基因工程作业

1、DNA载体经HindⅢ切割后产生粘性末端，能发生载体自连，影响载体与外源DNA的连接效率，常用的防止载体自连的方法有碱性磷酸酶处理使5’磷酸基团羟基化。 2、切口平移是指在DNA聚合酶Ⅰ的作用下，使5’磷酸基团带上放射性标记。

在酶切缓冲液中，一般需加入BSA，请问加入BSA的作用是提高蛋白质浓度防止酶失活。 3、下列哪一种酶作用时需要引物（B）反转录酶在作用时需要DNA聚合酶，而后者需要引物 A、末端转移酶B、反转录酶C、 DNA 连接酶D、限制酶 4、下列DNA片段，最可能含有SstI 酶切位点的是（A） Ａ GGAGAGCCTCT Ｂ GAGCACATCT Ｃ CCCTGTGGGA Ｄ ATCCTACATG Ｅ AACCTTGGAA DNA连接酶的作用特点有哪些？

1、DNA 3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P） 2、需要能量、Mg2+

3、被连接的DNA链必须是双螺旋的一部分 4、只封闭双螺旋DNA骨架上的nick

大肠杆菌DNA聚合酶I有哪些不同的酶活力特性，各有何利用价值。 1、5’— 3’聚合酶活性：以DNA为模板利用四种dNTP合成DNA链 2、3’— 5’外切酶活性：主要起校对作用

3、5’— 3’外切酶活性：从5’端降解DNA分子

何谓 Star activity？简述 Star activity 的影响因素及克服方法？

限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性，称为星号（*）活性。 （1）高甘油含量（>5％, v／v）；

（2） 限制性内切核酸酶用量过高（>100U／ugDNA）； （3）低离子浓度（<25 mmol／L）； （4）高pH（8.0以上）；

（5）含有机溶剂，如DMSO（二甲基亚砜 ），乙醇等；

（6）有非Mg2+的二价阳离子存在（如Mn2+，Cu2+，Co2+，Zn2+等）。

举例说明在基因工程中修饰性工具酶具有的重要用途

1、末端转移酶：同聚物加尾克隆DNA片段，再生酶切位点便于回收克隆片段，标记DNA片段的3’末端

2、多核苷酸激酶：催化5’羟基末端磷酸化便于DNA分子连接标记DNA或RNA的5’段 3、碱性磷酸酶：去除DNA或RNA分子的5’末端磷酸基团，防止线性化的载体分子自我连接；与多核苷酸激酶共同作用，标记DNA5’末端

用 T4 phage DNA polymerase 可进行末端标记，试简述其原理？

用3’—5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端制造出3’隐蔽端，再利用它的5’—3’聚合酶活性补平，并加入放射性标记的32P-dNTP。标记的dNTP逐渐取代被删除掉的原有的核苷酸，因此叫做取代合成。

1、下列哪种克隆载体对外源 DNA 的装载量最大（B）

A、粘粒 B、酵母人工染色体（YAC) C、质粒 D、λ噬菌体

2、pUC18 与 pUC19 的区别在于（B）

A、二者的选择标记不同 B、二者MCS方向相反 C、pUC18 无 lacZ 基因 D、pUC19 无 lacZ 基因

3、M13 单链噬菌体的复制分为三个阶段，以下哪一项不属于此（C） A、SS→RF B、RF→RF C、RF→SS D、SS→SS 4、下列有关质粒分子生物学的叙述，错误的是 （B） Ａ、质粒是共价环状的双链 DNA 分子

Ｂ、天然质粒一般不含有限制性内切酶的识别序列

Ｃ、质粒在宿主细胞内能独立于染色体 DNA 自主复制 Ｄ、松弛复制型的质粒可用氯霉素扩增 Ｅ、质粒并非其宿主细胞生长所必需

5、带有多个不同种复制起始区的质粒是 （A）

Ａ、穿梭质粒 Ｂ、表达质粒 Ｃ、探针质粒 Ｄ、整合质粒 Ｅ、多拷贝质粒 6、考斯质粒（cosmid）是一种（B） Ａ、天然质粒载体

Ｂ、由 DNA 的 cos 区与一质粒重组而成的载体 Ｃ、能裂解受体细胞的烈性载体 Ｄ、具有溶源性质的载体

Ｅ、能在受体细胞内复制并包装的载体

7、下列各常用载体的装载量排列顺序，正确的是 （A） Ａ、Cosmid > DNA > Plasmid Ｂ、 DNA > Cosmid > Plasmid Ｃ、Plasmid > DNA > Cosmid Ｄ、Cosmid > Plasmid > DNA Ｅ、 DNA > Plasmid > Cosmid

