畜禽三元活性微生态制剂的研制及其应用研究

湖南省财政厅支农项目 湘财指[2004]39号 研究成果鉴定综合材料 畜禽三元活性微生态制剂的研制及其应用研究

Study on the Bioactive Ternary-Microecologics for Animal and

Poultry and its Utilization

完成单位：湖南省农业科学院

协作单位：湖南中业科技发展有限公司

二00五年九月

任务来源：

湖南财政厅资助项目

主管部门：

主持单位：

承担单位：

协作单位：

湖南省农科院重点项目 湖南省自然科学基金资助项目湖南省科技厅 湖南省农业科学院科技管理处湖南省农科院植物保护研究所湖南中业科技发展有限公司 2

目 录

前言????????????????????????????????????4 摘要????????????????????????????????????5 第一章

第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节 第二章

第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第三章

第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节

国内外微生态制剂研究进展????????????????????9

益生菌在畜禽养殖业中的应用研究???????????????11 益生元在畜禽养殖业的中应用研究???????????????16 卵黄免疫球蛋白在畜禽养殖业中应用研究 ???????????18 抗菌肽在畜禽养殖业中的应用研究???????????????21 微生态制剂的应用效果????????????????????24 动物微生态制剂应注意的事项?????????????????27 畜禽微生态制剂的研究方向??????????????????30 三元活性微生态制剂研究综合报告 ????????????????31

项目来源??????????????????????????31 主要研究内容????????????????????????31 技术路线??????????????????????????32 主要研究结果????????????????????????33 讨论????????????????????????????42 研究分报告 ??????????????????????????47

微生态制剂菌种选育研究???????????????????47 饲用嗜酸乳酸杆菌LS-03生物特性的研究????????????52 微生态活菌制剂发酵条件研究?????????????????57 微生态菌剂生产关键技术研究?????????????????69 微生态制剂的包埋技术????????????????????72 三元活性微生态制剂饲养断奶仔猪的效果????????????78 三元活性微生态制剂饲养生长猪的效果?????????????84

第六节 项目主要创新 ???????????????????????45

附件：1.科技查新报告

2.专利初审合格通知书 3.检验报告 4.企业标准 5.工艺流程图 6.生产许可证 7.环保证明

8.应用效果证明报告

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前 言

抗生素在畜禽饲养业的应用，为世界畜牧业的发展做出了巨大的贡献，

然而也带来了极大的隐患—引起内源性感染和二重感染，使畜禽机体免疫力下降，细胞产生耐药性，并可以转移到人体，威胁人类身体健康。因此，自1988年以来，世界发达国家现已开始全面禁止抗生素在饲料中的应用。国内外许多学者正在关注并寻找能够克服抗生素弊端的代替物，而益生菌、低聚糖、免疫球蛋白、抗菌肽等则是目前较理想的具有发展前途的产品。

近年来，国内外对单一的活菌制剂、低聚糖、免疫球蛋白、抗菌肽等产品在畜禽饲料上的应用研究，均已有较多的报道。但是，将活菌制剂—低聚糖—免疫球蛋白有机结合的研究，在一起，形成一种具有特定功能的新型微生态制剂，则国内外尚未见报道。本研究的目的是，采用现代生物技术，按特殊的生理生化加工工艺，将活菌剂、低聚糖、免疫球蛋白、抗菌肽有机地结合起来而研制成的一种新型三元活性微生态制剂，充分发挥免疫球蛋白的特异性免疫功能与益生菌、低聚糖、抗菌肽的非特异性免疫功能及相应的生理促进功能，进而达到促进畜禽生长、预防和治疗感染性疾病的目的。

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摘 要

近年来，随着抗生素在饲料添加剂中的禁用，寻求有效抗生素替代品的研究工作，受到人们极大的关注。而微生态制剂、低聚糖、卵黄免疫球蛋白、抗菌肽、中草药制剂等则是有希望的抗生素代替品。本研究针对人们关注的这一问题进行了研究，取得了如下结果： 1、筛选出高产乳酸的乳酸菌菌株。从126份猪肠、鸡肠、牛瘤胃、猪粪中，近2000株菌株中，分离筛选出一株高产乳酸的乳酸片球菌（LS-9），乳酸产量高达26.09g/L。

2、采用诱变育种技术对选育出的乳酸片球菌（LS-9）进行了遗传改良，并最终选项育出一株生产性能更好的乳酸菌（LS-9-1），该菌能忍耐高浓度（10%）葡萄糖，对葡萄糖的转化充高达86%-90%，产乳酸的能力达到了108g/L。

3、利用重组DNA的基因工程技术，将棒杆菌（AS1.563）赖氨酸合成途径中的关键酶基因（dapA）导入了乳酸片球菌（LS-9）中，使乳酸片球菌（LS-9）既高乳酸又能合成赖氨酸。

4、探索出活菌制剂混和发酵的关键技术参数。在生产应用中采取分步发酵法：第一步发酵时间为24-27h，温度32℃，通气量为60升/min，pH值为6，搅拌速度为120r/min。适合酵母菌和芽孢杆菌快速生长。第二步发酵时间24-27h，温度37℃，通气量为20升/min，pH值为6，搅拌速度为120r/min。适合乳酸菌快速生长。

5、本研究比较了葡萄糖、蔗糖、大豆粉、土豆粉、玉米粉、麦麸等六种物质作为活菌制剂发酵的碳源，结果表明，效果最好的是葡萄糖。乳酸菌工业发酵最好的碳源是土豆粉，酵母菌工业发酵最好的碳源是大豆粉，芽孢杆菌工业发酵碳源上述两者均可，没有显著差异，浓度为6%。

6、本研究比较了蛋白胨、植物油、大豆粉、玉米粉、土豆粉、麦麸、尿素等七种物质作为活菌制剂发酵的氮源，结果表明，效果最好的蛋白胨，浓度为0.5%，其次是植物油，

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浓度为0.3%，尿素也是很好的无机氮源，但在培养基的高温灭菌过程中，可能产生缩二脲等有害物质，影响菌体的生长。因此，本研究中排除使用无机氮源尿素。

7、本研究比较了低聚木糖、低聚果糖、低聚甘露等三种寡糖对活菌制剂的作用，结果表明，效果最好的是低聚果糖，但达到最佳效果需要的浓度较大（0.25%），达到最佳作用效果，用量需要最少的是低聚木糖（0.075%）。

8、本研究比较了土霉素、金霉素、杆菌肽锌三种常用的抗生素（浓度为1-10单位/g）对活菌制剂的影响。结果表明，三种抗生素对活菌制剂中的任何一种菌种都有抑制作用。

9、活菌制剂的菌种及其数量 本研究中，三元活性制剂的菌种：

乳酸菌：乳酸片球菌（LS-03 LS-09 LS-15）：3.6×108个/ml 芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌（AS1.884）：1.3×108个/ml 酵母菌：产朊假丝酵母菌（AS2.120）：2.1×108个/ml

