷酒精，特别是盖口处。

三、细胞培养

（一）细胞复苏

1. 培养基配制：倒出50 mL培养基，加入50 mL血清，5 mL双抗（浓度10-50 μg/mL环丙沙星可作用一周抑制支原体生长），分装3天够用的培养基即可，所有都用封口膜封住；

2. 冻存液配制：1 mL DMSO、2 mL血清、7 mL培养液混合；

3.37℃温育DMEM培养液（含双抗和血清）。一般通过急速升温的方法使冻存的细胞吸收水分，保证细胞结构不受影响。即取出冻存细胞放入37℃水浴槽中快速转动，1min内迅速融化，避免细胞内再结晶的发生。

4.细胞悬液转移至离心管中并加入温育的培养液至10mL，900r/min离心10min，倒出上清培养液，再加入培养液重悬细胞，重复上述操作，共离心3次，最后将细胞重悬于10mL培养液中，转移至培养瓶中，放入37℃ 5%CO2恒温培养箱中培养。

5.大约4~5小时后，开启电脑显微镜，培养箱中取出细胞放于显微镜下观察；注：平拿平放，不可用手触摸瓶皿接口处，观察细胞是否细胞贴壁，继续培养。 6.换液：定时观察细胞形态及培养基状态，细胞生长至12 h左右贴壁，24 h后可根据培养基颜色变化和细胞生长速度及形态变化选择换液，吸去原培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，更换新培养基。

（二）细胞传代

细胞传代，是将培养的Hela细胞用胰酶消化、稀释、分配到新的培养瓶内继续培养的过程。观察细胞瓶内细胞长满（细胞密度＞90%），进行传代。

具体操作步骤如下：

1.将37℃温育了20min的磷酸盐缓冲液（1×PBS）、胰酶和DMEM培养液（含双抗和血清）取出，用纱布擦拭后，喷洒酒精置于无菌生物安全柜中。

2.将培养瓶中旧的培养液倒出，移取2mL1×PBS于培养瓶中，轻轻摇晃洗涤并将液体倒出，用1×PBS洗涤2次。之后加入2mL胰酶消化，倒置显微镜下观察至细胞轮廓分明约1~2min，倒掉胰酶，加入6mL新培养液，从上至下轻轻吹打，至瓶壁透明。

3.将制得的细胞悬液分装至2个新的培养瓶中，补齐新培养液至10mL/瓶。放入37℃ 5%CO2恒温培养箱中培养。

（三）细胞保藏

冻存前一天换液，显微镜下观察保证所有细胞无菌且生长状态较好，弃培养基，PBS清洗两次，胰酶消化后以800 rpm离心5 min,弃上清，适量冻存液悬浮细胞，用血球计数板计数，调节细胞密度为104-5 个/mL，分管冻存于细胞保藏盒中。标明保藏日期，置于4℃ 30 min后转到-20℃ 30 min，再存于-80℃。

四、MTT法操作

（一）铺板：将状态良好生长壮实的细胞（复苏后的细胞应穿3代后再用于实验）吸去培养基，PBS后用1 mL胰酶消化1 min，以两倍胰酶体积即2 mL培养基终止消化，转入离心管后，800 rpm离心5 min去上清，用1-2 mL培养基轻轻吹打重悬细胞后，取10 μL至血球计数板置显微镜下计数，铺板的浓度一般为10-10个细胞/mL，每空100 μL细胞应有约10-10个细胞，计数后计算出添加培养基的量，用排枪将培养基与细胞混合均匀加入96孔板中，周围用PBS密封细胞，以免培养基挥发；

（二）配制样品浓度：将样品用培养基或PBS稀释相应浓度梯度，过膜除菌备用； 1. 加样：细胞培养12 h处于贴壁状态后即可添加样品，吸出原培养基，加入100 μL新培养基，加入各浓度样品（应提前计算添加100 μL培养基稀释后的样品

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浓度，以此为样品终浓度），复孔3或5个，对照组换液后加入无药品的药品稀释剂（培养基或PBS）；

2. 检测：48 h后结束培养，显微镜下拍照记录，吸出所有液体，以每孔180 μL 无血清培养基与20 μL MTS试剂混合均匀后添加，培养1-4 h，用酶标仪在490 nm波长下检测OD值；

五、注意事项

1. 血球计数板数四个角计数，计上不计下，计左不计右，数÷4×104，即密度：个/mL，用后酒精棉擦拭即可；

2. 倒出液体后可将瓶口、管口倒扣在酒精棉上除去残留，也处理可能污染的物质；

3. 排枪卡槽使用完清洗后用酒精浸泡，置于超净台紫外杀菌自然风干即可； 4. 所有计算均在细胞间外完成，可将操作步骤或配取比例贴在超净台外，方便观看；

5. 控制细胞时可边传代边保存，传代时调节密度，离心后弃掉半小时还未沉降至沉淀的细胞，半年内使用放-80℃，长期保存放液氮中；

6. 刚做完细菌实验或生化实验最好不要进入细胞间，每天都应观察细胞状态及时做处理；

7. 96孔板应合理利用，时间梯度也可同时进行，标记明确即可；

8. 环丙沙星除去支原体后应逐渐减少浓度，不可一直使用，以免产生耐药性； 9. 培养基的无菌水一周换一次，废液缸一天清理一次细胞间可1-2周打扫一次，若染菌，培养箱应高压一次；

10. 使用完的物品应及时准备好补给回细胞间，如酒精棉、枪头、废液缸、离心管等；

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