miRNA研究方法

miRNA研究方法

尽管早在1993年，科学家就发现了第一个microRNA，但直到2003年以后，这种小RNA分子的大作用才不断被发现。研究显示：miRNA通过与转录本的相互作用，关闭或抑制基因的表达，影响了30%的基因。miRNA在多个组织中，例如正常和肿瘤组织中差异表达。因此，通过表达谱分析寻找疾病相关miRNA并进行发病机理研究，最终应用于肿瘤诊断和治疗，已经成为目前miRNA研究的重要方向。在研究中，从深度测序、miRNA芯片到通过导入化学合成的mimics/antagomirs等实现miRNA过表达和抑制，都是研究中常用的方法。同时，在miRNA研究中，生物信息学分析扮演着越来越重要的角色。

下表介绍了miRNA研究和应用中科学家关注的主要科学问题以及目前常用的研究方法。

miRNA主要研究技术

深度测序 抽提分离小分子（例如18-30nt）RNA，通过RT-PCR扩增之后，利用solexa深度测序，并进行生物信息学分析，获得miRNA表达谱。深度测序结合生物信息学分析手段，可以对海量数据进行分析，分别统计出已知的miRNA（miRNA-known）、新的miRNA（miRNA-new）以及可能的新miRNA（miRNA-cadidate new），并对新发现的miRNA进行靶基因分析，功能预测等。通过深度测序的方法，可以发现新的miRNA，为进一步的深入研究奠定基础。

miRNA芯片 利用miRNA芯片（例如Agilent miRNA芯片），可以高通量分析miRNA表达的时空特异性、不同样本（例如癌组织和癌旁组织）中miRNA的差异表达，进而进行把基因分析，功能注释、通路分析，网络分析等，以了解miRNA在疾病发生中的作用。与深度测序不同，miRNA芯片针对已知miRNA进行研究。筛选到的差异miRNA可以利用q-pCR进行验证。

q-PCR q-PCR技术可以用来检测miRNA以及其靶mRNA和相关mRNA等的检测，主要方法有茎环法和加尾法等。前者针对特定miRNA设计引物，特异性好，然而成本较高，周期长；后者采用通用引物，时间短，通量较大。

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Mimics以及Antogomirs 通常基因功能研究常常采用过表达或干涉（抑制、敲除）等方法，miRNA研究也不例外。通过导入化学合成的小分子miRNA mimics

或拮抗miRNA 的antagomir，观察靶mRNA及编码蛋白表达以及细胞、动物水平的表型变化，进行信号通路研究，是目前miRNA功能研究的常用方法。

萤光素酶报告系统 在确定了靶mRNA之后，找到位于3ˊ-UTR区的miRNA结合位点是研究者下一步关心的内容。通过生物信息学分析获得候选的miRNA结合区域，将野生型和结合位点突变的3ˊ-UTR序列克隆入商品化的萤光素酶报告载体（例如pMIR-REPORT? miRNA Expression Reporter Vector系统），通过观察miRNA对发光强度的影响对结合位点加以验证。

miRNA的研究方法还有很多，例如磁珠流式细胞仪分析miRNA表达谱，Northern Blot或核酸原位杂交检测miRNA的表达，miRNA克隆、测序等等。另外，在miRNA研究中，随着高通量测序、芯片的技术不断发展，另一个重要的工具--生物信息学分析发挥着越来越重要的作用。

miRNA研究中常用的软件和数据库资源

以下是常用的microRNA靶标数据库和软件资源列表，希望对microRNA的研究者有所帮助。

（1） miRbase：众所周知的microRNA基因注释数据库。目前miRBase只提供了microRNA的靶标的预测软件的链接（如：PicTar）。 网址：http://www.77cn.com.cn/index.shtml

（2） starBase：一个高通量实验数据CLIP-Seq（或称为HITS-CLIP）和mRNA降解组测序数据支持的microRNA靶标数据库，整合和构建多个流行的靶标预测软件的交集和调控关系。网址：http://www.77cn.com.cn/

（3） Tarbase：一个收集已被实验验证的microRNA靶标数据库。网址：http://microrna.gr/tarbase/

（4） miRecords：一个整合的microRNA靶标数据库。整合多个靶标预测软件的调控关系。网址：http://www.77cn.com.cn/

（5） targetScan: 基于靶mRNA序列的进化保守等特征搜寻动物的microRNA靶基因。是预测microRNA靶标假阳性率较低的软件。而且是microRNA领域大牛Bartel实验室开发的。网址：http://www.77cn.com.cn/

