核酸

第三章 核酸 第三章 核酸

第一节 核酸的性质 一、核酸的一般物理性质

DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末状固体，都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂。

DNA和RNA在细胞中常以核蛋白(DNP,RNP)形式存在，两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同。

DNA核蛋白 RNA核蛋白 0.14mol/LNaCl - + 1-2mol/LNaCl + -

DNA溶液的粘度很大，而RNA溶液的粘度小得多。核酸发生变性或降解后其粘度降低。 核酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中沉降下来，其沉降速度与核酸的大小和密度有关。

二、核酸的两性性质及等电点

核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有弱碱性基团碱基，因而核酸也具有两性性质。 由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱基呈现弱碱性，所以核酸的等电点比较低。

如DNA的等电点为4～4.5，RNA的等电点为2～2.5。核酸在其等电点时溶解度最小。 RNA的等电点比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2′-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。DNA没有这种作用。 三、核酸的水解

糖苷键比磷酸酯键更易被水解。

嘌呤形成的糖苷键比嘧啶的糖苷键更易水解。 最不稳定的是嘌呤和脱氧核糖形成的糖苷键 （二）碱水解 （二）碱水解

室温，0.1mol/L NaOH可将RNA完全水解，得到2’-或3’-磷酸核苷的混合物。 在相同条件下，DNA不被水解。

DNA、RNA水解难易程度的不同具有极为重要的生理意义。 DNA稳定 ，遗传信息。

RNA是DNA的信使，完成任务后降解。 （三）酶水解

生物体内存在多种核酸水解酶，这些酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。 RNA水解酶（RNase）：DNA为底物 DNA水解酶（DNase）：RNA为底物

核酸外切酶：作用方式是从多聚核苷酸链的一端（3′-端或5′-端）开始，逐个水解切除核苷酸；

核酸内切酶：作用方式是从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。 限制性核酸内切酶 分子生物学

限制性内切酶具有极高的专一性，识别双链DNA 上特定的位点，将两条链都切断，形成粘末端或平末端。

限制酶可被分成三种类型。

I 型限制性内切酶在随机位点切割DNA

Ⅲ型限制酶识别双链DNA 的特异核苷酸序列，并在这个位点内或附近切开DNA 双链。 Ⅱ型限制性内切酶

水解DNA不需要ATP，也不以甲基化或其他方式修饰DNA

在识别的特殊核苷酸顺序内或附近切割DNA 链。这些特殊序列常常含4 个或6 个核苷酸残基，通常具回文结构（palindromic structure），切割后形成粘末端（或平末端）。 广泛应用于DNA 分子的克隆和序列分析 比较回文结构（反向重复序列）和镜像重复 例如：EcoR I，粘性末端

5'……GAATTC……3' 3'……CTTAAG5'

这种回文结构的两条链以5‘→3’方向阅读序列都是一样的结构，当EcoR I 遇到DNA的这种序列时，它会对这种DNA 链进行交错切割，产生5‘凸端。 5'……G AATTC……3' 3'……CTTAA G5' 例如: EcoR V 平末端 5'……GAT ATC……3' 3'……CTT AAG5' 在研究某一种DNA时，了解这种DNA 分子有哪些限制酶切点是很重要的，即制作DNA 的限制酶图谱（restriction map）。建立限制酶图谱是进一步深入分析此DNA 的基础。

由于各种酶切位点之间的距离是以碱基对（bp）表示的，对大的染色体DNA 则以千碱基对（kilobase pair, kb）或百万碱基对（Mb）表示，也可计算出两切点间的绝对距离，因此，限制酶图谱也称物理图谱。 四、核酸的紫外吸收

增色效应：变性后DNA对260nm紫外光的吸收率（A260）比变性前明显增加

减色效应：在复性过程中， DNA对260nm紫外光的吸收率（A260）比变性后明显减小 五、变性、复性及杂交

相对蛋白质来说，核酸可以耐受反复的变性、复性。也是核酸研究技术的基础。 1. 核酸的变性与变性因素

核酸的变性：核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。 核酸的降解：多核苷酸骨架上共价键的断裂。 降解引起核酸Mr降低。 变性因素:

热变性

酸碱变性（pH<4或>11）

变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）

2.DNA变性后的表现 A260值↑ 粘度↓

浮力密度↑ 分子量不变

3.DNA的热变性和熔点（Tm） 2) 影响Tm的因素

①DNA均一性：均一性高，很小的温度范围。

②G-C含量与Tm值成正比，G-C含量高，Tm越高。

③介质中离子强度：

离子强度低，Tm低，较大的温度范围内。 离子强度高，Tm高，较小的温度范围内。 （二）复性

变性DNA在适当条件下，又可使两条彼此分开的链重新缔合成双螺旋结构。 淬火（quenching） 退火（annealing) 复性影响因素：

Mr越大，复性越难。 浓度越大，复性越易。

组成和结构越复杂，复性越难。 例 Klenow fragment

本酶在DNA模板和引物存在的条件下，选择性地催化底物dNTP沿5’ →3’ 方向合成与模板互补的DNA。本酶是从大肠杆菌中纯化得到，其中克隆了2/3的E.coli DNA polymerase I基因片段 (3’ 端计算) 。因此具有3’ →5’ 外切酶活性但是没有5’ →3’ 外切酶活性。 （三）核酸的杂交（hybridization）

