生物技术综合实验指导手册 - 图文

鲁东大学生命科学学院 2010 生物技术专业《生物技术综合实验》实验指导

生物技术综合实验

实验指导

适用专业：生物技术

鲁东大学生命科学学院

编写：应用生物工程教研室

2010年

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鲁东大学生命科学学院 2010 生物技术专业《生物技术综合实验》实验指导

目 录

第一部分、综合性实验 ....................................................................................................... 4

综合项目一、α-淀粉酶产生菌的分离与筛选 .......................................................... 4

实验一、培养基配制及样品采集 ....................................................................... 4 实验二、样品处理及初筛 ................................................................................... 5 实验三、α-淀粉酶产生菌的分离与筛选 .......................................................... 6 综合项目二、酵母菌的诱变育种 ............................................................................... 8

实验四、培养基配制和菌种活化 ....................................................................... 8 实验五、酵母菌的诱变处理 ............................................................................... 9 实验六、呼吸缺陷型菌株的初筛 ..................................................................... 10 实验七、呼吸缺陷型酵母菌的验证 .................................................................. 11 综合项目三、谷氨酸发酵及提取工艺 ..................................................................... 12

实验八、谷氨酸菌种的制备 ............................................................................. 12 实验九、谷氨酸的中糖发酵及控制 ................................................................. 13 实验十、发酵液中谷氨酸的回收及精制.......................................................... 15 综合项目四、红曲发酵及红曲色素的提取 ............................................................. 17

实验十一、红曲液体菌种的制备 ..................................................................... 17 实验十二、红曲固体发酵 ................................................................................. 18 实验十三、红曲色素的提取及色价测定.......................................................... 19

综合项目五、糖化酶的发酵和提取………………………………………………….22 实验十四、培养基的配制和菌种活化 实验十五、糖化酶的摇瓶发酵

实验十六、糖化酶的提取、浓缩、活性测定

第二部分：设计性实验 ..................................................................................................... 25

设计性实验要求 ......................................................................................................... 25 设计项目一、摇瓶发酵法生产柠檬酸 ..................................................................... 26 设计项目二、 固体发酵法生产柠檬酸 ................................................................... 29 设计项目三、α-淀粉酶生产 ................................................................................... 32 设计项目四、酵母细胞的固定化 ............................................................................. 33 第三部分 附录 ................................................................................................................... 36

附录一、中试发酵设备的使用方法 ......................................................................... 36 附录二、气升式生化反应器的使用 ......................................................................... 38 附录三、发酵液中还原糖的测定方法 ..................................................................... 40 附录四、谷氨酸浓度测定法 ..................................................................................... 42 附录五、α-淀粉酶的测定方法 ............................................................................... 43 附录六、糖化型淀粉酶活力的测定 ......................................................................... 45 附录七、柠檬酸的检测…………………………………………………………… 48 附录八 原料中粗淀粉的测定…………………………………………………… ..49

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实 验 守 则

一、实验

1、

实验前认真做好课本有关章节的阅读及实验讲义的预习，简单了解实验装置的构造，掌握有关测量仪表的使用方法，确定实验方法和步骤，做好实验原始数据的记录。 2、

指导教师在实验前进行提问，如发现没有达到预习要求的同学，有权停止其参加当次实验。 3、 4、

操作过程应在装置指定范围内进行调节，注意观察实验现象，正确读取实记录。 注意节约水电、药品、物品、爱护仪器设备，实验结束，将设备、仪器整理复原，场地清扫，与实验无关的装置仪器不得挪用。 5、

实验室内保持安静，不得高声谈笑、喧闹，违者按破坏课堂纪律处理，实验结束后，所测数据经指导教师许可，方可离开。

二、实验报告

1、

实验报告内容包括：实验原理、流程简图、操作要点、数据图表（附原始记录、计算示例）主要结论，实验结果的分析。 2、

实验报告写在报告纸上，三天内交给指导教师。

三、注意事项

1、 2、

不碰摸与本实验无关的电源开关、电气设备、仪器。

仪器设备转动前，注意其周围是否有阻碍物，若发热或声音不正常，应及时停车检查。 3、

注意防止高压容器泄露和蒸汽管道烫伤事故的发生。

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第一部分、综合性实验

综合项目一、α-淀粉酶产生菌的分离与筛选

实验一、培养基配制及样品采集

一、实验目的

学习和掌握菌种选育技术中从自然界中采样的技术，掌握α-淀粉酶筛选的特异性培养基配制方法。 二、实验原理

自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，种类数量十分可观。但总体来讲土壤样品的含菌量最多，土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。但各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。因此，在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品。 三 实验材料

1. 采样器具：灭菌的牛皮纸袋、小铲刀（或不锈钢勺）、温度计、pH试纸、记号笔等。 2. 筛选培养基：斜面肉汤琼脂 + 1%可溶性淀粉 四、操作步骤 1. 采样：

用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好的塑料袋内扎好，或事先灭菌处理的牛皮纸袋、玻璃器皿内。北方的干燥土壤，可在10～30cm处取样。给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。

（注意：一般耕作土、菜园土和近郊土壤中有机质含量丰富，营养充足，且土壤成团粒结构，通气饱水性能好，因而，微生物生长旺盛，数量多，尤其适合于细菌、放线菌生长。山坡上的森林土，植被厚，枯枝落叶多，有机质丰富，且阴暗潮湿，适合霉菌、酵母菌生长繁殖，微生物数量相应也比较少。

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从土层的纵剖面看，1～5cm的表层土，由于阳光照射，蒸发量大，水分少，且有紫外线的杀菌作用，因而微生物数量比5～25cm的土层少；25cm以下土层则因土质紧密，空气量不足，养分与水分缺乏，含菌量也逐步减少。因此，采土样最好的土层是5～25cm。一般每克土中含菌数约几十万到几十亿个，并且各种类型的细菌和放线菌几乎都能分离到，如好气芽孢杆菌、假单胞菌、短杆菌、大肠杆菌、某些嫌气菌等。但总的说来酵母菌分布土层最浅，约5～10cm，霉菌和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层。） 2．筛选培养基配制：

筛选培养基配方（g/L）：牛肉膏3，蛋白胨10，氯化钠5，可溶性淀粉10，琼脂粉15，pH 7.5。每500ml三角瓶装200ml培养基，121℃灭菌20min，备用。