10、活菌制剂营养配方：

主体碳源6%+葡萄糖2%+蛋白胨0.5%+植物油0.3%，另加K2HPO40.2%、K2HPO40.2%、Caco31%、MgSO40.06%、MnSO40.025%。

猪用活菌制剂，主体菌种乳酸菌，主体碳源土豆粉。反刍动物和鸡用活菌剂，主菌种为酵母菌，主碳源为大豆粉。

11、三元活性制剂的配方：

本研究中，三元活性微生态制剂的主要配方为：

活菌制剂98.4%+低聚木糖0.5%+卵黄免疫球蛋白(IgY)0.1%+蝇蛆抗菌肽蛋白粉1%

12、微胶囊包埋壁材的选择。研究结果表明，海藻酸钠0.5%+变性淀粉35%+阿拉伯胶15%+麦芽糊精25%+玉米糖浆20%作为壁材效果最佳，包埋率达97%以上。此外，2%的

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氯化钙有利于胶囊的形成和菌种包埋率的保持。

13、三元活性制剂微胶囊包埋产品热稳定性研究。通过70℃高温处理10min，包埋后的产品活菌成活率高达88.7%，而未包埋的产品活菌成活率只有41.5%。

14、三元活性制剂酸稳定性研究。本研究通过模拟胃液（含胃酸10%、胃蛋白酶1%，PH值4.0-5.0）试验，结果表明，经过8h后，包埋产品活菌率还有32%，而未包埋的产品经过7h后就完全丧失了活性。

15、三元活性制剂贮藏稳定性研究。经6个月的贮藏试验显示，包埋产品活性高达92.9%，而未包埋产品活菌存活率只有51.1%。包埋后的产品在更长的贮藏期后的稳定性，结果仍在观测之中。

16、活菌制剂代谢产物抑菌能力研究。研究结果表明，活菌制剂抑制病原菌起主要作用的是其代谢产物，且代谢产物的浓度越高，抑菌能力越强。代谢产物中起到抑菌作用的不是乳酸，而是乳酸以外的其他代谢产物，如乳酸菌素等，具体是哪种物质仍待进一步研究。

17、三元活性制剂抑菌能力的比较。本研究比较了三元活性制剂、单项活菌剂、单项低聚糖、单项免疫球蛋白、单项蝇蛆抗菌蛋白粉的抑菌能力，结果表明，三元活性制剂的抑菌能力明显高于单项物质的抑菌能力，但作用效果不是几项物质的数值累加。

18、通过本项研究，谨慎地提出如下理论：微生态制剂中，死菌具有与活菌相同的作用效果相同。微生态制剂产品中，强调菌种的代谢产物含量比强调菌体的活性更为重要。

19、三元活性制剂在断奶仔猪中的应用效果。试验结果表明，断奶仔猪日增重比对照提高65.83%，日采食量提高45.7%，饲料转化率提高12.02%，腹泻率下降近3倍。

20、三元活性制剂在生长猪中的应用效果。试验结果表明，生长猪日增重比对照提高

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23.5%，日采食量提高10.7%，饲料转化率提高11.8%，产投比为8.6：1，经济效益提高。 第一章

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13%

国内外微生态制剂研究进展

早在上世纪初（1907年），著名细菌学家梅切尼科夫就提出饮用酸奶可以延年益寿的假说，而微生态制剂用于防治畜禽疾病却是近20年的事。

最早研究和应用畜禽微生态制剂的历史可以追溯到1947年，蒙哈德（Mollgaard）首先发现使用乳酸杆菌饲喂仔猪，可以有效地增加仔猪的体重，并改善仔猪的身体健康状况。然而20世纪50-70年代，正是抗生素研究、生产和使用的黄金时期，导致了微生态制剂的研究和开发处于低潮，一段时期以来没有受到足够的重视，直到80年代中期才有了根本性的变转。

日本是世界上研制开发和利用微生态制剂较早的国家之一，其产品主要是双歧杆菌活菌制剂。在70年代双歧杆菌活菌制剂用于临床治疗腹泻。至80年代中期已有26种产品，90年代已达到饱和状况。据报道，至今在日本微生态制剂年产值达200亿日元以上的企业已有10余家。

其他许多国家，例如德国、美国、法国、意大利、荷兰、英国、俄罗斯和韩国等都有不同类型的微生态制剂产品，有的产品近年来进入了我国市场。如英国的PIC公司的Protexin，泰国研制生产的Togocerin，以0.04%的比例添加到饲料中，可以提高妊娠母猪和泌乳期母猪的生产性能，可以使仔猪的腹泻率和死亡率明显下降。加拿大生产的Prosurs Paste（主要含芽孢杆菌、粪链球菌、双歧杆菌等）可使育肥猪日增重提高9.5%。目前国外多使用复合菌剂。如芬兰的Broilact，由32种菌组成。日本的EM原液由5科10属80余种微生物复合而成。

产品开发进行得最成功的是美国和日本，到2004年止，美国年产各种微生态制剂4.5万吨，产值达20亿美元。其次是日本，年产各类微生态制剂1.5万吨，产值达3000亿日元。

我国虽然在微生态制剂的研究和开发方面比欧美起步晚，但近10年来发展相当迅速。生产微生态制剂的厂家由2000年的十几家发展到2004年的1600家。产业化程度高、规模较大的有四川何明清用芽孢杆菌研制的8501、8701、8801、8901、901系列，分别用于仔猪、育肥猪、鱼、禽、肉鸡。大连医学院研制剂的“促菌生”，南京农大研的“促康生”，松江制药厂生产的DM423菌粉，黑龙江兽医研究所生产的“痢康粉剂”，北京营养研究所

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生产的“增菌素”，杭州商学院生产的乳酸菌复合剂等等，在此不一一列举了。市场上应用较多、效果较好的大多是以芽孢杆菌和乳酸杆菌为主的复合益生菌剂。到2004年止，据不完全统计，我国的各种微生态制剂的产量已达到15万吨。但由于国家没有一个具体统一的行业标准，产品的质量参差不齐。

湖南省在微生态制剂的研究、生产、开发方面起步较晚，湖南省畜物兽医研究所于2004年成功地研制出以活菌制剂和中草药混配的新型微生态制剂，并获得了“湖南省科技进步三等奖”。