8、下列载体常用选择性标记中属于营养缺陷型的是 （ E ） Ａ、tsr Ｂ、Apr Ｃ、lacZ Ｄ、Tcr Ｅ、Trp-

9、载体质粒 pBR325 共有三个选择性标记： Apr、Tcr、Cmr 。它们分别含有一个单一酶切位点： PstI、SphI和EcoRI。若将一外源基因取代此载体上不含Cmr标记基因的PstI-SphI限制性DNA片段，那么用于转化子和重组子筛选的试剂应是 （D） Ａ、Ap Ｂ、Tc Ｃ、Cm Ｄ、Ap + Tc Ｅ、Ap + Cm

10、构建GST蛋白表达系统的载体是为了是目标蛋白以（A）方式表达？ A、融合表达 B、分泌表达 C、独立表达 D、包含体表达

1、λ噬菌体根据接受外源DNA的方式不同，可以分为插入型和置换型两种类型载体。 2、黏粒载体是由质粒和 噬菌体DNA共同构成的。

3、就一个基因（DNA片段）来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：复制起始位点（ORI）、多克隆位点（MCS） 、选择性标记基因。另外，一个理想的质粒载体必需具有低分子量。

4、原核表达载体的表达元件主要包括启动子、核糖体结合位点和终止子。 5、基因工程构建基因重组体是指将目的基因与载体进行连接重组

载体：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞复制、整合或表达的工具 质粒的不相容性：在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存的现象

柯斯载体： 柯斯质粒是人工建造的的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体

人工染色体载体：利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称为人工染色体 基因打靶：通过DNA同源重组，使细胞特定的内源基因被破坏而造成其功能丧失，或在基因组特定的位点插入外源基因

RNAi：当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA（dsRNA）时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，

什么是克隆载体，克隆载体必需满足哪些基本条件？ 能够通过限制性内切酶将目的基因片段整合进去，并且能够转入宿主细胞内进行表达的生物生物DNA

1、对受体可转移性， 2、宿主细胞内能独立复制

3、有一段多克隆位点，供外源DNA插入

4、具有合适的选择标记性，用于含有重组质粒的宿主细胞的筛选

表达载体需要的基本元件及其作用？ ORI：结合用于复制起始的酶

选择性标记：用于筛选重组克隆体 MCS：用来插入外源基因

表达调控元件（启动子，核糖体结合位点RBS，终止子）：使外源基因表达蛋白产物 简述RNAi的作用机制

外源dsRNA 进入细胞后产生的小分子干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）的反义链和多种核酸酶形成了沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，RISC具有结合和切割mRNA的作用而介导RNA干扰的过程

1、Southern bloting 杂交能够检测外源基因是否整合进受体细胞基因组；外源基因的转录表达需要通过Northern bloting 来揭示；而外源基因蛋白质水平的表达则需通过免疫学检测或Western杂交才能揭示，其使用的探针是特异性抗体。

2、碱变性抽提法提取质粒DNA的原理是利用染色体与质粒DNA的变性与复性存在着差异达到分离的目的。

3、分离DNA时使用金属离子螯合剂，如EDTA和柠檬酸钠等，其目的是Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。

4、确定分离的基因是否具有与天然基因相同序列的唯一方法，也是最准确的方法是基因测序。

5、下列哪种PCR技术不能根据已知部分序列获得未知序列（D） A、RACE B、TAIL-PCR C、反向PCR D、巢式PCR 6、免疫印迹法筛选重组体的原理是（D） A、根据载体抗性基因的表达 B、根据载体报告基因的表达 C、根据DNA与mRNA的杂交 D、根据外源基因的表达

1、反向PCR ：扩增已知DNA片段两侧的未知序列

2、实时定量PCR：在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对模板中特定基因进行定量分析的方法。

3、斑点印迹杂交：在Southern印迹杂交的基础上发展而来,通过特殊的加样装置将变性的DNA或RNA样品，直接转移到适当的杂交滤膜上，然后与核酸探针分子进行杂交，以检测核酸样品中是否存在特定的DNA或RNA 4、RT-PCR：利用反转录酶，把mRNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。 5、菌落或噬菌斑杂交：将标记的核酸探针直接与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交

2、什么是简并引物？设计简并引物时如何降低简并度？ 简并引物：一个氨基酸可对应一个到多个密码子，因此一段氨基酸序列可以有多个可能的编码序列，合成这一段序列作PCR扩增体系的引物既为简并引物。 （1）在选取氨基酸序列时往往优先选择对应密码子较少的残基；

（2）选取氨基酸序列的长度一般为5个，对应一段15个碱基的核苷酸序列；

（3）放弃最后一个氨基酸对应密码子的第三位碱基，合成14个碱基的简并引物。 3、在PCR反应的后期，反应体系中就会出现一种所谓的平台效应（Plateau effect），请问什么叫Plateau effect？产生Plateau effect的原因有那些？