核酸的杂交：不同来源的单链核酸之间可以通过碱基互补形成双螺旋结构。 DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA 杂交DNA分子 分子杂交

核酸杂交可以在液相和固相进行。 第三章 核酸

第二节 核酸的研究方法

一、核酸的分离、提纯和定量测定 基因组DNA的提取 真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或盐（1mol/L），但不溶于0.14mol/L NaCl中，利用此性质，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。

DNP可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。 （四） RNA的分离 总RNA制备方法：

用酸性胍盐/苯酚/氯仿抽提，小量制备RNA； 溴化乙锭－氯化铯密度梯度离心大量制备RNA。 （五）核酸含量的测定 1.紫外分光光度法 2.定磷法 3.定糖法

1.紫外分光光度法

纯DNA：A260/A280＝1.8 纯RNA：A260/A280＝2.0 含杂蛋白或苯酚：A260/A280↓ 2.定磷法：钼蓝比色法

RNA平均含磷量9.4% DNA平均含磷量9.9% 3.定糖法

核糖的测定：与浓硫酸或浓盐酸作用脱水生成糠醛，与地衣酚反应产生深绿色化合物（660nm）

脱氧核糖的测定：和浓硫酸作用，脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，与二苯胺反应生成兰色化合物（ 595 nm ）。 二、核酸的超速离心

测定核酸的沉降系数和Mr（沉降速度法） 密度梯度沉降平衡超离心常用于： 核酸密度的确定。

测定DNA中G-C之含量， G-C多，浮力密度大。 溶液中核酸构象的研究。

用于核酸的制备（溴化乙锭－氯化铯密度梯度离心）。 不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），起密度和沉降速率不同，用CsCl密度梯度离心就可以将它们区分开来，这一方法常用于质粒DNA的纯化。 相对沉降常数

线型双螺旋分子 1.00 松驰双链闭环 1.14 切刻双链环 1.14 单链环 1.14 线型单链 1.30 正超或负超螺旋双链环状 1.41 坍缩 3.0 三、 核酸的凝胶电泳

琼脂糖（agarose）凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE （一）琼脂糖凝胶电泳

1. 核酸分子大小： 迁移率与分子量对数成反比； 2. 胶浓度： 迁移率与胶浓度成反比;

3. DNA 的构象： 一般条件下超螺旋DNA 的迁移率最快，线形DNA 其次，开环形最慢。但在胶中加入过多的啡啶溴红时，上述分布次序会发生改变；

4. 电压： 一般不大于5V／cm。在适当的电压差时，迁移率与电流大小成正比； 5. 碱基组成： 有一定影响，但影响不大； 6. 温度： 4~30℃都可，常在室温。

琼脂糖凝胶电泳用于分析RNA 时，必须加入蛋白质变性剂，如甲醛等，以使核糖核酸酶变性。

荧光染料溴化乙锭（EB，致癌物）为一扁平分子，很易插入DNA 中的碱基对之间。经紫外光照射，可发射出红橙色可见荧光。 分子量的标准样品 marker 回收DNA片段。 （二）PAGE

凝胶的孔径比琼脂糖凝胶的要小，所以可用于分析分子量<1000bp 的DNA 片段。可以分辨1bp。

聚丙烯酰胺中一般不含有RNase，所以可用于RNA 的分析。但仍要留心缓冲液及其他器皿中所带的RNase。 染色方法：EB染色

亚甲基兰或银染（灵敏） 四、核酸的核苷酸序列测定

Sanger双脱氧链终止法 （酶法） Maxam Gilbert DNA化学法测序

Sanger双脱氧链终止法 （酶法）原理 核苷酸之间的连接方式： 3′，5′－磷酸二酯键

需要3 ′-0H和5′-磷酸基

Sanger双脱氧链终止法 （酶法）原理 Sanger双脱氧链终止法 （酶法）原理 五、DNA的人工合成 六、核酸的杂交技术 应 用

（二） 核酸探针的制备 据来源及性质不同：

合成寡核苷酸探针注意原则 长度（10-50 bp);

G:C对含量40%-60%； 探针内避免互补；

避免同一碱基连续出现；

与非靶序列有70%以上同源性或连续8个以上碱基序列相同，最好不用。 （三） 核酸探针的标记

(1)标记前后探针基本结构、化学性质相同; (2)特异性强、本底低、重复性好； (3)操作简单、节时； (4)安全、无环境污染。 2 探针的标记方法 (1)缺口平移法的原理

将DNase I 的水解活性与大肠杆菌DNA poly I 的5`→3`的聚合酶活性和5` →3`的外切酶活性相结合。

首先用E.coli的DNase I 在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于DNA pol I的5`→3`外切酶活性，切去带有5`-磷酸的核苷酸；同时利用该酶5`→3`聚合酶活性，使生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。 这两种活性同时作用，缺口不断向3`方向移动，DNA链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。 (2)随机引物标记法原理

用一些6nt作为随机引物，将这些引物和探针DNA片段一起热变性，退火后，引物与单链DNA互补结合，再在DNA聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则不断在其3`- OH端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新的标记的探针片段。 (3)末端标记法原理 在5`末端加成标记法：

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