组织培养实验一1

实验一 植物组织培养实验的准备 （一）、实验室的设计与布局

1、目的要求

通过认知实习，了解植物组织培养实验室的布局，掌握植物组织培养的程序，同时熟悉组织培养中涉及的各种仪器设备和器皿用具。 2、仪器与用具

超净工作台、蒸馏水发生器或纯水发生器、高压灭菌器、普通冰箱、微波炉、煤气灶或电炉、显微镜、万分之一（或千分之一）电子天平、恒温箱、烘箱、各种培养器皿、分注器、各种实验器皿和各种器械用具。 3、方法步骤

1．结合所学理论知识，学习组织培养实验室守则及有关注意事项。 2．了解植物组织培养的具体流程。

3．了解组培实验室的构建情况，包括准备室、缓冲室、无菌操作室（又称接种室）和培养室的设计要求。

4．了解仪器设备的名称、用途及使用方法。

5．了解实验室中培养材料的一些常用参数，如培养间的温度、光照时数、光照度等。 4、作业

1．植物组织培养实验室一般由几部分构成？各个部分的功能主要有哪些？植物组织培养常用的设备有哪些？

2．每人设计一个植物组织培养实验室的组建方案。

（二）、培养器皿的洗涤

1、目的要求

了解各种洗涤液的特性，掌握酸液的配制方法和组织培养中常用器皿的洗涤技术。 2、基本原理

由于组织培养过程中器皿的重复利用，特别是培养基中有机物质及培养组织分泌物的附着，影响再次培养，导致实验结果发生误差，甚至使培养组织受到毒害。同时，一些新制玻璃器皿，都部分的存在碱性游离物，也影响到实验结果的准确性。因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，使其达到不留任何残留物的要求。因不同培养器皿的材料、结构、使用方法不同，清洗的方法也不同。 3、试剂与主要用品

（1）．仪器用具 毛刷、塑料盆、天平、量筒、烧杯、洗耳球、洗刷装置（全自动洗涤机）、高压灭菌器、耐酸手套、玻棒、需洗涤器皿等。

（2）．试剂 肥皂粉、洗衣粉、去污粉、洗洁精、重铬酸钾、浓硫酸、蒸馏水、纯乙醇或95%的乙醇等。 4、操作步骤

（1）玻璃器皿的洗涤（酸洗）

玻璃器皿的洗涤一般要经过浸泡、刷洗、浸酸和清洗四个步骤。 ①．浸泡 新的或用过的玻璃器皿都需要先用清水浸泡，以软化和溶解附着物。新购置的玻璃器皿含有游离碱，应先用自来水简单冲

洗，再用1%～5%的HCl浸泡过夜；用过的玻璃器皿往往附着有大量有机物质及培养组织的分泌物，干涸后不易涮洗掉，故用后应立即浸入清水中以备刷洗；被杂菌污染的培养瓶或培养皿等玻璃器皿，应先高压灭菌20min，倒掉污染的培养基后，再浸入清水中浸泡以备刷洗。 ②．刷洗 将浸泡后的玻璃器皿放入肥皂液或洗衣粉液中，用毛刷反复刷洗，刷洗中要不留死角，并防止破坏玻璃表面的光洁度。将刷洗过的玻璃器皿冲洗干净、晾干，准备浸酸。

③．浸酸 将上述玻璃器皿浸泡到重铬酸钾洗涤液（又称酸液）中，通过酸液的强氧化作用清除器皿表面残留的物质。根据洗涤液中含硫酸的比例，将洗涤液分为强酸，次强酸和弱酸三种（表2-1）。根据需要配制洗涤液，洗涤液对玻璃无腐蚀作用，去污效果好，用其洗是保证器皿洁净的关键一环。

配制洗涤液时，操作者必须小心认真，戴耐酸手套和防护眼镜，并严格按下列方法进行。

表1 重铬酸钾洗涤液的配方

成 分 重铬酸钾（g） H2SO4 (ml) 蒸馏水(ml)

强 液 63 1000 200

中 液 120 200 200

弱 液 100 100 1000

（1）按配方称量好重铬酸钾和蒸馏水，然后将重铬酸钾完全溶于蒸馏水中（可加热）。

（2）按配方把工业用浓硫酸缓慢（以产热很少为宜）加入冷却的（1）

中，边加边搅拌。

（3）自然冷却、备用。洗涤液为强氧化剂，去污力强，可以洗去玻璃器皿或瓷质器皿上的有机物，切不可洗涤金属器皿。配制、盛装洗涤液的容器应防酸、耐热、有较大的开口，一般用瓷缸、玻璃制品或耐酸塑料制品。洗涤液在使用过程中和使用后都应保持密闭，防止氧化变质。新配制的洗涤液呈棕红色，当使用时间过久，洗涤液的颜色变暗、发绿或浑浊时，应弃去（深埋地下），重新配制新的洗涤液。