目前国际上已将微生态制剂分成三个类型。即益生菌（Probitics）、益生元（Prebiotics）、合生素（Synbiotics）。益生菌又称益生素，或活菌制剂，益生元是一类能够选择性地促进宿主肠道微生态平衡，促进机体健康的物质。如低聚糖类。合生素是指益生菌和益生元同时并存的制剂。目前国际上对开发新微生态制品的主要方向已从单纯的“益生菌”转向“合生素”这一方面。据日本报道：实验研究已证明双歧杆菌活菌制剂中加入低聚糖后，其效果比不加的提高10-100倍。

第一节 益生菌在畜禽养殖业中的应用研究

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一、益生菌的概念

动物微生态制剂是根据动物微生态学理论，利用动物体内正常的微生物成员，及其代谢产物或生长促进物，经特殊的加工工艺制成的制剂。它具有补充、调整或维持动物肠道内微生物平衡，达到防病、治病、促进健康和提高生产性能的目的。益生菌是微生态制剂的主体。

益生菌又叫活菌制剂，指为改善动物微生态平衡而发挥有益作用，达到提高动物生产力水平和健康水平，而人工添加的活菌制剂。

二、益生菌的菌种

我国农业部于1994年、1999年、2003年三次公布了可以直接在动物饲料中添加的微生物种类，2003年农业部第318号公告中，允许使用的微生物有：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、尿肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母、沼泽红假单胞菌。

美国食品药物管理局（FDA）和美国饲料公业协会（AAFCO）公布了40余种“可直接饲喂且通常认为安全的微生物”。这些微生物有：

短乳杆菌（L.Brevis）、乳酸链球菌（S.Lactis）、嗜酸乳杆菌（L.Acidophilus）、中间型链球菌（S.infermedius）、保加利亚乳杆菌（L.Bulgaricus）、乳脂链球菌（S.cremeris）、干酪乳杆菌（L.casei）、二丁酮链球菌（S.diacefylactis）、纤维二糖乳杆菌（L.Cellosus）、凝结芽孢杆菌（B.coagulans）、弯曲乳杆菌（L.Cuvvatus）、缓慢芽孢杆菌（B.Lentus）、德氏乳杆菌（L.Delbruekii）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、发酵乳杆菌（L.Fermentum）、地衣芽孢杆菌（B.Lincheniforms）、罗特氏乳杆菌（L.Reuferii）、短小芽孢杆菌（B.Pumilus）、乳酸乳杆菌（L.Lactis）、肠膜明串珠菌（L.Mesenferoides）、植物乳杆菌（L.Planfarum）、乳酸片球菌（P.acidilacticii）、青春双歧杆菌（B.adolescentis）、啤酒片球菌（P.cerecisiae）、婴儿双歧杆菌（B.infantis）、戊糖片球菌（P.Pentosaceus）、动物双歧杆菌（B.animalis）、乳酸乳球菌（L.Lactis）、长双歧杆菌（B.Longum）、谢氏丙酸杆菌（P.Shermanii）、嗜热双歧杆菌（B.thermophilum）、费氏丙酸杆菌（P.Freudenreichii）、两歧双歧杆菌（B.bifidum）、猪

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拟（类）杆菌（B.suis）、粪肠球菌（E.faecalis）、瘤胃生拟杆菌（B.ruminocola）、尿肠球菌（E.faecium）、多毛拟杆菌（B.Capillosus）、嗜热链球菌（S.thermephilus）、嗜淀粉拟杆菌（B.anylophilus）、啤酒酵母（S.Cerevisae）、黑曲霉（A.niger）和米曲霉（A.oryzae）等。

三、益生菌的种类 （一）、乳酸杆菌制剂

此类菌属，是动物肠道内的正常微生物，作为饲料应用较多的是嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和粪链球菌等。其中包括乳酸菌发酵饲料、乳酸菌粉、乳酸菌提取物。该类制剂应用最早、种类最多。但是该类制剂都厌氧菌，活菌成活率低，由于生产技术、工艺水平的限制，在产品加工和贮存过程中，易受干燥、高温、高压、氧化等不良环境的影响，导致产品贮存期短，质量不稳定而影响饲喂效果。

（二）、芽孢杆菌制剂

此类菌在动物肠道内存在极少，目前主要用的是蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等等。中国、日本、意大利等均有用芽孢杆菌作防病、治病及饲用微生制剂的报道。与其他微生物不同，芽孢杆菌以内生孢子的形式存在，能耐受胃内酸性环境，对饲料加工、运输过程中的干燥、高温、高压、氧化等不良环境因素的抵抗能力强、稳定性高，并有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，能降解植物饲料中一些复杂的化合物。

（三）、酵母类制剂

该类菌属在动物的肠道存在的数量也极少。目前常用的制品有啤酒酵母、假丝酵母等培养物。它可为动物提供蛋白质、帮助消化、刺激有益菌的生长、抑制病源微生物的繁殖，提高机体免疫能力和抗病能力，对防治畜禽消化系统的疾病起到有益作用。此类制剂也受干燥、高温、高压、氧化等不良环境的影响，造成活菌数下降，产品的贮存期短、质量不稳定、影响饲喂效果。

（四）、复合菌制剂

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活菌制剂根据菌株的组成，可分为单一菌剂和复合菌剂。单一菌剂研究和开发较多，目前的发展趋势是研制复合菌剂。复合菌剂能适应多种宿主和条件，比单一菌制剂更能促进畜禽的生长和提高饲料转化率。比较典型的是日本研制的含有5科10属80多种微生物复合培养的有效生物群制剂（EM），用于饲料中，能增强畜禽的免疫能力、促进生长、改善环境卫生，而且具有天然无毒、无残留等优点，广泛应用于世界各国的畜牧业。

四、益生菌的作用机理

（一）、优势种群理论

宿主体内的正常微生物群均存在一种或数种优势种群，优势种群的丧失，就意味着微生态失调。在动物肠道微生态系统中，厌氧菌占99%以上，兼性厌氧菌和需氧菌不到1%，因此，肠道中的优势种群菌株。其作用就在于恢复或补充优势种群，使失调的微生态达到新的平衡。

（二）、生物夺氧理论

多数病原微生物属于需氧菌或兼性厌氧菌，当动物肠道内的微生态系统失调，局部氧分子浓度升高时，有利于病原微生物的生长和繁殖。使用微生态制剂可以培育耗氧微生物，降低局部氧分子浓度，抑制病原微生物的生长、恢复失调的微生态平衡，从而达到预防和治疗疾病的目的。

（三）、生物拮抗理论

正常微生物群构成了机体的化学屏障和生物屏障。微生物的代谢产物如乙酸、丙酸、抗生素和其他活性物质等共同组成了化学屏障。微生物群有秩序地定植于粘膜、皮肤等表面或细胞之间形成生物屏障。补充微生态制剂可以重新构建机体的生物学屏障，阻止病原微生物的定植，发挥生物拮抗作用。

