生物化学实验--转氨酶的提取、氨基移换反应与纸上层析

实验三 转氨酶的提取、氨基移换反应与纸上层析

一、实验目的

1、1.学习一种鉴定氨基移换作用的简便方法及其原理。 2. 学习用纸层析法测定转氨基作用。

3、了解氨基移换作用在中间代谢中的意义。 二、实验原理、

氨基移换酶也称转氨酶，它能催化α-氨基酸的氨基与α-酮酸的α-酮基互换，形成新的α-氨基酸与新的α-酮酸的作用.这种作用称为氨基移换作用。它在生物体内蛋白质的合成与分解等中间代谢中，在糖、脂肪、蛋白质三类物质代谢的相互联系、相互转化上都起着很重要的作用。任何一种氨基酸进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化。它们的最适pH 接近7.4。在各种转氨酶中，以谷氨酸草酰乙酸转氨酶(简称谷草转氨酶、GOT)及谷氨酸丙酮酸转氨酶(简称谷丙转氨酶、GPT)活力最强。

上述两种酶均广泛存在于生物机体中，在正常人血清中也有少量存在。机体发生肝炎、心肌梗塞病变时，血清中转氮酶活力显著增加，在临床上转氨酶活性的测定有重要意义。 测定转氨酶活性的方法很多，如分光光度法，纸上层析法及光电比色法等。

在氨基酸分解代谢中，联合脱氨基作用是大多数氨基酸的主要代谢方式，通过转氨基作用与谷氨酸氧化脱氨基作用偶联而完成。此过程可用下式表示:植物中多种氨基酸是通过转氨基作用合成的。

纸层析：是以滤纸作为支持物的分配层析法，是20世纪40年代发展起来的一种生化分离技术。由于设备简单，操作方便，所需样品量少，分辨力较高等优点而广泛的用于物质的分离，并可进行定性和定量的分析。缺点是展开时间较长。

分配层析法：是利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的的一种实验方法。在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数是一个常数即α=溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。 溶剂系统：由有机溶剂和水组成，水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相，有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相，由于混合液中各种氨基酸的分配系数值不同，其在两相中的分配数量及移动速率（即迁移率 Rf值）就不同，从而达到分离的目的。

三、实验材料、仪器和试剂： 1、实验材料：新鲜动物肝脏

2、仪器: 层析缸，层析纸，毛细管，离心机，天平，试管，吹风机，研钵等。 3、试剂：

溶剂系统： 无水乙醇：氨水：水=18：1：1（体积比）摇匀；0. 5%的茚三酮丙酮溶液 0.1mol/L丙氨酸标准溶液：称取0.891克丙氨酸以少量0.01MpH7.4磷酸缓冲液溶解，以NaOH溶液小心调节pH到7.4，用磷酸缓冲液加到100 ml。

0.1mol/L谷氨酸标准溶液：谷氨酸溶液，称取0.735克谷氨酸以少量0.01MpH7.4磷酸缓冲液溶解，以NaOH溶液小心调节pH为7.4后，用磷酸缓冲液加到50ml。

0.1mol/Lα-酮戊二酸（pH7.4）溶液，称取1.461克α—酮戊二酸以少量0.01M pH7.4磷酸缓冲液溶解，以NaOH溶液小心调节pH到7.4后，用磷酸缓冲液加到100ml。

0.01mol/L 磷酸缓冲溶液（pH7.4）0.2M Na2HPO4溶液81 ml与0.2M NaH2PO4溶液19 ml混匀，蒸馏水稀释20倍。 四、实验步骤：

1、酶液的制备：新鲜动物肝脏，在低温条件下剪碎称取2克肝脏，放入研钵中，再加入 9毫升磷酸缓冲液（pH 值 7.4）。研成匀浆后，即为制备的酶液。

2、酶促反应：取2支试管，编号。向1号试管做对照管，2号试管做测定管，两管中各加入酶液0.5ml。对照管放入沸水中煮5 min，测定管放在37℃水浴。然后对照管冷却，两管各加入丙氨酸溶液0.5ml、ɑ－酮戊二酸溶液0.5ml、0.1mol/L 磷酸缓冲溶液（pH7.4），1.5ml混匀，放入37℃恒温水浴中保温1小时。保温完毕后取出测定管放入沸水中煮5 min，终止酶反应。将2支试管的内容物分别离心，3000转／分，5分钟。将上清液转移到试管中，放置于低温处备用。 3、纸层析

(1)取一长方形滤纸，在滤纸纵向对应的两边距边沿 2cm 处，各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点样线，在点线上每隔 2cm 画一个“+”作为点样位置，共 4个点。

(2)点样：用毛细管点样，中间二个依次点二个上清液，两侧点二种标准氨基酸；每个点样点重复点 3次，每点一次用电吹风吹干后再点下次，点样点的直径应控制在 3mm左右，点样完毕用胶带将滤纸做成筒形，点样面向外,注意纸的两边不要接触。

(3)展层：向层析缸中加入层析溶剂，液层不要超过点样线，将滤纸点样点朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶剂到达标志线后取出，吹干。

(4)显色：用喷雾器将茚三酮显色剂均匀喷在滤纸上，吹风机热风吹干显色。 五.结果分析：

(1)用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来；

(2)测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种氨基酸色谱的 Rf 值。 (3)分析α-酮戊二酸和丙氨酸是否进行了转氨基作用，并写出相关的反应式。

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