（6） PicTar：基于microRNA或microRNA靶标联合作用等特征开发的搜寻动物的microRNA靶基因的软件，假阳性率也较低。是microRNA领域大牛Rajewsky实验室开发的。该文章位列miRNA相关文章引用Top5。网址：http://pictar.mdc-berlin.de/

（7） PITA：基于靶位点的可接性（target-site accessibility）和自由能预测microRNA的靶标。是著名的生物信息学家Segal实验室开发的。网址：http://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_data.html

（8） RNA22：基于序列特征预测microRNA的结合位点。是几个流行的microRNA靶标预测软件的其中一个。IBM公司的研究团队开发的。网址：http://www.77cn.com.cn/rna22.html

（9） miRanda和http://www.77cn.com.cn：是著名的Memorial Sloan-Kettering 癌症研究中心的研究人员开发的软件和数据库。miRanda的最新版本又叫mirSVR。网址：http://www.77cn.com.cn/microrna/home.do

（10） MicroCosm：EMBL-EBI的Enright 实验室开发的microRNA靶标数据库。网址：http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/

（11） miRTarBase：整合实验证实的microRNA靶标的数据库。网址：http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/index.html

（12） miRGator v2.0：整合microRNA表达、靶标和疾病相关信息的数据库。网址：http://mirgator.kobic.re.kr:8080/MEXWebApp/

（13） MiRNAMap:动物的microRNA基因及其靶标的数据库。网址：http://mirnamap.mbc.nctu.edu.tw/

（14） miRDB: 动物microRNA靶标预测和功能注释数据库。网址：http://www.77cn.com.cn/miRDB/

（15） RNAhybrid：一个基于miRNA-target配对自由能预测microRNA的靶标的软件。网址：http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/

（16） miRGen：microRNA基因和microRNA靶标数据库。网址：http://www.diana.pcbi.upenn.edu/miRGen.html

（17） Targetfinder: 使用基于植物的靶标罚分策略预测小RNA的靶标软件。网址：http://jcclab.science.oregonstate.edu/node/view/56334

（18） miRU, psRNATarget: 一个网页版的植物microRNA靶标预测工具。网址：http://www.77cn.com.cn/psRNATarget/

（19） CleaveLand:一个基于mRNA降解组数据预测microRNA靶标的工具。网址：https://homes.bio.psu.edu/people/faculty/Axtell/AxtellLab/Software.html

（20） Target-align：一个就鉴定植物microRNA靶标的工具。网址：http://www.77cn.com.cn/targetAlign.php

关于microRNA

microRNAs （简称miRNA）是一类进化上高度守的小分子非编码RNA，长度大约22nt左右，具有转录后调控基因表达的功能。第一个microRNA 于1993 年被发现。2000年之后，关于miRNA的研究取得了很大进展，目前已经有1000多个人类被发现，这些miRNA调控至少 30% 以上的基因表达，参与多种生理病理过程。 编码miRNA的基因可能位于功能基因编码区、非编码区，可能成簇表达或独立表达。在细胞核内，基因组DNA 转录生成较长的pri-pre-microRNA，之后被Drosha酶切割pri-pre-miRNA成形成长度大约70-100 碱基的、具发夹结构的pre- microRNA。这些发夹结构的RNA 被核输出蛋白exportin5转运到细胞质，在呗胞浆中的Dicer 酶切割形成19-23nt 大小的成熟的miRNAs 产物。成熟的单链miRNAs 与一系列蛋白形成miRNA诱导的沉默复合物(miRISC)，结合于靶mRNA的3ˊ-UTR区，阻止所结合的mRNA 的翻译或直接降解靶miRNA。每个miRNA可以调控多个（甚至上百个）靶基因，而特定靶miRNA也可以同时被多个miRNAs调节。

成熟的miRNA具有如下特点：（1）通常的长度为20～24 nt , 但在3′端可以有1～2 个碱基的长度变化;（2）5′端有一磷酸基团, 3′端为羟基, 这一特点使它与大多数寡核苷酸和功能RNA 的降解片段区别开来；（3）具有高度保守性、时序性和组织特异性。

序列（特别是种子序列）高度同源的miRNA被归为一个miRNA家族，但这些miRNA并不一定是成簇表达的。例如miR-34 家族3个成员miR-34a、b、c，其中，miR-34a位于1号染色体1p36基因座位，单独表达；而miR-34b和-34c位于11号染色体11q23基因座位，成簇表达（图1），但它们都具有相同的种子序列（图1），并且都受到转录因子TP53的调控。同一miRNA家族成员功能近似（但靶基因并非完全相同）。