LB培养基斜面：牛肉膏3，蛋白胨10，氯化钠5，琼脂粉15，pH 7.5。培养基装试管，灭菌后摆斜面，备用。 3．无菌水制备

100ml三角瓶，加入9 ml蒸馏水，玻璃珠8颗，透气塞及牛皮纸（或报纸）封口，灭菌后备用。

试管10支，装9ml/支蒸馏水，透气塞及牛皮纸（或报纸）封口，灭菌后备用。 培养皿包封，灭菌后备用。

1ml吸管若干，棉花封口，报纸包扎后灭菌，备用。 涂布棒包扎后灭菌，备用。 五、思考题

1．你认为自然界中哪些地点更容易采集和分离到本试验的目标菌株？

实验二、样品处理及初筛

一、实验目的

学习从自然界中采集的样品中进行菌种分离的技术，掌握稀释涂布平板方法及透明圈法进行产α-淀粉酶产生菌的初筛的技术。 二、实验原理

菌株分离（separation）就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对他们进行分离、筛选，进而

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得到所需微生物的过程。菌株分离、筛选（screening）虽为两个环节，但却不能绝然分开，因为分离中的一些措施本身就具有筛选作用。工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需要的菌株，二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。

枯草芽孢杆菌在自然界中分布很广，常用来生产α-淀粉酶，在含淀粉质较多的环境中经常能够找到。由于其体内能够产生芽孢，能抗高热，所以，获得样品时可先加热，将其他非耐热的微生物杀死得以富集。

透明圈法是常见的初筛方法。在含有淀粉的平板上，由于枯草杆菌能够产生淀粉酶，因此，可将菌落周围的淀粉酶解掉，形成透明圈。所以，我们可以根据是否产生透明圈，来初筛目的菌。 三、实验材料

1. 培养基：筛选培养基。

2. 试剂：芽孢染色液、碘-碘化钾溶液。

3. 其他器具：超净工作台、显微镜、培养皿、水浴锅；涂布棒、三角瓶、接种环、酒精灯等。 四、操作步骤

1．样品稀释：称取土样1g，加入到备好的玻璃珠和无菌水的三角瓶内，振摇5 min。根据微生物稀释方法操作，稀释到10－3～10－6。

2．加热处理：将最后三支土样稀释液，置于100℃沸水浴3～5 min，灭活营养细胞，保留芽孢。

3．涂布平板和培养：筛选培养基倒平板，凝固后，处理好的三个稀释度的样品各取0.1ml涂布平板，30℃倒置培养。 五、思考题

你认为还有哪些方法对样品进行预先处理，有益于本试验目标菌株的获得？

实验三、α-淀粉酶产生菌的分离与筛选

一、实验目的

学习从初筛菌株中进行目标菌株的挑选以及复筛的方法技术，掌握透明圈法、变色圈

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法进行产α-淀粉酶产生菌的复筛的技术。 二、实验原理

分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计的。通过观察微生物在选择性培养基上生长状况或生化反应进行分离，可显著提高菌株分离纯化的效率。

在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。该法在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选择性培养基平板上形成肉眼可见的透明圈。在分离淀粉酶产生菌时，培养基以淀粉为唯一碳源，待样品涂布到平板上，经过培养形成单个菌落后，再用碘液进行鉴别，根据菌落周围是否出现透明圈来分离淀粉酶产生菌。透明圈与菌落直径的比例，可以反映菌株产酶能力的大小。 三、实验材料 1. 碘液制备

原碘液：称取分析纯结晶碘ll g，分析纯碘化钾22 g，注意：碘不好溶解，需要用研钵捣碎，最后达到完全溶解为之，定容至500mL，贮于棕色瓶内。

稀碘液：取原碘液2 mL，加碘化钾20 g，加蒸馏水溶解定容至500 mL ,贮于棕色瓶内。

四、操作步骤

1．单菌落挑取：

对平板上生长的单菌落进行编号，挑单菌落接种试管斜面保存（编号），并分别接种在同样平板培养基上，每个培养皿接不同的菌落4株（编号和标记）。置30℃培养箱培养。

2．初筛平板定性观察：

初筛平板浇上一层碘液，10分钟后观察，凡有无色透明圈即可看出它有淀粉酶产生。记录有淀粉酶产生的菌种号。

3．复筛平板的定性观察和定量测定：

培养二天后，浇上一层碘液，10分钟后观察，凡有无色透明圈即可看出它有淀粉酶产生。测量菌落直径与透明圈直径大小，计算透明圈直径/菌落直径的比值，挑取透明圈与菌落直径比大的菌株，用于做进一步的摇瓶筛选。 五、结果与讨论

提出一个你自己的更加高效、合理的菌株复筛方案。

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综合项目二、酵母菌的诱变育种

实验四、培养基配制和菌种活化

一、实验目的

学习制作适合于诱变处理的细胞的制备。 二、实验原理

通过人工方法可以使微生物发生突变，其突变率远远高于自发突变。再经过筛选和选育，可以简便、快速地筛选出不同类型的突变株，供生产和研究之用。人工诱变的突变是不定向的，但选择可以是定向的。

用来诱发突变的菌株称为出发菌株。出发菌株可以是自然界中分离出来的野生菌株，可以是生产中应用的自发突变菌株，也可以是已经诱发过的菌株。

诱变处理时应选择菌体生长的敏感期，如菌体的对数期，孢子或芽孢的萌发前期。选择孢子、芽孢，因其多为单核状态。一般制成单孢子或单细胞悬液，目的是能均匀接触诱变剂，并能减少诱变后件状的分离及退化现象。 三、实验材料

1.菌株：酒精酵母 2.CM培养基：

葡萄糖 40g MgSO4 2g 蛋白胨 10g 琼脂 15g 酵母膏 5g 水 1000ml KH2PO4 5g

不加琼脂即为液体CM，分装20ml于250ml三角瓶中。 3.TTC上层培养基

葡萄糖 5g TTC（红氮四唑） 0.5 g 琼脂 10g 水 1000ml 分装，58.84kPa灭菌 15min。 4.TTC下层培养基

葡萄糖 10g MgSO4 ?7H2O 0.4g 蛋白胨 2 g 琼脂 20 g

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酵母膏 5 g 水 1000 ml KH2PO4 1 g pH 5.5～5.7 5.MM甘培养基

酵母膏 6.7 g 甘油 20 ml 水 980 ml pH 5.5 琼脂粉 20 g 分装，58.84kPa灭菌 10min。

6．培养皿、涂布棒、稀释试管若干，1ml移液管（棉封）若干，牙签若干，包扎后灭菌备用。

7.恒温震荡器、培养箱 四、操作步骤

1. 菌种活化：保存菌种转接CM培养基斜面，30℃培养活化2天。

2. 培养基制备及其它材料的准备：按照要求准备各种实验用培养基，灭菌后备用。 3. 其它材料按要求准备：按照要求准备其它玻璃器皿，灭菌备用。 五、结果与讨论

讨论酵母细胞诱变处理的敏感期可以选择哪个阶段？

试验五、酵母菌的诱变处理

一、 实验目的

学习和掌握微生物的诱变处理方法。 二、实验原理

不同诱变剂诱变的作用强弱不同。微生物诱变剂常用紫外线、硫酸乙二脂、烷化剂等。诱变剂选择的原则是使用的方便性和有效性，获得高正变株出现率的就是有效诱变剂。诱变剂多为致癌剂，操作时要注意安全。