（四）、微生物群与营养关系理论

肠道内正常微生物，不仅可以帮助食物的消化吸收，还可以合成蛋白质、维生素及其他有益物质。使用适量的微生态制剂，可以显著提高饲料的利用率，并有利于维护机体

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微量元素的平衡。

（五）、三流循环学说

三流循还主要内容是能量流、物质流、基因流的循环。部分微生态制剂可以作为免疫调节因子、增强吞噬细胞的吞噬能力和抗体产生的能力，还可以促进有毒物质的代谢，促进肠蠕动，维持粘膜结构完整，从而保证了微生态系统中基因流、能量流、物质流的正常运转。

五、益生菌的作用

〈一〉、抑制有害菌的生长，改变肠道内微生物区系，降低疾病的发生 1、产酸

由于微生态制剂的某些菌种，如乳酸杆菌、双歧杆菌能产生乳酸、乙酸等有机酸，降低肠道内的pH值，可抑制大肠杆菌、沙门氏杆菌、梭菌等的增殖，减少肠道疾病的发生。

2、产生过氧化氢

一些菌种如嗜酸乳杆菌、乳酸杆菌等可产生过氧化氢，抑制葡萄球菌的生长繁殖，使用益菌在细菌的种间竞争中占优势。

3、生分解胆盐

双歧杆菌细胞内酶系统，还可将肠内结合的胆盐分解为游离的胆酸，通过胆酸对有害细菌产生较强的抑制作用。

4、竞争性地抑制有害菌的定植

益生菌进入肠道后，与病源菌和有害菌竞争营养物质，生存空间，抑制病原菌粘附到肠道细胞上。郑跃杰（2000年）等研究表明，双歧杆菌粘附到肠道细胞后，能完全抑制产生毒性的大肠杆菌（ETEC）和肠道致病性大肠杆菌（EPEC）的进一步粘附，其机制有可能是由于双歧杆菌的占位性保护，在空间上阻止了病原菌与宿主肠道细胞的进一步接近。

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5、生成抗生素

某些益生菌（如乳酸杆菌、链球菌）可产生抗菌素，如嗜酸菌素、乳酸菌素。乳酸菌能产生广谱性的抗菌物质，这些抗菌物质通过改变肠道内活菌的数量和代谢而发生作用。

6、通过抑制有害菌的生长，从而减少了胺和氨以及其他有害气体物质的产生，减少了对动物机体的毒害作用。

〈二〉、刺激免疫系统提高机体免疫能力

微生态制剂的免疫刺激作用主要与糖类有关。糖类作为生物机能的调节因子，主要表现为免疫增强和刺激作用。对巨噬细胞和丁淋巴细胞、自然杀伤细胞等，均有明显的刺激作用，使这些细胞的活性增强，刺激机体增强免疫力。另外，双歧杆菌及其表面结构成份，能够刺激活体的免疫临控功能，增强各种细胞因子和抗体的产生，提高自然杀伤细胞和巨噬细胞的活性，对宿主无任何毒副作用。

〈三〉、营养作用

对歧杆菌在肠道内发酵以后，可产生乳酸和醋酸，提高钙、磷、铁的利用率，并促进铁和维生素D的吸收。早在上世纪70年代就有报道，双歧杆菌能够合成维生素和蛋白质，促进消化和吸收。双歧杆菌具有磷蛋白磷酸酶，能分解奶中的又一酪蛋白，提高蛋白的消化率。枯草芽孢杆菌在小肠中增殖时，产生水解酶，促进蛋白质、淀粉、脂肪、纤维素的分解，因而可提高饲料的利用率。用作微生态制剂的菌种，一般都具备有特殊的酶系，如分解亚硝酸铵的酶，降低胆固醇的酶，控制内毒素的酶，分解又一酪蛋白的酶，分解各种纤维素的酶等。微生态制剂还在肠内代谢产生几种B族维生素。因此，微生态制剂对动物的作用是非常重要的。

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第二节 益生元在畜禽养殖业中的应用研究

一、益生元的概念

益生元又叫化学益生素，是一种不能被宿主消化吸收，也不能被肠道有害菌利用，只能被有益微生物如双歧杆菌吸收利用，有促进有益菌的活性，和促进有益微生物繁殖作用的一类化合物。

二、益生元的种类 （一）、寡糖

寡糖又叫低聚糖，是由2～10个单糖通过糖甘键连接形成的直链或支链的一类糖，一般构成单元为五碳糖或六碳糖. 基本上有6种：葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖。11个单糖以上的结合物称为大糖类，100～200个单糖结合物称为多糖类。由于单糖分子种类，分子结合类型不同，形成种类繁多的寡糖，目前确认的有1000种以上。根据其构成单元，可将寡糖分为：同源性寡糖和异源性寡糖两类。普通寡糖如蔗糖、麦芽糖、乳糖等，可以被动物体消化吸收，而功能性寡糖，如果寡糖、寡乳糖、异麦芽糖、半乳寡糖等，不能被动物体消化吸收，但却为双歧杆菌等肠道有益菌增殖所需。目前在动物营养中常用的寡糖主要有：甘露寡糖（MOS）、果寡糖（FOS）、α—寡葡萄糖（α—GOS）、寡乳糖（GAS）、寡木糖（XOS）、 —寡葡萄糖（-GOS）、低聚焦糖（STOC）、反式半乳寡糖（TOS）、大豆寡糖等。

（二）、菊粉

菊粉是由D-呋喃果糖分子以 -2，1-糖甘键连接而成的果聚糖。因此，可以认为菊粉包括果寡糖和更大聚合度的果聚糖。

三、寡糖的作用机理

（一）、通过选择性增殖双歧杆菌等发挥作用

1、肠道有益菌利用短链分支糖类物质大量增殖，形成微生态竞争优势，同时生成短链脂肪酸和一些抗菌物质，直接抑制外源致病菌和肠道内腐败细菌的生长繁殖，有毒物质

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大量减少，动物发病也随之受到控制。

2、合成B族维生素VB1、VB2、VB6、VB12等。

3、有益菌的代谢产物短链脂肪酸能刺激肠道蠕动，缩短食糜在肠内停留时间，从而减少有害物质对动物机体可能造成的毒害。

（二）、肠道病原菌，对动物起到保护作用。

许多病原菌细胞表面的外源凝集素能结合游离的碳水化合物，而粘附在肠道上皮繁殖，低聚糖进入肠道后会竞争性地和病原细胞表面外源凝集素结合，阻止病原菌在肠上皮粘附，促进其随粪便排泄，减少对动物的危害。