一般来说，新的和用过的玻璃器皿都应浸酸，那些无法用毛刷刷洗的用品（如吸管、滴管等）更要靠浸酸去除污物。浸酸时，器皿应完全被洗涤液充满和覆盖。浸酸时间不少于6h，一般要过夜或更长时间。将器皿放入洗涤液时，应小心操作，防止伤及皮肤、眼睛或衣服。从洗涤液中取出器皿时，应沥干洗涤液，并将浸酸的器皿放入合适的容器，如塑料盆中运输。

④．冲洗 刷洗和浸酸后的器皿都必须用水充分冲洗，浸酸后器皿是否冲洗的干净，直接影响到组织培养的成败。冲洗可用洗涤装置，也可手工操作。手工洗涤浸酸后的器皿时，每件器皿都至少要重复“注满水——倒空”15次以上，最后用蒸馏水浸洗2～3次，晾干或烘干后包装备用。

载玻片与盖玻片的洗涤：先用流水冲洗，再将其浸入含有1%～2%盐酸的95%乙醇液中浸泡6～12h，流水冲洗后再浸入加了1～2滴氨水的80%的乙醇中1h，取出用绸布擦干，保存在载玻片盒或培养皿中备用。

（2）橡胶制品的清洗

新购置的橡胶制品（如胶管，胶塞，橡皮乳头等）的洗涤方法如下：0.5mol/L的NaOH煮沸15min-→流水冲洗-→0.5 mol/LHCl 煮沸15min-→流水冲洗-→自来水煮沸2次-→蒸馏水煮沸20min-→50℃烘干备用。用过胶塞的洗涤方法基本同玻璃器皿，但胶塞洗刷的重点部位是胶塞使用面，应逐个刷洗。 （3）塑料制品的清洗

塑料制品的特点是：质地软，易出现划痕；耐腐蚀能力强，但不耐热。其清洗程序为：使用器皿后立即用流水冲洗-→浸于自来水中过夜-→用纱布或棉签蘸50℃洗涤液的刷洗-→流水冲洗-→晾干-→浸于洗涤液中15min-→流水冲洗15～20遍-→蒸馏水浸洗3次-→晾干备用。

（4）大量培养瓶的清洗（碱洗）

在规模化的组织培养生产中，对大量的培养瓶用洗衣粉进行洗涤后，用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗2～3次即可，将瓶倒置晾干备用。被杂菌污染的培养瓶等玻璃器皿，应先高压灭菌20min，倒掉污染的培养基后，再按照上述方法洗涤。 5、作业

1．各种培养容器、器皿洗涤方法有何不同？

2．碱洗、酸洗的作用是什么？配制酸液时应该注意哪些事项？

(三) 植物组织培养中常用设备和仪器的使用

1、目的要求

通过实训，掌握植物组织培养的主要设备和仪器的使用方法、操作规程及保养方法等。 2、仪器和设备

电子分析天平、超净工作台、高压灭菌器、酸度计等。 3、方法步骤

（Ⅰ）电子分析天平（感量0.0001g）

以FA/JA型多功能电子天平为例说明电子天平的使用方法，这里重点介绍几个常用功能键的操作方法。

①．天平的放置 天平应置于稳定的工作台上，避免震动、阳光照射和气流干扰。 ②．操作方法

（1）天平调平 在使用前观察水平仪，如水平仪水泡偏移，需调整水平节脚，使水泡位于水平仪中心。

（2）开机 接通电源。天平通电后就开始工作（显示器未工作），通常需预热（15min）以后，方可开启显示器进行操作使用。 （3）开启显示器键（ON） 只要轻按一下ON键，显示器全亮“±8888888%”对显示器的功能进行检查，约2秒后显示天平的型号，例如：“-1004-”，然后是称量模式“0.0000g”。

（4）清零、去皮键（TAR） 置称量容器或称量纸于秤盘上，显示出容器或称量纸的质量，然后轻按TAR键，显示消隐，随即显示

“0.0000g”，容器或称量纸质量值已去除，即去皮重。

（5）称量 用试剂勺轻轻将试剂置于称量容器或称量纸中，称取所需要的量。试剂不可掉在容器或称量纸外。

（6）关闭显示键 移去称量容器或称量纸，轻按OFF键，显示器熄灭，清扫电子天平。若要较长时间不再使用天平，应从电源插座上拔下插头。

（Ⅱ）梅特勒-托利多320pH计

1．设置校准点 要获得最精确的pH值，必须周期性的校准电极。320pH计允许选择一组（三种）校准缓冲液。校准时可采用所选之缓冲液组中的两种溶液。有三组缓冲液供选择：

组1（b=1）：pH 4.00、7.00、10.00； 组2（b=2）：pH 4.01、7.00、9.21； 组3（b=3）：pH 4.01、6.86、9.18。

按下列步骤选择校准缓冲液：按“on/off”关闭显示屏。按住“mode”且再按“on/off”。松开“mode”显示屏显示b=1（或选择的缓冲液组）。按“cal”显示b=2，或b=3，按“read”在缓冲液组显示时选择合适的组别。即使断电，320pH计也可保留此项设置，不需要经常进行此项设置。