诱变剂剂量选择及处理时间一般以杀菌率控制。目前常采用剂量是杀菌率为30（70）—80%，杀菌率取决于剂量和作用时间及作用距离。用高剂量诱变剂处理获得的负突变率高，而在低的剂量中正突变率反而较高。

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三、实验材料 1.溴化乙锭 2.TTC（红氮四唑） 四、操作步骤

1．将准备好的CM固体培养基溶化后倒平皿，过夜，（检验是否无菌，干燥）。 2．取活化后的酵母菌1环，接入到三角瓶中液体CM培养基中，并加入诱变剂溴化乙锭10μg/ml，120rpm 、30℃震荡培养过夜，进行诱变处理。 五、结果与讨论

简述溴化乙锭的诱变作用机理。

试验六、呼吸缺陷型菌株的初筛

一、 实验目的

学习和掌握呼吸缺陷型菌株的初筛方法。 二、实验原理

许多突变株在菌落形态上会发生变异，所以通过观察菌落形态特征挑出突变株是进行初筛的有效手段之一。

在酵母中，呼吸缺陷型突变株是经常遇到的。在平皿培养后，一般为小菌落，这些小菌落丧失呼吸能力。产生这种变异的原因， 主要是细胞质基因发生突变，但有时核基因也会突变。小菌落突变后，对非发酵型底物如甘油、酒精、醋酸等不能氧化，但CO2放出高于对照株，酒精脱氢酶活力也较对照高出1倍左右，对提高酒精产率有好处。同样，呼吸缺陷型也是育种工作可利用的一个有效的遗传标记。 三、实验材料

1．TTC下层培养基 2．TTC上层培养基 3．灭菌的培养皿 四、操作步骤

1．将诱变处理过的酵母培养液适当稀释（稀释度初步10-3、10-4、10-5），涂布CM培养基平板，涂布后30℃培养24h。

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2．TTC下层培养基倒平板。

3．将CM培养基平板上长出的菌落点种 TTC下层平板上，30℃培养3d。

4. 培养3天后，将TTC上层培养基溶化并冷却（不烫手）后，小心倾入TTC上层培养基上，使其刚好掩埋菌落。等凝固后，30℃培养2～3h。此时，平板菌落颜色会区分成红色、粉红色和白色。呼吸缺陷型突变株为白色菌落。 五、结果与讨论

讨论呼吸缺陷型突变株为白色菌落为白色，其它菌株红色、粉红色的机理。

试验七、呼吸缺陷型酵母菌的验证

一、 实验目的

学习和掌握呼吸缺陷型验证方法。 二、实验原理

呼吸缺陷型酵母突变株对非发酵型底物如甘油、酒精、醋酸等不能氧化，因此不能在以甘油为唯一碳源的培养基上生长，利用这一特性可以进行呼吸缺陷型突变株的验证。 三、实验材料 1.CM培养基 2．MM甘培养基 3．灭菌的培养皿 4．无菌牙签。 四、操作步骤

1． 用无菌牙签将在TTC鉴别培养基上生长的白色小菌落分别点种到MM甘培养基和CM培养基上。注意点种时，先点MM甘培养基，后点种CM培养基，并在平皿上做好标记。30℃培养1d。

2． 观察记录MM甘培养基和CM培养基上菌落的生长状况，验证白色的小菌落是否是呼吸缺陷型突变株。 五、结果与讨论

如果白色小菌落分别点种到MM甘培养基和CM培养基上培养后都有生长，讨论有哪些原因？

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综合项目三、谷氨酸发酵及提取工艺

实验八、谷氨酸菌种的制备

一、

实验目的：

了解发酵工业菌种的制备工艺流程和质量控制方法，并为本发酵实验准备菌种。 二、

实验原理：

谷氨酸棒杆菌是一种好氧性细菌，在合适的培养基上经摇瓶培养能快速生长，可得到大量健壮的种子。处于旺盛生长的生长对数期的菌体适合作为种子。 三、

实验器材和药品：

试管、三角瓶、抽滤瓶、高压灭菌锅、摇床、培养箱、显微镜等。 四、

实验步骤：

1.斜面种子的制备

①将试管洗净，做好棉塞，并7支一组捆扎好，空消：0.10MPa，30min。

②按配方配制斜面培养基，加热将培养基溶解后分装到已消好的空试管中，装量约为1/5，灭菌后并摆成斜面。

③将做好的斜面37℃空培24h，检查确定无菌后备用。

④将保存的斜面菌种上的菌苔划线接种到新制斜面上，37℃培养24h，制成斜面菌种。 斜面培养基配方： 葡萄糖0.1% 蛋白胨1% 牛肉膏1.0% 氯化钠0.5% 琼脂2.0% pH值7.0

灭菌条件：0.1MPa，30min 2.一级种子培养

培养基配方： 葡萄糖 ：2.5% 尿素：0.5% 硫酸镁：0.04% 磷酸氢二钾：0.1% 玉米浆粉：0.5~0.6% 硫酸亚铁：2mg/L

硫酸锰：2mg/L pH 7.0

在500mL三角瓶中装入50mL培养基，8层纱布封口，0.10MPa表压灭菌30min，冷却后接种，接种量为一支斜面接一瓶。置旋转摇床上培养12h（转速170~190 r/min），培养温度30~32℃。

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3.二级种子培养 培养基配方：

葡萄糖 ：2.5% 尿素：0.34% 硫酸镁：0.04% 磷酸氢二钾：0.16%

玉米浆粉：0.5~0.6% 消泡剂：0.086ml/L pH 7.0

0.08MPa表压，30min灭菌，冷却接种后，摇床7~8h。二级种子的制备量按发酵罐投料量的10%的量准备。 五、思考题

种子制备过程中应注意哪些事项？

实验九、谷氨酸的中糖发酵及控制

一、 实验目的

了解发酵罐的操作程序和注意事项，完成谷氨酸发酵的全过程操作。 二、 实验原理

谷氨酸的生物合成包括EMP、HMP、TCA、乙醛酸循环、二氧化碳的固定反应等。谷氨酸产生菌丧失或仅有微弱的α-酮戊二酸脱氢酶活力，但谷氨酸脱氢酶活性很强，同时NADPH2再氧化能力弱，这样使α-酮戊二酸到琥珀酸的过程受阻，在有NH4+存在时，经过谷氨酸脱氢酶作用和还原氨基化反应生成谷氨酸。 三、 实验装置