（三）、免疫力刺激辅助因子

低聚糖具有辅剂及免疫调解的功能，所谓辅剂就是能增加免疫系统对疫苗、药物和抗原免疫应答的物质。提高血清中LgA、LgM、LgG的含量。从而增加动物体液及细胞免疫功能。

（四）、促进脂类代谢

促进脂类代谢是低聚糖的主要作用之一。Delzenne等（1995）的试验表明，日粮中添加低聚糖可降低甘油三脂的浓度。DjouzI等（1977）报道，低聚糖具有降低血脂和血清中胆固醇的功效。

（五）、促进动物对矿物质的吸收利用

Ohta等（1998）试验表明，在日粮中添加低聚糖，可促进小鼠对钙、铁、镁等矿物质的吸收利用。

（六）、抗肿瘤作用

低聚糖可抑制有害菌的生长而降低肠道内的葡萄糖苷酶、硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、偶氮还原酶这些致癌因子的含量。

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第三节 卵黄免疫球蛋白在畜禽养殖业中应用研究

利用外源抗体口服免疫疗法，为动物提供被动免疫从而预防和治疗肠道感染引起疾病的研究，将近有一个世纪的历史了。自Klemperer于1893年首次报道鸡蛋中存在抗体以来，人们对鸡蛋中抗体的研究不断深入。近20年，国内外学者就卵黄抗体的研究和开发作了许多方面的研究工作，证明免疫家禽是提供特异IgG抗体最方便、最廉价的来源。随着抗生素在世界各国的被禁用，人们正致力于寻找抗生素的有效代替品，同酶制剂、益生菌、中草药等一样，卵黄抗体作为一种安全、高效的饲料添加剂，必将被广泛应用于生产实践。美国食品和药品管理局于1996年将卵黄免疫球蛋白（IgY）列入“一般公认安全物质范畴”。德国已于1995年批准用预防仔猪、牛犊腹泻病的抗体粉作为饲料添加剂。

一、卵黄抗体及其特征 （一）、卵黄抗体的概念

卵黄抗体—是指从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体。卵黄抗体的研究始于20世纪初，1889年Klemperper发现了卵黄中富含抗体，Williams等（1962）发现用某种抗原免疫产蛋母鸡，鸡血中可产生相应抗体，产蛋母鸡又能以产蛋的方式将血清免疫球蛋白有效地转移到卵黄中（Rose和Orlans，1981）。鸡血液中能转移到卵黄中的免疫球蛋白只有免疫球蛋白G（IgG），至今尚未发现卵黄中存在免疫球蛋白A和M（IgA和IgM）（胡清林等1997）。1969年Leslie和Clem将这种抗体命名为卵黄免疫球蛋白（IgY）。

（二）、黄抗体的分子结构

正常鸡的蛋黄抗体分子量约为180KD，由两条重链和两条轻链组成，分子量分别为67000和2200。IgY的等电点接近于5.2。尽管IgY同免疫球蛋白E（IgE）有相似的结构特征，但从抗体产生的特性及数量来看，IgY与哺乳动物的IgG更相似。IgY的基本功能是与特异性抗原结合而发生免疫反应，增强机体的免疫能力。

二、卵黄抗体的特点 （一）、有良好的稳定性

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卵黄抗体作为一种具有生物活性的免疫球蛋白，在贮存、生产、和加工以及摄食及消化过程中，保证抗体活性的稳定性是非常关键的。多项试验表明，卵黄抗体具良好的稳定性，并且耐热、耐酸、耐碱的性能也都较强。Shimizu（1988、1992、1993）报道，IgY的热稳定性与哺乳动物类的免疫球蛋白大致相同。研究发现热（＞75℃）或酸（PH值＜3.0时能够降低IgY的抗体活性，温度65℃时，IgY活性可保持24h以上，但70℃处理90min后活性明显下降。Lasson等（1993）将IgY制剂在4℃贮存5年或在室温下放置6个月，经免疫扩散法检测，IgY抗体仍无明显下降。

IgY对pH值和蛋白不解酶有较好的稳定性，IgY在pH4.0～11.0时比较稳定，pH值为3.0～3.5时，活性迅速下降，pH为12.0时活性也降低。Yolken等（1988）报道，IgY能够抵抗幼龄动物的胃酸屏障，抵抗肠道中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化。由于幼畜胃内酸度不会太高，IgY在胃内一般不会严重失活，故在幼畜日粮中添加IgY可获得有效的被动保护免疫力。但对年龄大的动物来说，就有必要对IgY进行保护，以免在胃中被消化。Shimizu（1993）对IgY进行了脂质体包埋的探索，发现在pH2.8的胃蛋白酶液中37℃温育1h后，包埋的IgY仍可保存80%的活性。而未包埋的活性几乎全部丧夫。

（二）、产量高、成本低、便于规模化生产

免疫的产蛋母鸡是高效率、高质量的IgY“生产加工厂”。经用特定的抗原免疫后的产蛋母鸡，对抗原可产生持久性应答。抗体在卵黄中出现的时间，比在血液中约晚一周，一般在母鸡被免疫后15天左右出现，效价可持续数月至一年以上。卵黄中IgY的含量超过哺乳动物血清抗体含量（Hafla等）。一只母鸡（平均每周产蛋5～6枚）产蛋产生的抗体相当于100ml血清或200ml血液。一只兔子一个月可提取IgG约为200mg，而一只母鸡一个月可提取IgY2000-28000mg（Schade等，2001），因此，母鸡生产IgY的效率是哺乳动物的10倍。此外，动物的采血不仅对动物本身是极大的应激，而且费时、费工、大规模生产不切实际。

（三）、绿色无害，没有残留

卵黄抗体是禽蛋中天然存在的一种物质，化学本质是蛋白质，发挥作用后即可被机体作为营养物质分解利用。用IgY抑杀病原体，作用对象直接准确（只对产生该抗体的抗原

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起作用），不会象抗生素那样，抑杀病原菌的同时，也杀死有益微生物。使用IgY时，病原微生物不会产生抗药性，不存在给动物用药而影响人类身体健康。

（四）、别域广，鉴别力强

抗原与本身的亲缘关系越远，越易被识别。鸟类与哺乳动物种群差距大，鸟类更适合于生产抗哺乳动物抗原的特异性抗体。卵黄抗体不会激发补体系统，不与抗哺乳动物抗原的抗体发生反应，不与哺乳动物和细菌的Fc受体结合。这些在免疫诊断中具有重要意义。