PCR反应经过一定数量的循环后，随着产物的对数累积趋于饱和，DNA片段不再呈指数积累，而是进入线性增长期或静止期，此过程成为平台效应。

① dNTP、引物浓度降低，掺入速度变慢 ② 随产物增加，酶与模板比例下降

③ 非特异性产物或引物二聚体与反应物的竞争 ④ 产物的再结合

1、经典RACE克隆的原理是什么？有何意义？

原理： 3’ RACE：由含有oligo（dT）的接头引物引发合成cDNA第一链，根据中间核心序列设计出上游引物，与3’引物扩增第一链cDNA，可得到全长cDNA的3’末端序列。 5’ RACE：先用oligo（dT）引发合成cDNA第一链，然后在第一链cDNA的3’端加上人工锚定序列，利用5’锚定引物及3’特异性引物进行扩增，得到全长cDNA的5‘末端序列。

意义:根据已得到的不完整cDNA序列设计引物对3’和5’端进行克隆从而获得全的cDNA克隆

2、什么是Genomic library？与cDNA library有何区别？

基因组文库：将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因。

差别：① 基因组文库克隆的是任何片段，包括未知功能的DNA序列、调控基因，cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因。

② 基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响；cDNA文库克隆的是不完全的编码DNA序列，受发育的调控因子的影响。

③ 基因组文库中编码基因是真实的基因，含有内含子和外显子；cDNA克隆的是不含内含子的基因。

3、什么是cDNA文库？ cDNA文库必需满足什么条件，构建包括哪些步骤？

cDNA文库：将某一生物的特定组织或特定发育时期细胞内的全部mRNA反转录成cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，这些cDNA克隆（包含着细胞全部mRNA信息）的集合称为该组织细胞的cDNA文库。 满足条件：1、文库的代表性2、序列的完整性

构建步骤: 1、总DNA的提取2、mRNA的分离纯化3、cDNA合成4、cDNA与载体连接5、重组载体转化受体菌

4、差异显示PCR获得目的基因的技术原理是什么？有什么优缺点？

原理：利用一系列的oligo(dT)引物，逆转录真核生物细胞中全部表达的mRNA，通过PCR扩增的方法，转换成cDNA双链，再利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将有差异的片段分开，筛选出目的基因

优点：速度快、操作简单、灵敏度高、样品需要量少等 缺点：假阳性率高、获得的cDNA片段很短

例：取1μl（0.1 ng/μl）完整的质粒转化100μl的感受态细胞。向转化反应液中加入900μl培养液，让细菌恢复一小段时间，取100μl铺板。培养过夜，产生1000个菌落，转化率为多少？

转化率＝1000 / 0.01 ng DNA = 108 cfu /μg

例：某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107 cfu / mg 天然载体，经酶切和连接处理后的重组载体转化率比天然载体约低100倍，欲获得104个重组克隆，需要投入多少重组载体DNA进行重组实验？

104 ＝ 107 cfu / mg ×10-2 × a × 20% 重组载体 a = 0.5 mg

1、什么是感受态细胞？简述CaCl2法制备感受态细胞转化DNA的原理 ？ 感受态细胞：处于能吸收外源DNA分子的生理状态的细胞

原理：1、将处于对数生长期的细菌置于0℃的CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，处于感受态；

2、将感受态细胞与DNA混合，Ca2+与DNA结合形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物，粘附于细胞表面；

3、经42℃短时间热激处理，细胞吸收DNA复合物； 4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。

2、什么是Ti质粒？简述农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法。

Ti质粒：为植物根癌土壤杆菌菌株中存在的质粒，其特定部位与植物核内DNA组合来表达信息，使植物细胞肿瘤化

① 将目的基因插入到载体的T-DNA区，形成重组DNA ② 将重组DNA转入含有Vir致病基因的农杆菌 ③ 通过农杆菌侵染植物外植体

④ 将含有外源目的基因的T-DNA整合到植物细胞基因组中，获得转基因植株 3、重组子筛选主要有哪些方法 ？

① 载体表型选择法 ② 插入基因表型法 ③ DNA电泳检测法 ④ PCR检测法 ⑤ 核酸杂交检测法 ⑥ 免疫化学检测法 ⑦ DNA序列分析

1、酵母作为真核基因的高效表达系统有什么优点？

① 全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便； ② 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统； ③ 已经分离出很强的启动子；

④ 能将外源基因表达产物分泌至培养基中；

⑤ 生长迅速、大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉；

⑥ 不含有特异性的病毒、不产内毒素,美国FDA认定为安全的基因工程受体系统。 2、有哪些方法可以将外源目的基因转移到植物体内？转基因植物的潜在的安全隐患主要表现在哪些方面？ 方法：

① 农杆菌介导法 ② 基因枪法 ③ 电击法

④ 花粉管通道法

安全隐患：① 转基因植物的“基因漂移“风险 ② 转基因植物的“杂草化”问题

③ 基因工程产品对人类健康的潜在影响 ④ 可能使生物多样性受到损害

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/sz22.html