发酵罐系统（发酵罐，蒸汽发生器，空压机）、恒温培养箱、分光光度计等。 四、 实验步骤 1. 投料

投料量：按发酵罐体积的70%配料。

配方： 葡萄糖： 160g/L 尿素 5 g/L 硫酸镁： 0.5 g/L 磷酸氢二钾： 1.5 g/L

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玉米浆 25~35 g/L 硫酸亚铁 20mg/L 硫酸锰 20mg/L

pH 7.0 2. 实消

注意罐压，控制0.1~0.11MPa，15min，通过蒸汽流量调节。 3. 接种

接种量为10%，通过接种管接种。 4. 发酵过程控制

（1） 温度控制：谷氨酸发酵前期为菌体生长期，最适温度30~32℃，后期为谷氨

酸产生期，产酸期温度控制在34~36℃。

（2） pH控制：发酵过程中产物的积累会导致pH下降，而流加氮源（氨水、尿

素）会导致pH升高。发酵中当pH降到7.0~7.1时，应及时流加氮源。菌体生长期（0~12h）控制pH不大于8.2（由尿素流加量、风量和搅拌转速来调节）；产酸期（12h以后）控制pH 7.1~7.2。 （3） 发酵过程中参数的记录和分析：

pH 2小时1次 pH计

还原糖 3小时1次 斐林试剂滴定法 谷氨酸 3小时1次

附录方法

菌体生长量 2小时1次 752分光光度计OD620nm 温度 2小时1次 温度计 风量 2小时1次 气体流量计

5. 放罐

残糖5g/L以下，耗糖速率缓慢时放罐。 四、实验结果与讨论

以时间为横坐标，OD620nm、残糖量、谷氨酸量为纵坐标，绘制发酵过程中参数变化曲线。

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实验十、发酵液中谷氨酸的回收及精制

一、 实验目的

1. 了解用等电点法从发酵液中回收谷氨酸的方法。 2. 掌握由谷氨酸制备谷氨酸钠的方法。

3. 掌握脱色、浓缩、结晶等单元操作的原理和方法。 二、 实验原理

谷氨酸的分离提纯，通常应用它的两性电解质的性质。通过谷氨酸的溶解度、分子大小、吸附剂的作用以及谷氨酸的成盐作用等，可以把发酵液中的谷氨酸提取分离出来。 三、 实验器材

无极速搅拌机、旋转蒸发器、恒温水浴锅、水环式真空泵、pH试纸、盐酸。 四、 实验步骤 （一） 等电点回收 1. 流程

发酵液——离心除菌体（5000rpm, 10min）——加盐酸——育晶2h（pH 4~5）——加盐酸——育晶2h（pH3.5~3.8）——加盐酸——育晶2h（pH 3.0~3.2）——加盐酸——搅拌育晶20h——沉淀4h——母液和细谷氨酸。 2. 等电点操作

（1） 先测定发酵液的体积、pH、谷氨酸含量和温度。若放罐的发酵液温度高，应先将发

酵液的温度冷却到25~30℃，消除泡沫后再开始调pH，用盐酸调到pH 5.0。 （2） 当pH达到4.5时，应放慢加酸速度，注意观察晶核形成情况，若有晶核形成，应停

止加酸，搅拌，育晶2~4h。若发酵不正常，产酸低于4%，pH调到3.5~3.8左右。 （3） 搅拌2h，以利于晶核的形成，或者适当加一点晶种刺激起晶。

（4） 搅拌，育晶2h后，继续加酸，耗时4~6h，调pH至3.0~3.2，搅拌2h后开大冷却水

降温，使温度尽可能降低。

（5） 到等电点pH（3.2）后，继续搅拌16h以上，停止搅拌静置沉淀4h，关闭冷却水，

吸去上层菌液，底部谷氨酸离心甩干。 （二） 谷氨酸钠的精制

回收的谷氨酸又称麸酸，并没有鲜味，用碳酸钠中和精制，在pH7.0左右得到谷氨酸一钠，在pH 9~10左右得到谷氨酸二钠。

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1. 流程：

谷氨酸——加水、活性炭、碳酸钠——中和——脱色——过滤——二次脱色——滤液——三次脱色——过滤——浓缩结晶——干燥 2. 操作

（1） 工艺条件：

湿谷氨酸：水=1：2

湿谷氨酸：碳酸钠=1：0.3~0.34 湿谷氨酸：活性炭=1：0.01 T=60℃，pH6.4（用试纸测）

（2） 在不锈钢桶内加入清水及活性炭升温至65℃，开始搅拌（60r/min）。投

入谷氨酸，缓慢、逐步加入碳酸钠中和到pH6.4（试纸），加热至65℃，继续搅拌约30min。

（3） 将澄清的脱色液加入旋转蒸发器（加料小于二分之一），真空度在

600mmHg以上，温度小于70℃，浓缩至34~34.5波美度，升温至80℃放料，冷却，搅拌2~3h后开冷却水降温，至室温。 （4） 分离：抽滤（工业滤布做介质）

（5） 烘干：鼓风干燥箱（温度小于60℃），即可得到味精原粉。

五、思考题

分析影响谷氨酸结晶的因素？

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综合项目四、红曲发酵及红曲色素的提取

实验十一、红曲液体菌种的制备

一、实验目的

了解红曲菌液体菌种的制备方法, 为红曲发酵实验准备液体种子。 二、实验原理

红曲霉菌是一种好氧性微生物, 除了能进行固体浅盘培养外, 还可以用液体摇瓶培养

的方法来获得种子。

液体菌种生产具有纯度高、活力强、繁殖快的特点，接种到固体培养料内有流动性好、萌发点多，菌丝生长迅速等特种点。液体菌种应用于生产与固体菌种相比有以下优点：菌种生产周期短；接种后，萌发点多；接种方便、成本低；适宜工厂化生产。液体菌种为固态发酵的集约化、标准化生产创造了更好的条件。 三、实验器材与试剂

1．菌种：红曲5003

2．玉米面液体培养基（g/L）：蛋白胨 20；玉米面 20；酵母浸粉 10；硫酸镁0.5；磷酸氢二钾 1；硫酸亚铁 0.1；pH 6.0。

3．恒温摇床, 超净工作台, 高压蒸汽灭菌锅等。

四、实验步骤

（1） 配制制玉米面液体培养基。500mL 三角瓶中装玉米面液体培养基 150mL, 包扎后

0.lMPa 灭菌 20 分钟。

（2） 玉米面液体培养基灭菌冷却后 , 每瓶中接入 1/4 支红曲斜面菌苔 ( 注意无菌

操作 ) 。

（3） 接种后置30℃恒温摇床中 180 rpm 摇瓶培养 3天。 五、思考题 :