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适PH值、最适的拌搅速度可以设定自动控制程序。

（二）、微胶囊包埋技术的应用

本项目探索微生态制剂微胶囊包埋壁材的最佳材料及其比例，研究出影响包埋效果的几种控制因子。

（三）、低温喷雾干燥技术的应用

采用低温喷雾干燥法，更加有效地保护了三元微生态制剂的活性。

四、产品应用效果的创新

（一）、抑菌能力的创新

对畜禽肠道内的有害菌的抑菌能力，与日本的同类型产品原相比，增强了4倍以上。

（二）、促进畜禽生长能力的创新

本项目产品在断奶仔猪上应用，日增重达到了495.71g/天，在生长猪中应用日增重达到了628g/天，分别比日本的EM原提高17%和10.5%。

（三）、降低了仔猪腹泻能力的创新

本项目产品在21-35日龄的断奶仔猪中应用，腹泻率与日本的EM原相比，降低了20%。

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第三章 研究分报告

第一节 乳酸菌的分离与筛选研究

梁志怀1 魏林1 罗赫荣1 张秋胜2

1湖南省植物保护研究所 2湖南省园艺研究所

乳酸菌是肠道的正常菌群之一，它对肠道内多种微生物群落有一定调整作用，作为益生素菌种在肠道内生长繁殖，改善肠道环境，尤其在预防和治疗由大肠杆菌等引起的兽禽腹泻等消化系统疾病，具有较好的作用，从而提高兽禽的成活率，并可促进兽禽生长。同时克服了抗生素应用带来的医源性菌群失调症。目前利用乳酸菌做益生素饲料添加剂已成为国内外研究的热点。而优良乳酸菌菌株的获得，是研究开发预防治疗兽禽腹泻等乳酸菌益生素的前提和基础。本研究中我们通过不同实验筛选，以期获得活性强、耐低pH、抗药性能好的优良菌株，试验结果如下。

1、 材料与方法 1.1 供试培养基 1.1.1分离培养基

BCP培养基：酵母膏2.5g, 蛋白胨5g，葡萄糖5g，溴甲酚紫0.04g，琼脂15g，蒸馏

水1000ml， pH 6.8-7.0

淘米水液体培养基：糯米：水=1：2，浸泡3天后，过滤，灭菌后备用。

1.1.2 产酸培养基：葡萄糖10g，MgSO4·7H2O 1g，蛋白胨2g，酵母膏5g，NaCl 1g，蒸馏水1000ml，pH 7.0-8。

1.1.3 鉴别培养基:

形态观察用BCP平板培养基

糖的氧化和发酵培养基：蛋白胨1.0 g，NH4H2PO4 1.0g, KCl 0.2 g, MgSO4·7H2O 0.2 g, 溴百里酚蓝（1.6%酒精溶液）1.5 ml，琼脂3.0 g，蒸馏水1000.0 ml。

1.2 菌种的分离与纯化 1.2.1 标样的来源

新鲜猪结肠内容物、活鸡肠道内容物置入无菌生理盐水稀释，吸取5ml置入95ml富

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集培养基厌氧培养48小时，如此连续5次进行的富集培养液备用; 新鲜西红柿在无菌淘米水液体培养基中厌氧富集培养48小时，如此连续3次进行的富集培养液备用的培养液备用。

1.2.2 菌株的分离

将不同的标样溶液分别系列稀释，涂布于BCP平板上，挑取有透明圈的菌落，反复纯化至纯种挑至牛奶试管中保存。

1.2.3 初筛：

将分离得到的纯化菌株接种于液体产酸培养基中，37℃厌氧培养48小时，用标定的0.01N氢氧化钠溶液滴定，挑选相对产酸量高的菌株。 1.2.4 复筛：

以弱毒型大肠杆菌(E. coli)作为试验菌，将初筛菌种的发酵液离心后，取上清液用杯蝶法测其抑菌活性，保留具有抑菌活性的菌株。

1.2.5 生理生化特性试验鉴定乳酸菌：

据伯杰氏细菌鉴定手册对乳酸菌的描述，将筛选确定的G+菌株进行接触酶试验和菌悬液接种于糖发酵培养基试管中，观察反应结果。并用从中国农业微生物菌种保藏管理中心购买的标准菌株Accc10644(植物乳杆菌)，Accc10637(嗜酸乳杆菌)，Accc10180(粪链球菌)作对照。

1.2.6 抑菌谱的测定：

分别以革兰氏阴性菌弱毒型猪霍乱沙门氏菌（Salmonella C500）、强毒型鸡白痢沙门氏菌（Salmonella C79-13），革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），单核细胞增生利斯特氏菌（Listera monocytogenes 54002），热带产朊假丝酵母和啤酒酵母（Saccharomaces cerevisiae）作为试验菌，用管碟法测定复筛确定的菌株对上述供试菌株的抑菌作用。

1.2.7 抗药性的测定

采用牛津杯法。预先将复筛确定的菌株分别涂BCP平板，牛津杯置于平板上。分别取土霉素、PPA、黄连素（浓度均为800单位/微克/毫升）、青霉素钠盐（浓度为1000单位/微克/毫升）0.2 ml置于牛津杯中。

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2. 结果与分析 2.1 菌种的分离

从不同来源材料中，共分离得到纯培养菌株56株。其中G染色结果为阳性、KOH试、H2O2酶试验、明胶水解试验、产硫化氢试验均为为阴性的有２９株，基本可确定为乳酸菌，将其编号从LS-1到LS-29。 2.2 菌株的筛选

通过产酸能力的检定和对猪源弱毒型大肠杆菌有抑制效果的比较，LS-3、LS-9、LS-15三个菌株产酸能力较强，对E. coli 的抑菌圈的直径分别为： 18.2㎜， 15.8㎜, 19.3㎜。 因此，选择其中抑菌活性较强的3个菌株作为进一步研究材料。

2.3 复筛菌株的鉴定 生化试验结果如下：

表二：生化微量管鉴定结果表

发酵管

阿拉伯糖 纤维二糖 半乳糖 葡萄糖 乳 糖 麦芽糖 甘露醇 甘露糖

LS-03 + + + + + + — + + + — +

LS-09 + D + + + + D + + D + _ +

LS-15 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ — ＋ ＋ —— ＋ —— ＋

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ACCC10637 ACCC10637 ACCC10180 + + + + + + — + + — + — +