图1 miRNA-34 family成员

（from Hermeking H Cell Death Differ. 2010，17(2) 193-9）

miRNA的表达为转录因子调控，其表达具有时空特异性和组织特异性。调控特定的生理过程。例如，肿瘤相关基因TP53和Myc分别调控促进凋亡的miRNA（例如miR34a，最近报道该miRNA亦靶向调控肿瘤干细胞biomarker CD44表达，）或抑制凋亡的miRNA（例如miR-21，该miRNA在多种肿瘤细胞中高表达），后者通过调控相应的靶mRNA，最终促进或抑制细胞凋亡（图2）。

和编码蛋白的mRNA相同，miRNA基因上游同样有启动子，启动子区的CpG导发生甲基化，也会影响下游基因表达。在一些肿瘤细胞（例如淋巴瘤）中，miR-34a上游CpG岛发生甲基化导致miR-34a表达水平降低；而在另一些肿瘤细胞（如胰腺癌）中，TP53突变产生同样结果，显示了miRNA表达调控的多层次。另外，基因缺失，重排等，以及环境因素，例如缺氧等，都会影响miRNA的表达。

图2 转录因子调节凋亡相关miRNA表达

（from Cortez MA t al Advances In Cancer Research, Vol 108）

目前，关于miRNA研究方法已经比较成熟，通过深度测序，可以发现未知的miRNA，miRNA芯片则可以很好鉴定研究组和对照组的差异miRNA，进而通过实时荧光定量PCR（q-PCR）加以验证。运用生物信息学分析以及数据挖掘，寻找miRNA可能的靶点以及靶序列，可能涉及的作用通路，之后进一步通过基因转染、过表达或抑制目标miRNA观察一些表型或基因表达变化，以探讨发现miRNA的作用机制。或研究miRNA与疾病的相关性，发展基于miRNA的诊断、疾病分型、预后判断、药效检测和治疗，都是目前miRNA研究的重要内容。从2000年至今，关于miRNA的文献已经超过10000篇，并且随着miRNA研究的不断深入，这个数字还在加速递增。

欧易生物追踪当前研究热点，发展了包括miRNA研究（芯片、深度测序、q-PCR）在内的，从基因组、转录组、表观遗传学到蛋白的完善技术服务体系，助力您的科学研究。

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miRNA研究技术---MicroRNA芯片及生物信息学分析

microRNAs(miRNAs)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70—90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。microRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体（RISC）降解mRNA或抑制mRNA的翻译，从而在转录后水平调控蛋白表达（最新发现microRNA也能在转录水平调控基因表达）。microRNA在物种进化中相当保守，在动物、植物和真菌等中发现的microRNAs表达均有严格的组织特异性和时序性。microRNA在细胞生长和发育过程中起多种作用，包括调控发育、分化、凋亡和增殖等。2011年4月27日，Sanger microRNA序列数据库(miRBase)升级至17.0版。在新版本中，发夹前体序列升至16769条，新增1597条；成熟miR和miR*产物共19724条，新增2383条；新版本报道序列共涵盖153个物种。目前已公布的人成熟microRNA为1711个，还有大量预测的microRNA基因需要通过实验验证。

上海欧易生物科技有限公司多年致力于RNA相关的技术服务，拥有广泛的客户基础，已拥有Agilent公司全套硬件设施和软件支撑，并拥有一支多年致力于Aglient产品技术和服务的专业队伍，我们将竭尽所能，与Agilent专业团队一起满足广大国内科研客户的个性需求，提供满意的解决方案，共同提升客户的科研效率和科研质量。

Agilent miRNA芯片技术服务

作为miRNA芯片的后起之秀，Agilent miRNA芯片自上市之初就受到业界广泛关注，上市以年来，其优异的性能指标更是获得科研工作者的广泛认可，稳占国内市场应用第一名。欧易公司应用agilent miRNA芯片技术平台，为您的科研提供服务。产品包括人miRNA芯片、小鼠miRNA芯片、大鼠miRNA芯片，芯片探针序列来源可以与Sanger miRBASE同步更新。