比较液体种子与固体种子的优缺点。

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实验十二、红曲固体发酵

一、实验目的

了解固体发酵的工艺过程 , 在实验室中小规模制备红曲。

二、实验原理

红曲霉菌属真菌界(Eumycophyta)、子囊菌门(Ascomycota)、真子囊菌纲

(Euascomycetes)、散子囊菌目(Eurotiales)、红曲菌科(Monascaceae)、红曲菌属(Monascus)。由红曲霉接种于大米发酵得到的红曲是我国古代的一大发明，称为丹曲，至今已有1000多年的历史，很早就应用于食品着色、食品发酵以及中医中药。

红曲霉作为红曲的生产菌, 以其可产生大量天然色素而著称。红曲的应用主要有三方面：食品色素、药物和发酵食品。红曲色素是红曲霉在生长代谢过程中产生的天然色素，是红曲霉的次生代谢产物，具有热稳定性好，蛋白着色力强，色调柔和，可以提高加工制品对光和氧稳定等优点；而且红曲色素无毒性、无致突变作用，安全性很高，因此红曲可提供安全性高的天然色素。

1979年，日本学者远藤章从红曲发酵液中发现并分离得到能显著抑制体内胆固醇合成的活性物质Monacolin K后，人们开始对天然红曲及Monacolin类化合物给予了新的广泛关注。美国FDA于1987年正式批准美降脂药(洛伐他汀，即Monacolin K)用于临床。迄今为止，美国和日本等已开发出一系列他汀类药物如Lovastatin、Provastatin、Simvastatin和Atorvastatin等，其主要成分即为Monacolin类化合物。我国用红曲开发的降血脂药物及保健食品有血脂康、脂必妥和健心宝等。药理及临床实验显示，红曲不但有降血脂、降血压、降血糖功效，而且还有明显抑菌、增强免疫力、抗疲劳的作用。

国内红曲的生产现在普遍采用固态发酵的方法。 三、实验器材与试剂

蒸锅, 浅盘等。制曲原料 : 优质籼米。

四、实验步骤

1． 浸米 :25 ℃以上浸米 5—8h, 大米吸收水分约在 28%～30% 。

2．蒸米: 将浸好的米用清水淋去米浆水, 沥干, 即可蒸米。上汽火力要强, 待全部圆气以后，蒸煮3～5min, 出饭率在 135%, 饭粒呈玉色, 粒粒疏松, 不结团块。蒸米不能熟透。

3．摊凉接种: 将蒸熟的曲料倒在超净工作台上迅速打碎团块, 摊平冷却到 30～32 ℃

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然后, 每 1kg 米接种液体种子20ml, 充分翻拌混合均匀,操作要迅速, 以减少杂菌污染。 4．发酵: 将曲料摊在曲盘内, 厚度约 3-5cm。32～33 ℃保温保湿培养。每天翻曲一次，观察到曲粒表面略有干皮、少数曲粒略有微红斑点等现象时即可“吃水”, 使曲粒吸收一定水分, 以利菌丝逐渐向内生长。吃水方法: 一边拌曲，一边向曲盘中喷洒无菌水, 使曲粒表面润湿并微有发胀。培养3天后米粒逐渐成红色。观察记录色素产生的过程。

培养5-7天后，固态发酵结束的红曲置于鼓风干燥箱内50~60℃鼓风干燥。 5．成品质量检查

外观检查 : 曲粒表层光滑紫红, 曲粒中心呈玉色, 不得有空心和红心。曲粒断面菌丝均匀，具有红曲特有的曲香, 不得有酸气等不正常气味。

生物与理化项目检查: 水分12%以下 , 容量 (l00mL)44.5～46.5g, 淀粉含量

５９％～６２%, 无细菌和其他霉菌污染。 五、注意事项 :

注意发酵阶段控制品温。

六、思考题 :

影响红曲质量的因素有哪些 ?

实验十三、红曲色素的提取及红曲色价测定

一、实验目的

熟悉从红曲中分离代谢产物的方法，以及掌握红曲色素色价的测定方法。

二、实验原理:

红曲色素分为黄色素、橙色素和紫红色素，其中黄色素包括红曲素(Monascin)和黄红曲素(Ankaflavin)，橙色素包括红斑红曲素(Rubropunctatin)和红曲玉红素(Monascorubin)，紫红色素包括红斑红曲胺(Rubropunctamine)和红曲玉红胺(Monascoru- bramine)。凡色素的呈色都与其结构有着密切的关系，结构的形式与变化内在决定着物质的呈色与变色。

大米经红曲菌固体发酵后产生了一系列红曲菌的代谢产物, 但这些产物的量非常少, 大米仍占固体发酵产物的绝大部分体积, 为了降低运输成本, 常常要对红曲菌的代谢产物进行提取和浓缩。红曲的代谢产物中既有水溶性组分, 也有脂溶性组分, 因此可用 80%

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的丙酮(丙酮:水 =80：20)抽提。用 HCl 或 NaOH 处理可以将其中的酸溶性组分、碱溶性组分和中性组分分开。选择溶剂一般要注意以下四点：① 溶剂对所需成分的溶解度要大，对杂质溶解度要小，或反之。② 溶剂不能与天然药物成分产生化学反应，即使反应亦属于可逆性的。③ 溶剂要经济易得，并具有一定的安全性。④ 沸点宜适中，便于回收反复使用。

红色素能溶于80% 的乙醇中 , 可通过萃取从米粒中提取出来, 红曲色素在505nm 处有最大的吸收峰, 可用分光光度计来测定。 三、实验器材与试剂

旋转蒸发仪, 分液漏斗, 乙酸乙酯, 丙酮等，分光光度计,水浴锅,量筒,80%乙醇等

四、实验步骤 （一）色素提取：

1、取 200g 固体发酵之红曲, 在植物粉碎机中将其粉碎；

2、将红曲粉放于 500mL 三角瓶中, 加入提取液(丙酮 : 水 =80:20)300mL； 3、室温下浸提 1 天, 每隔 2 小时摇动一次, 过滤； 4、沉淀用同样提取液洗涤 2 次, 每次 100ml, 合并滤液； 5、在旋转蒸发仪中减压蒸去丙酮( 尚有水分 )；