+ D + + + + D + + D + _ +

＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ — ＋ ＋ —— ＋ —— ＋

松三糖 蜜二糖 棉子糖 鼠李糖 核 糖

三梨醇 蔗糖 海藻糖 木 糖 七叶苷

— + + +

+ + + + +

—— ＋ ＋ ＋ ＋

— + + +

+ + + + +

—— ＋ ＋ ＋ ＋

鉴定结果 嗜酸乳杆植物乳杆粪链球菌

菌

菌

嗜酸乳杆菌 植物乳杆菌 粪链球菌

由以上特征可以判断，所筛选出的3株菌株均为乳酸菌，其中，LS-3 为嗜酸乳杆菌，LS-15为植物乳杆菌，LS-9为乳酸球菌。

2.4 抑菌谱测定

复筛出的3株菌株对供试菌株的抑制作用见表1。

表3 不同菌株抑菌效果

供试 菌株 猪霍乱沙门氏菌 鸡白痢沙门氏菌 金黄色葡萄球菌 单核细胞增生利斯特氏菌

啤酒酵母

LS-3 16.8 19.1 16.5 21.6 0

抑菌圈直径/㎜ LS-9 13.7 16.4 14.3 15.0 0

LS-15 17.1 22.4 17.7 23.8 0

CK 0 0 0 0 0

热带产朊假丝酵母

0 0 0 0 由表3可以看出，3个菌株对所供试的禽畜上常见的腐败菌和病原菌均具有明显的抑制作用，这其中包括G+的金黄色葡萄球菌、单核细胞增生利斯特氏菌及G-猪霍乱沙门氏菌、鸡白

痢沙门氏菌均有较好的抑制作用，其中乳酸球菌的作用又略好于两乳酸杆菌。同时，三个菌株对热带

产朊假丝酵母、啤酒酵母又均表现出无抑制作用。因此，可将同样具有益生素效果的热带产朊假丝酵母、啤酒酵母添加进去，进行多菌株混合培养，以达最大产量。

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第四节 抗菌肽在畜禽养殖业中的应用研究

抗菌肽在动植物体内分布广泛，是天然免疫防疫系统的一部分。抗菌肽不仅有广谱抗菌能力，而且对真菌、病毒及癌细胞也有作用。现在越来越多的国家开始呼吁禁用抗生素，而抗菌肽因其独特的生物活性以及不同于传统抗生素的特殊作用机理，已引起人们极大的研究兴趣，成为分子生物学和生物化学研究领域的热点之一。抗菌肽首先由瑞典科学家Boman G等人经注射阴沟杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕蛹产生的具有抗菌活性的多肽，即Cecropins。此后科学家在昆虫、被囊动物、两栖动物、鸟类、鱼类、哺乳动物、植物乃至人类多种生物体中发现并分离获得了300余种内源性抗菌肽。近来，对昆虫抗菌肽进行了较为系统的理论和应用研究。

一、抗菌肽的结构和特征

天然抗菌肽通常是由30多个氨基酸残基组成的碱性小分子多肽，水溶性好，分子量大约为4kDa。大部分抗菌肽具有热稳定性，在100℃ 下加热10～15min仍能保持其活性。多数抗菌肽的等电点大于7，表现出较强的阳离子特征。氨基酸N端富含赖氨酸和精氨酸等阳离子型氨基酸，其C端富含丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸等非极性氨基酸。在许多特点位置，都有一些较保守的氨基酸残基，这些保守的氨基酸残基是抗菌肽分子具有抗菌活性不可缺少的。另外一些天然抗菌肽的C端往往是酰胺化的。这与抗菌肽的广谱抗菌活性有关。抗菌肽在一定条件下形成 螺旋和 -折叠结构。

二、抗菌肽的抗菌机理和特点 （一）、作用机理

研究表明，抗菌肽分子通过膜内分子间的位移，而相互聚集在一起，从而在膜上形成离子通道，使膜蛋白凝集，使细菌因不能保持正常的渗透压而死亡。也有人提出是通过影响细胞膜上的能量运转和代谢，从而损伤细胞呼吸链的功能而杀死细胞菌。抗菌肽还可以断裂癌细胞的核DNA，通过抑制DNA的合成，而杀死癌细胞。总之，是通过物理方式和细胞膜发生作用。

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（二）、作用特点 1、作用部位的有效性

传统抗生素作用是通过消除微生物生长或生存必须的功能实现的，如阻挠细菌蛋白质的合成或者改变酶的活性来达到杀菌的目的，而细菌通过改变一种基因就可以对付抗生素的这种进攻。抗菌肽则是作用细菌的细胞膜，导致膜的通透性增大，以此穿透、并杀灭细菌。细菌必须改变膜的结构，即改变相当部分的基因才能防御抗菌肽的进攻，而这几乎是不可能的。因此，抗茵肽极大地减少了产生耐药性的可能。 2、作用对象的选择性

抗菌肽只对原核生物细胞和真核生物病变细胞有抗菌作用，对正常的真核细胞不起作用。原因在于原核生物和正常真核生物的细胞膜结构不同，正常真核细胞膜中含有大量的胆固醇，而胆固醇的存在使膜结构趋于稳定。此外，高等动物存在高度发达的细胞骨架系统，其存在也低抗了抗菌肽的作用。

三、抗菌肽的生物学特性 （一）、广谱性

畜禽疾病多为混合感染，传统的抗生素抗菌谱一般较窄，且只对细菌有效。而大多数抗菌肽对革兰氏阴阳性菌均有效，有些还对真菌、病毒、寄生虫、原生动物有抑制或杀灭作用。

（二）、用快速、安全、无残留

由于分子较小，在机体受到侵害时，几分钟内就能产生作用，且扩散速度比体内免疫细胞更快更灵活。抗菌肽是动物体成分之一，参与生命过程，是小分子短肽，具有安全无毒副作用的生物学特性。

（三）、刺激免疫反应

抗菌肽可参与宿主天然免疫的其他反应，比如刺激单核细胞和嗜中性白细胞的趋化作用、促进肥大细胞组织胺的释放、抑制组织蛋白酶以及促进创伤愈合。

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（四）、与其他抗菌物质的联合作用

研究发现，抗菌肽与传统抗生素联用，可提高药效并拓宽传统抗生素的抗菌谱。至今未见有关抗菌肽与其他药物相拮抗的报道。

（五）、对环境有较强的抗性，适合做添加剂

抗菌肽在100℃加热10min条件下仍能保持活力，对PH值有较强的适应性，水溶性好。部分抗菌肽尚具备抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力，进入动物消化道，能很好地发挥其和用。

四、抗菌肽的应用研究

温刘发等人应用华南农业大学已开发的抗菌肽添加于断奶仔猪料中，饲喂试验结果表明，蚕抗菌肽可减轻断奶仔猪的腹泻。陈晓生等报道，在饲料中添加抗菌肽对肉鸡有促进生长江的作用。另有报道，柞蚕抗菌肽应用于预防及治疗鸡的白痢效果明显。

湖南农业科学院植保研究所、南开大学、天津大学等科研单位，都已成功地从蝇蛆体内分离出抑制多种病源菌和病毒的抗菌肽，目前多种抑菌试验已经完成，科研人员正在着手进一步强化从蝇蛆体内提取的抗菌肽。

