EHA101农杆菌感受态细胞

EHA101农杆菌感受态细胞 编码 北京华越洋生物WXR15-100S 北京华越洋生物WWXR115-100 产名称 EHA101农杆菌感受态细胞 EHA101农杆菌感受态细胞 单位 规格 盒 盒 10*100ul 20*100ul

EHA101农杆菌感受态细胞

EHA101 Chemically Competent Cell 产品说明书 产品规格

EHA101: 10×100 μl

pK7WGF2 (control vector) 10 ng/μl 10 μl

保存条件： -80℃ 基因型

C58 (rif R) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA) (kanR, strepR) Nopaline

EHA101农杆菌感受态细胞说明

华越洋 EHA101菌株为C58型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)，此质粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。pEHA101 (pTiBo542DT-DNA) 型Ti质粒含有筛选标签：strep、kan，赋予EHA101菌株链霉素抗性和卡那霉素抗性，适用于玉米、水稻、烟草等植物的转基因操作，经pK7WGF2质粒检测转化效率可达104 cfu/μg DNA。

EHA101农杆菌感受态细胞操作方法

1. 取-80℃保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。

2. 每100 μl感受态加1 μg（体积不大于10 μl）质粒DNA，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。

3. 加入700 μl无抗生素的LB或YEB液体培养基，于28℃，200rpm振荡培养2~3小时。 4. 6000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。

备注：

1、农杆菌相关抗生素配方： 抗生素 配方 原液浓度

50 mg/ml 羧苄青霉素 (carb) 双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌

50 mg/ml 硫酸卡那霉素 (kan) 双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌

10 mg/ml 链霉素 (strep) 双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌

10 mg/ml 利福平 (rif) DMSO溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌

20 mg/ml 庆大霉素 (gent) 双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌

2、常用农杆菌抗性： (R：抗；S：敏感。)

工作浓度 50 μg/ml 50 μg/ml 50 μg/ml 20 μg/ml 40 μg/ml

农杆菌菌羧苄青霉素链霉素(strep) 利福平(rif) 庆大霉素硫酸卡那霉素

(carb) (gent) (kan) 株

AGL-1 R R R S S EHA101 S R R S R EHA105 S R R S S LBA4404 S R R S S GV3101 S R R R S 3、LB及YEB配方： component LB(液体)/L LB(固体)/L component YEB(液体)/L YEB(固体)/L Tryptone 10 g 10 g Tryptone 5 g 5 g Yeast extract 5 g 5 g Yeast extract 1 g 1 g NaCl 10 g 10 g 5 g 5 g 牛肉浸膏 NaOH 5 g 5 g 调PH到7.0 调PH到7.0 蔗糖 Agar 15 g MgSO4*7H2O 0.49 g 0.49 g － NaOH 调PH到7.0 调PH到7.0 Agar 15 g －

注意事项

1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

1. 2. 混入质粒时应轻柔操作，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3. 利福平浓度不应高于25 μg/ml，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有50 μg/ml kan，若所用平板同时含有20 μg/ml rif则转化效率降低到1/2。

4. 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止Ti质粒丢失，但链霉素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素，Ti质粒丢失的概率极低 (可以忽略)。 EHA101农杆菌感受态细胞

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