整套技术路线

产品特点

备注：agilent miRNA芯片序列来源可以与Sanger miRBASE同步更新，购买时请注意版本号

数据分析

miRNA-mRNA整合分析

如果客户拥有同样样本的miRNA数据以及mRNA数据结果，可以进行miRNA-mRNA整合分析。内容包括（1）对原始数据进行标准化等预处理；（2）miRNA-miRNA表达相关性分析：通过计算miRNA之间的皮尔森相关系数来识别功能相关的

miRNA，表达一致的miRNA可能属于同一个miRNA簇，并且共同发生转录；（3）miRNA-靶mRNA表达相关性：基于miRNA与靶mRNA的负调控关系，利用靶点预测算法，整合miRNA-mRNA表达谱，计算miRNA-靶mRNA对的相关性；（4）筛选重要的miRNA-靶mRNA对：通过设定相关显著性阈值，筛选出表达显著相关的miRNA-mRNA关系对，利用共表达构建网络；（5）miRNA功能推导：利用成熟的mRNA的功能来推断miRNA的功能，对异常表达miRNA靶向的mRNA进行功能注释，从而得到异常miRNA在癌症过程中所参与的生物学过程。

个性化数据分析

按照客户的要求和课题的特殊要求进行个性化数据分析

样品准备

a. 实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，冰冻粉碎组织，加1ml的RNA抽提试剂Trizol，匀浆后抽提RNA。

b. 实验对象为细胞样品，每份样品取1×107～1×108细胞，加1ml的RNA抽提试剂Trizol，样品为贴壁细胞，每10cm2培养皿Trizol使用量为1ml，裂解后抽提RNA。

Agilent miRNA芯片产品目录

欧易优势

★ 拥有标准化操作实验室和Agilent芯片技术平台，可以根据客户要求灵活安排实验，实验周期短，质量可靠。

★ 技术人员经验丰富，可以根据客户要求在第一时间提供实验方案、解决实验问题、分析实验结果。

★ 拥有专业的生物信息团队和大型计算机，可以为客户提供个性化的生物信息分析服务。

台湾华联 miRNA芯片技术服务

另外，为满足不同层面的客户需求，2010年伊始欧易生物作为华联生物科技公司大陆地区的深度合作伙伴和华东区总代理，为了更好地服务大陆地区客户，率先推出“原厂生产、原厂服务”的服务理念，为您提供华联生物科技高密度基因组芯片及全程技术服务。OneArray? miRNA 芯片为台湾华联生物技术公司研发的一款miRNA芯片产品，经过多方测试比较，其性能与国际知名大厂生产的芯片结果无论精度还是检出率均相差无几，并且与其他全检测方法例如定量PCR具有很好的相关性。其芯片包含最新数据17.0版本人类miRNA芯片（Human miRNA

OneArray?）和17.0版本小鼠 & 大鼠全基因体芯片（Mouse & Rat miRNA OneArray?）并提供样品检测服务及芯片数据分析等服务。您只需要提供保存完好的组织或细胞标本，欧易生物的芯片技术服务人员和华联台湾总部的技术专家就可为您完成全部实验操作，并为您提供包括实验方法、实验数据与图表的详细实验报告。让您花同样的经费，做更多的实验。

华联miRNA芯片产品目录

华联芯片优势 Phalanx Slide? 专利片基处理技术

高速的PhalanxArray探针布放技术

先进的PhalanxJetTM 专利点样技术

严谨的检测探针和控制探针设计

miRNA研究技术---MicroRNA实时定量PCR

实时定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。

欧易技术平台使用ABI7900、ABI 7500和Biorad IQ5.0型实时荧光定量PCR仪，用染料法或Taqman探针法对microRNA进行real time PCR定量测定或定性鉴定。灵敏度高、线性范围宽、特异性好、重复性佳。（详情请关注http://www.77cn.com.cn）

技术原理

技术特点

样本要求

客户可提供组织（>100～200 µ g）、细胞（>106），血液（1ml）、血浆或血清（1ml）、总RNA (>1µg)，用于miRNA实时定量PCR检测的RNA样品，必须是高质量的，完整的，没有RNase 污染（降解样品不易定量，材料允许情况下，尽可能不用已降解的RNA），提取方法必须保证所得样品包含完整的小RNA部分。同时请提供尽可能详细的背景资料，包括样品来源、miRNA丰度、miRNA名称或序列等。

服务特色

多样的样品：石蜡、组织、细胞、血液、血浆或血清等；

丰富的检测手段：加尾法、茎环法、Taqman探针法等；

先进的设备：ABI7900、ABI 7500和Biorad IQ5.0型实时荧光定量PCR仪。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/svwi.html