6、用 l mol/L HCl 调残留液(约 l00mL)的pH至3.0, 加至分液漏斗中； 7、用 150mL 醋酸乙酯分次抽提；

8、以同样方法按下图分离碱(溶)性组分、中性组分和酸(溶)性组分, 观察各组分的颜色；

9、将各分离到的组分在旋转减压蒸发仪中蒸去溶剂, 低温保存。

（二）红曲色价测定：

1、称取红曲米样品 0.5g, 放入带有刻度的 lO mL 具塞试管中； 2、加入 80%的乙醇 8 mL, 摇匀, 60℃水浴保温萃取0.5h；

3、取出冷却, 用普通定性滤纸过滤入lO mL 量筒中, 用 80% 乙醇洗涤残渣 2 次, 合并滤液, 并用 80% 乙醇定容至10mL；

4、以 80% 乙醇作对照, 在 505nm 波长下, 用 lcm 比色皿测定样品的吸光度。 5、计算: 红曲色价(以lg样品计)=A505×lO×2 注意：发酵后期, 若红色素产生量多, 可稀释后测定。 五、注意事项 :

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备注：在设计实验方案时，我们提倡同学们相互讨论，不支持相互参考，坚决反对相互抄袭。

三、对于教学控制过程，要求如下：

1、设计性实验的设计方案需经教师审阅签字后，方可进行实验操作； 2、实验原始记录需经教师审阅签字后，方算完成了实验操作过程。

3、学生交实验报告时，需把经签字的设计方案和原始记录作为报告的附件一并交来，如没有这两个附件视作未做实验。

4、为了督促学生认真学习，促进学习积极性，激励他们多做实验，做好实验，凡是学生首次未设计好实验方案的，可以重新设计；未做好实验的，可以重做实验；未写好报告的，可以重做报告。 四、注意

学生们可以多选做实验项目，也可以多次作实验，请同学们在实验中开拓思维，提出更多、更好的实验方法和建议，并欢迎大家提出新的实验项目与想法。我们愿与同学们共同努力把设计性、研究性实验教学更进一步的开展起来。

设计项目一、摇瓶发酵法生产柠檬酸

一、实验目的

了解柠檬酸发酵原理与过程，掌握柠檬酸液体发酵及中间分析方法。 二、实验原理

黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径和HMP途径转变为丙酮酸；丙酮酸由丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和CO2，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬酸合成酶的作用下生产柠檬酸。黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA循环中的α-酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA循环变成“马蹄型”，代谢流汇集于柠檬酸处，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。其理论反应式为：

C6H12O6+1.5H2O → C6H8O7+H2O

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柠檬酸理论得率为106.7%，若以含一个结晶水的柠檬酸计为116.7%。 三、实验装置与流程 （1）实验装置与材料：

①装置：旋转式摇床、恒温培养箱、高速离心机（4000-6500r/min）。 ②菌种：黑曲霉CICC。

③材料：麸皮、马铃薯、薯干粉、蔗糖、玉米粉、大麦芽、大米、琼脂、淀粉酶（中温酶与高温酶）。

④器皿：15mL试管、100mL三角瓶、2000mL烧杯、500mL三角瓶、离心管若干。 ⑤试剂：0.1429M NaOH、1%酚酞试剂、斐林试剂甲、乙液、0.01%标准葡萄糖溶液。 （2）实验流程

保藏菌株→活化菌株（斜面培养）→200mL三角瓶麸曲培养→500-1000mL三角瓶液体发酵。 （3）斜面培养基

①马铃薯琼脂培养基：去皮马铃薯200g切成小块，加水约500Ml，煮沸30min，然后用纱布过滤，滤液加蔗糖20g,琼脂20g,溶化后自来水定容至1000mL，分装于经干热灭菌后的带棉塞试管内。于121℃灭菌20min，取出摆成斜面备用。

②麦芽汁琼脂培养基：2/3大麦芽和1/3大米磨碎成粉，按麦芽粉：水=1：4比例加水，置60℃下糖化4h至碘液显无色，然后离心15min，获得麦芽汁，调整浓度5°Bx，添加20g/L琼脂，分装于经干热灭菌后带棉塞试管内。于121℃灭菌15-20min，取出摆成斜面备用。

③一级种子（麸曲种子）培养基 A． 含麸皮的查氏培养基（g/L）：

蔗糖30、KNO3 1.0、K2HPO4 1.0、MgSO4·7H2O 0.5、KCl 0.5、FeSO4· 7H2O 0.01；调节pH 7.0~7.2，加水定容至1000mL，添加800g麸皮，搅拌至无干粉又无结团，分装入8-10个500mL三角瓶中，塞入8层纱布并包扎好。于121℃灭菌30min，趁热摇散，冷却至35℃备用。

B．麸曲培养基：

取新鲜麸皮，用60目筛子去细粉，按麸皮：水=1：（1.1-1.3）比例加水，拌匀至无干粉又无面团，或用水洗麸皮表面，挤至有水感而滴水为宜。上述麸皮装入500mL三角瓶中，每瓶装20g湿料，塞入8层纱布并包扎好。于121℃灭菌30min，趁热摇散，冷却至35℃

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备用。

④摇瓶发酵培养基：

方案1 取细度为40目以上的薯干粉6-8g，装入500mL三角瓶中，再加入100mL水和中温α-淀粉酶（5u/g甘薯粉），于75-80℃下液化15min，瓶口塞有8层纱布包扎好，于121℃灭菌20min，趁热摇散，冷却至35℃备用。

方案2 取细度为60目以上的玉米粉300g装入2000mL烧杯中，加入1000mL水和耐高温的α- 淀粉酶10—20 U/ g 玉米粉，加热至85 ℃,保温30 min , 碘液不变色后, 继续加热至100 ℃煮沸5 min ,趁热经过两层纱布过滤，滤液加水冷却并调整糖度至15-20%和蛋白质含量不超过4g/L,取过滤清液40mL分别装入500mL三角瓶中，瓶口塞有8层纱布包扎好，于121℃灭菌20min，趁热摇散，冷却至35℃备用。

方案3 去离子葡萄糖140g，硝酸铵2.5g，磷酸二氢钾2.5g，7水硫酸镁2.5g，Cu2＋ 0.06mg，Zn2+ 25mg，Fe2+ 1.3mg，Mn2＋ 1.0mg，去离子水至1000mL，pH 3.8。 四、实验步骤和方法 （1）种子制备

①斜面种子制备：用接种环挑取冰箱保存的斜面菌种一环于斜面培养基上，于30℃恒温箱中培养3～5d，待长出大量黑色孢子后，即成为活化的斜面菌种。

②孢子悬浮液制备：用无菌移液管吸取5mL无菌水至黑曲霉斜面上，用接种环轻轻刮下孢子，装入含有玻璃球的三角瓶中，盖好塞子震荡数分钟。每支斜面的孢子悬浮液可接2～3瓶麸曲三角瓶。

③麸曲孢子培养：吸取孢子悬浮液2mL接入上述麸曲培养基中，然后摊开纱布、扎好，并在掌心轻拍三角瓶，使孢子与培养基充分混合，于30～32℃下恒温培养1d后，再次拍匀，每隔12～24h摇瓶一次，孢子长出后停止摇瓶，这样继续培养4～5d，即成种曲。 （2）摇瓶发酵

将麸曲孢子（或直接将斜面种子）接种于上述方案1、方案2的摇瓶发酵培养基中。接种量：一支斜面接种4-5瓶，一瓶麸曲孢子接种20～35瓶。500mL三角瓶装液量为40mL，于转速为200r/min（24h前为100 r/min，24h后为200 r/min）、300 r/min（24h前为100 r/min，24h后为300 r/min）旋转摇床上，30℃培养3～4d.