2．校准pH电极 如果使用ATC探测器（或含ATC的电极），缓冲液温度会被测定并补偿。如果不使用ATC探测器，320pH计则认为温度是25℃。

第一点校准：选用与pH7接近的缓冲液校准第一点，将电极放入

第一个缓冲液并按“cal”，320pH计在校准时自动确定终点（即显示该缓冲液的pH值），要人工定义终点，按“read”，当到达终止时指示器显示相应的缓冲液pH值。

第二点校准：应使用与被测样品接近的缓冲液进行第二点校准操作。因植物组织培养的培养基大多数pH范围为5.5～6.0，因此宜选用4.00（或4.01）的缓冲液。将电极放入第二种缓冲液，按“cal”，并按第一点校准步骤操作。当显示静止时电极斜率值会简要显示。

注意：校准pH电极的两种缓冲液pH应与设置的校准点缓冲液一致。例如：设置校准点为组3（b=3），则校准pH电极第一点时缓冲液应为pH6.86，第二点时缓冲液应为pH4.01。

3．测定pH值 要测定某一样品的pH，将电极放入样品中并按“read”启动测定过程，小数点会闪动。显示屏同时显示数字式及模拟式pH值。 4．注意事项

（1）在使用电极之前，将保湿帽从电极头处拧去，并将橡皮帽从填液孔上移走。

（2）在将电极从一种溶液移入另一溶液之前，需要用蒸馏水或下一个被测溶液清洗电极，用吸水纸将水吸干，切勿擦拭电极，否则会产生极化和反应迟缓现象。

（3）小心使用电极，切勿将之用作搅拌器。在拿放电极时勿触碰电极膜。电极膜的损伤会导致精度降低和反应迟缓现象。 （4）测定小体积样品时，请确保液体连接部能被浸没。

（5）使用结束时，电极需在填充液内保存，不能使其干燥！ （Ⅲ）立式压力蒸汽灭菌器

1．结构与特点 以上海医用核子仪器有限公司生产的LS-B50L型立式圆形压力蒸汽灭菌器为例说明其使用方法。灭菌器内装电加热器、灭菌计时器、压力温度自动控制调节器、安全阀、放汽阀、压力温度指示表以及灭菌结束报警器和自动切断加热电源等装置。 2．高压灭菌器操作程序 加水-→放置需灭菌器物-→密封-→预置灭菌温度-→设置灭菌时间-→加热（排放冷空气）-→灭菌-→结束。 （1）加水。打开灭菌器盖，取出灭菌桶，向灭菌容器内注入清洁软化水，水位应浸没容器内水位标志。

（2）堆放。将被灭菌之物包扎好后，顺序放置在灭菌桶内的筛板上，包与包之间必须留有适当的空隙。

（3）密封。灭菌桶放入主体后，将灭菌器盖盖好，按顺序将相对方位的紧固螺栓予以均匀地旋紧，使盖与桶体密合，不宜旋得太紧，以免损坏橡胶密封垫圈。打开放汽阀，安全阀不可打开。

（4）预置灭菌温度。预置灭菌温度是通过压力——温度控制器旋钮预置，温度预置范围109℃～126℃。顺时针方向旋转钮，灭菌温度预置值减小，反之，预置值增大。满刻度值为126℃，可根据需要预置灭菌温度（见图3-1）。

（5）设置灭菌时间。按照不同的灭菌物品，将计时器旋钮按顺时针方向旋至所需的时间刻度上。培养基常用的灭菌时间为20min。

图3-1 灭菌器上的压力控制器、定时器、防汽阀

（6）加热—排冷空气。首先合上漏电过载保护器开关，将电源按至“开”位置，电源指示灯亮，灭菌器进入等待状态，当预置灭菌温度，预置灭菌时间后，灭菌器自动进入加热程序。“加热”指示灯亮，电热管工作。开始加热时应将放汽阀扳手拨至放汽位置（见图3-1），使灭菌器内冷空气排放，待有较急促的蒸汽喷出时，将扳手拨至关闭位。此时压力表随着加热逐渐上升，指示出灭菌器内的压力。 （7）灭菌。当灭菌器内蒸汽压力、温度升至预置灭菌温度值时，加热灯由“亮”变“熄灭”，同时计时指示灯“亮”，灭菌计时器自动进入并自锁，开始计时。此时应微调压力——温度控制器，使灭菌器压力——温度值达到预置值，确保灭菌效果。在预置灭菌时间内自动进入恒温控制程序，电热管自动间歇工作。待灭菌时间到达设置时间后，灭菌结束，蜂鸣器发出响声，自动切断加热控制电路。 （8）结束。将“电源”接至“关”位置。如消毒灭菌物品为溶液和培养基等，在灭菌结束后，切忌立即放汽，否则会由于压力突然降低而剧烈沸腾，导致瓶子破裂溶液溢出。应让其自然冷却，容器内压力因冷却而下降至接近“零”位时，再将放汽阀打开，方能打开灭菌器盖取出灭菌桶。 3．注意事项

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