方案3：装液量：50ml/500ml三角瓶。接种量：8×104ml个孢子/ml发酵液。置于旋转式摇床（振幅25mm，转速270r/m）30℃，震荡培养9天。（此可获得72%的糖转化为柠檬酸，菌体为小的沉淀体，直径0.1~0.5mm）

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（3）发酵检测

①发酵0、24、48、72、96h分别各取下两瓶检测残糖、柠檬酸含量，以观察发酵过程中的黑曲霉的耗糖与柠檬酸的生成速率。

②柠檬酸含量的检测：一般测定发酵过程中的总酸，采用0.1429mol/L NaOH溶液滴定发酵过滤清液。

③总糖和残糖测定采用斐林试剂法测定，见附录。 五、实验结果与记录

黑曲霉柠檬酸摇瓶液体发酵 发酵时间/h 0 样本 瓶1 瓶2 24 瓶1 瓶2 48 瓶1 瓶2 72 瓶1 瓶2 96 瓶1 瓶2 残糖/% 柠檬酸含量/% 糖酸转化率/% 反应条件：24h前为100 r/min，24h后为200 r/min。

设计项目二、 固体发酵法生产柠檬酸

一、实验目的

1、学习掌握固体发酵的原理和方法。

2、学习掌握柠檬酸发酵的原理、过程和产物提取的方法。 二、实验原理

我国在20世纪40年代初期开始浅盘发酵生产柠檬酸，60年代后开始采用深层发酵法生产柠檬酸。原理同实验四。能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉及

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葡萄孢霉中的一些菌株都能利用淀粉质原料大量积累柠檬酸。本实验是以玉米粉为原料，利用黑曲霉菌种经过固体发酵生产柠檬酸。 三、仪器、材料和试剂 （1）仪器

恒温培养箱、振荡器、离心机 （2）材料

黑曲霉、麸皮、米糠、玉米粉、蔗糖、硝酸钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、硫酸亚铁、碳酸钙、硫酸、正丙醇、浓氨水、活性炭、阳离子树脂、500ml三角瓶、搪瓷盘、新华3号滤纸、毛细管、分液漏斗、层析缸、马铃薯等。 （3）培养基配方 查氏培养基：

蔗糖30g，KNO3 1g，K2HPO4 1g，MgSO4.7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4.7H2O 0.01g，调节pH值至7.0～7.2，加水定容至1000ml。 一级种子培养基

含麸皮（10%）的查氏培养基。 二级种曲培养基

麸皮30g，米糠12 g，水20 ml，调pH 至5.0，装入500 ml三角瓶中， 8层纱布封口。 发酵培养基

玉米粉400，麸皮50，米糠50，水200mL，拌匀后装入大搪瓷缸。 上述培养基经高压蒸汽灭菌后备用。 （4）试剂配制 ①0.1%酚酞指示剂 ②0.04%溴甲酚绿乙醇 ③0.1 mol/L的NaOH溶液 ④2%标准柠檬酸溶液

⑤展开剂：正丙醇:浓氨水=3:2（v/v） 四、实验步骤及方法

1．种子制备

(1) 一级种子的制备：用接种环挑取冰箱中保存的菌种接种于一级种子培养基斜面上，于28℃恒温培养箱培养3～5天，待长成大量黑色孢子后即成为一级种子。

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(2) 孢子悬液的制备：在一级种子斜面菌种管中加入10mL无菌水，用接种环搅起黑曲霉孢子，在振荡器上振荡两分钟制成均匀的孢子悬液。

(3) 二级种曲的制备：吸取孢子悬液1mL于装有种子培养基的三角瓶中，然后摊开纱布，扎好，并在掌心轻拍三角瓶，使孢子培养基充分混合，于28℃恒温培养箱中培养1天后，再次拍匀三角瓶内培养物，继续培养3～4天即成种曲。 2、 发酵培养

(1) 接种与摊盘：将灭菌的发酵培养基倒入灭菌的搪瓷盘中，厚度约1-2cm，待培养基冷却到30℃左右时均匀拌入1%的种曲，在培养基上覆盖两层灭菌纱布。 (2) 发酵培养：摊盘之后，将搪瓷盘放在恒温培养箱中，并在培养箱中放置一个盛有清水的小搪瓷盘，以维持培养箱中的湿度，30℃培养24h后翻曲一次，并将培养箱的温度调整至28℃，继续发酵4~5天。 3、 柠檬酸提取

发酵结束后，将培养物倒入一个大烧杯中，加入蒸馏水，加水比1：3，搅匀，浸泡1h,用两层纱布过滤。将滤液加热到100℃处理10min，离心（3000r/min,10min）以除去蛋白质、酶、菌体、孢子等其他杂质。向清液中加碳酸钙进行中和(每100g柠檬酸加入71.4kg碳酸钙，一定要控制好终点，过量的碳酸钙会造成胶体等其他杂质的沉淀而影响质量)。继续加热至90℃，反应30min，中和终点用NaOH滴定，此时柠檬酸以钙盐的方式析出。 4、 酸化

将柠檬酸钙加水搅成糊状，在不断搅拌下将硫酸缓慢加入，用量为碳酸钙的85%-90%，酸解的温度应控制在80℃以上。当加入足量的硫酸时，柠檬酸就游离出来。3000r/min离心10min收集上清。 5、 脱色和离子交换

用活性炭进行脱色，用阳离子树脂去除各种阳离子，当流出液pH 为4.0时，表示有柠檬酸流出，开始收集。 6、 总酸量测定

精确吸取所收集的上清液1mL，加2-3滴酚酞试剂，用0.1M 的NaOH溶液 进行滴定至微红色，计算用去的NaOH的毫升数，计算柠檬酸的百分含量。 7、柠檬酸的测定：（参见附录七） 8、 纸层析鉴定

(1) 点样：在距新华滤纸底端2.5公分处划一道横线，用毛细管将2%的标准柠檬酸溶

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液和上清液点在滤纸的横线上，每个样品间距2公分。

(2) 层析：将点好样的滤纸做成圆筒状，置于含有展开剂的层析缸中，于20~25℃条件上行扩展20-25cm后取出，用吹风机吹干溶剂。 (3) 显色：层析滤纸用溴甲酚绿乙醇喷雾显色。

设计项目三、α-淀粉酶生产

一、实验原理

α-淀粉酶是我国目前用途最广泛、产量最大的工业酶制剂种类之一，在酶制剂生产中占有重要地位，应用领域主要集中在淀粉加工业、纸浆制造、纺织工业、酿造酒精及饲料加工业等。国内主要采用解淀粉芽孢杆菌BF7658及其变异菌株，以液体深层发酵法(Submerged fermentation, SmF)生产中温α-淀粉酶，也有许多厂家生产高温α-淀粉酶，但高温α-淀粉酶毕竟不能完全代替中温α-淀粉酶，许多场合由于工艺等原因必须采用中温α-淀粉酶。

利用固态发酵法(Solid-state fermentation，SSF)生产α-淀粉酶具有生产效率高、工艺简单、操作粗放、能耗少、废液少、产物分离较容易等优点，因而与SmF法相比生产成本较低。

二、菌种与培养基

1．菌种

解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens 2．斜面培养基

牛肉膏10.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaC 15g/L，可溶性淀粉10.0 g/L，琼脂20.0 g/L，pH 6.5～7.0，0.1 MPa蒸汽灭菌20 min。

3．液体种子培养基

牛肉膏10.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5 g/L，可溶性淀粉5 g/L，pH 6.5～7.0，0.1 MPa蒸汽灭菌20 min。

4．三角瓶固体发酵培养基

250 mL的三角瓶中，加15 g麸皮和20 mL水，0.1 MPa灭菌30 min。 三、试验步骤

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1．培养条件

保藏菌种在斜面上活化一代(37 ℃培养24 h)，然后挑取一环接入种子培养基，37 ℃下于旋转式摇床200 r／min培养10 h，再按一定的接种量（0.5%）接入三角瓶固体发酵培养基，在37 ℃培养60 h。

2．酶活测定

按附录方法测定α-淀粉酶活力。 3．发酵产酶曲线的确定

分别在12、24、36、48、60、72、84hr取样分析，测定酶活力，以培养时间为横坐标，干曲酶活力（u/g）为纵坐标，做产酶标准曲线。

四、思考题

试比较固态发酵和液态发酵的优缺点。

设计项目四、酵母细胞的固定化

一、实验目的：

学习固定化的原理，了解固定化细胞在实际中的应用。 二、实验原理：

固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术 , 包括包埋法、化学结合法 ( 将酶分子或细胞相互结合 , 或将其结合到载体上 ) 和物理吸附法。一般来说 , 酶更适合采用化学结合和物理吸附法固定化, 而细胞多采用包埋法固定化。这是因为细胞体积大, 而酶分子很小，体积大的细胞难以被吸附或结合, 而酶分子容易从包埋材料中漏出。

本实验采用包埋法固定化酵母活细胞, 即将酵母活细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中。常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。本实验选用海藻酸钠作为包埋材料。 三、试剂与材料： （1） 酿酒酵母 （2） 海藻酸钠 （3） 氯化钙

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（4） 玻璃棒、烧杯、三角瓶、温度计、吸管、培养箱等。 四、实验步骤

1．酵母细胞的活化：称取 lg 干酵母, 放入 50mL 的小烧杯中, 加入蒸馏水lOmL, 用玻璃棒搅拌, 使酵母细胞混合均匀, 成糊状, 放置 lh 左右, 使其活化。

2．配制浓度为 0.05mol/L 的 CaCl2 溶液： 称取无水 CaCl2 0.83g , 放入 200mL 的烧杯中, 加入150mL 的蒸馏水, 使其充分溶解, 待用。

3．配制海藻酸纳溶液： 称取 0.7g 海藻酸钠 , 放入 50 mL 小烧杯中 , 加入 10mL水 ,加热, 边加热边搅拌, 将海藻酸钠调成糊状, 直至完全溶化, 用蒸馏水定容至10mL。注意：加热时要用小火, 或者间断加热, 反复几次, 直到海藻酸钠溶化为止。

4．海藻酸纳溶液与酵母细胞混合： 将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温 , 加入已活化的酵母细胞, 进行充分搅拌, 使其混合均匀。

5．固定化酵母细胞：用滴管以恒定的速度，缓慢地将海藻酸钠酵母溶液滴加到配制好的CaC12 溶液中, 观察液滴在CaC12 溶液中形成凝胶珠的情形，浸泡30min左右。

6．凝胶珠滤出备用。 五、注意事项：

海藻酸钠在水中溶解的速度较慢, 需要通过加热促进其溶解。溶解海藻酸钠，最好采用小火间断加热的方法。 例如, 加热几分钟后, 从石棉网上取下烧杯冷却片刻, 并不断搅拌, 再将烧杯放回石棉网继续加热, 如此重复数次, 直至海藻酸钠完全溶化。如果加热太快, 海藻酸钠会发生焦糊。 六、思考题

利用固定化细胞与直接利用细胞有什么不同？

固定化酵母细胞的活性检测

一、实验目的：

学习和了解固定化细胞在实际中的应用。 二、 实验原理：

固定化技术是利用物理或化学方法，将酶或细胞固定在一定空间内的技术 , 包括包埋法、化学结合法和物理吸附法。一般来说 , 酶更适合采用化学结合和物理吸附法固定

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鲁东大学生命科学学院 2010 生物技术专业《生物技术综合实验》实验指导

化, 而细胞多采用包埋法固定化。这是因为细胞体积大, 而酶分子很小，体积大的细胞难以被吸附或结合, 而酶分子容易从包埋材料中漏出。

本实验采用包埋法固定化酵母活细胞, 即将酵母活细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中。常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。本实验选用海藻酸钠作为包埋材料。

一、 试剂与材料： 1．10% 的葡萄糖溶液。 二、 实验步骤

1．将固定好的酵母细胞(凝胶珠)用无菌水冲洗2～3次。

2．将 150 mL 质量分数为 10% 的葡萄糖溶液转移到 200mL 的锥形瓶中 , 再加入固定好的酵母细胞, 置于30℃下发酵 12-24h。

3．观察用固定化酵母细胞进行葡萄糖溶液发酵的过程, 观察是否有气泡产生以及凝胶珠的沉浮状态, 闻闻是否有酵母发酵产生的酯香味和酒味。 五、思考题

1．请你创意一种固定化细胞的家庭应用方案。

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