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第五节 微生态制剂的应用效果

一、猪

何明清、乔绍权、陈代文、罗安治、胡未一等（1989～1994），用芽孢杆菌添加剂8701A通过饲喂1357头哺乳仔猪试验，结果表明，以添加0.15%的用量效果最佳，日增重较对照组提高19.2%～22.8%，饲料利用率提高6.3%～23.5%时；添加0.1?01B（育肥猪用），当消化能为3.16～3.17Mcal/kg时，粗蛋白在15.78%～13.1%时，全程日增重无明显差异，而饲料利用率提高7.7%；在用量和菌剂相同的情况下，当消化能为3.2Mcal/kg时，日增重提高6.7%，饲料利用率提高11.7%；在营养水平较低时，当消化能2.9～3.0Mcal/kg时，粗蛋白为12.2%～14.1%，全程日增重提高16.5%，饲料利用率提高6.1%；当在农村条件下试验时，日增重提高15.1%～25.8%。

薛恒平等先后对10余批510头哺乳仔猪进行试验，使用乳酸杆菌和芽孢杆菌复合制剂平均提高增重21.5%，饲料利用率提高9%。

朱万宝等(1999)利用蜡状芽孢杆菌、粪链球菌等4株菌制成复合微生态制剂饲喂35日龄的断奶仔猪，饲喂20天，与对照组相比，仔猪腹泻减少，增重提高19.6%，节约饲料15.22%，每头仔猪增加经济效益5.96元。

二、家禽 （一）、肉鸡

何明清、向贵友、谢候清等（1994），芽孢杆菌8901添加剂经1993-1994年3次养鸡饲养试验结果统计分析，在营养水平相同的情况下，分别用0.1%、0.15%和0.2%的8901添加剂，饲喂时间分别为5、6、7三个周龄的肉鸡，结果显示日增重较对照组分别提高8.9%、14.5%、21.6%，饲料利用率分别提高19.1%、17.9%、10.1%，发病率分别降低20%、20.7%、22.4%。

光合细菌添加剂经5200羽宝杂交鸡饲喂63天，结果在营养水平相同条件下，光合细菌添加剂（培养液）用量为28日龄前平均每日每羽0.4mL，28日龄后平均每羽0.6mL，日增重试验组较对照组提高12.3%，饲料利用率提高21.0%，成活率提高3.1%。

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（二）、鸡蛋

聂志武等（1997）报道产蛋母鸡误饲生长育肥猪饲料而受应激，致使产蛋量下降，但用四川农大生产的芽孢杆菌制剂按0.1%的量添加在基础日粮中饲喂产蛋鸡，产蛋重由27.4g/枚，上升为46.5g/枚，上升了19.1g/枚，产蛋率由44.3%提高到74.3%；空白对照组产蛋重由33.8g/枚，上升为37.8g/枚，仅上升4.0g/枚，产蛋率由54.4%提高到60.5%；抗生素组产蛋重由27.4g/枚上升为37.4g/枚，上升了10.0g/枚，产蛋率由44.2%提高到59.8%。牛钟相（2000年）用双歧杆菌等饲喂蛋鸡，产蛋率提高12.2%，饲料转化率提高10.4%。

三、奶牛

张力军等（1995）利用四川农大生产的猪用8701微生物添加剂饲喂奶牛，按千克体重50mg计算，每天饲喂一次，连续30天。结果表明：试验组比对照组日均产奶量增加5.17kg，提高16.81%。李义海等（1998），在奶牛中应用微生态制剂，可使奶牛产奶量提高7%～10%，乳蛋白含量提高0.1～0.2个单位，乳脂率提高0.1～0.3个单位。

四、家兔

家兔为草食动物，对粗纤维消化率一般在8%～28%之间，饲用微生物添加剂的引入可增强家兔对较难消化的粗纤维的消化利用。安继升等（1989）用乳酸杆菌添加剂饲喂对德系长毛仔兔并进行腹泻病防治和增重效果观察，结果从21日龄到52日龄断奶，试验组仔兔增重低于对照组4.94%；而断奶后10天，试验组比对照组多增重7.89%；断奶前试验组发病率低于对照组10.7%，断奶后10天，试验组发病率较对照组低4.23%。

张玉笙等（1993），在家兔日粮中按1.0%、1.5%、2%的量添加微生物添加剂，日增重分别比对照组提高2.38g、3.61g、4.62g，饲料转化分别提高4.86%、6.29%、8.86%，屠宰率分别提高1.79%、1.21%、3.70%，发病率和死亡率均极显著地低于对照组。

五、鱼、虾

张道南等（1988），在虾苗中使用光合细菌，每槽4000尾，每天投喂140mL菌液，试验组虾苗变态率为94.1%，成活率为63.7%；投喂100mL菌液组，变态率为91.4%，成活率为53.9%；而对照组变态率为77%，成活率44.4%。李勤生等（1990），用DILI光合细

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菌进行团头鲂和草鱼试验，在团头鲂鱼种中无论是添加0.5%或1.0%的菌体还是菌液均表现明显的促生长作用，第1批水缸中试验，日增重为对照组的4.71倍，总重率是对照组的5.1倍，第2、3批也得到相似的结论。在草鱼试验中，水缸流水试验20天，添加0.4%菌体的试验组鱼种，生长速度大大超过对照组，总增重率和日增重分别是对照组的3.2倍和2.5倍，在网箱生产中，经95天饲养，成活率提高7.0%，饵料系数下降0.43。浙江省慈溪市（1995）应用光合细菌拌料，喂草鱼较对照组亩产增加3.4%，饵料系数下降0.3，降低17.5%；用菌液泼洒方式使用，亩产增加12.4%，饵料系数下降0.22，降低12.9%。 姚键（1994）报道将蜡样芽孢杆菌用于对虾的生产上，用量为1mg/kg，出苗量比对照组提高10%～15%。何明清、王子彦、方尚文、倪学勤等（1989-1994）用微生物添加剂（8801）饲喂鲤鱼苗和成鱼，增重分别提高12.9%和8.0%～11.6，饵料利用率分别降低18.2%和8.7%；林志新等（1994）用四川农大生产的8801饲喂虾，亩产提高31.2%，饲料利用率提高22.2%，成活率提高21.2%。

薛恒平等（1997），用芽孢杆菌、光合细菌、蛭弧菌等制成的复合菌剂（微生态制剂王），按1mg/kg用量投入虾池中，在虾苗放养1月后投入，每星期投入1次，共3次，结果试验组对虾病毒病发生较对照组延迟10天，产量增加40%；用于文蛤，试验组3个池塘均未发病，而对照组3个池塘发病率为30%～50%。

六、饲用微生物添加剂应用效果：

潘康成（2000年）对31篇综述或研究资料进行了统计学处理所得结果均为平均数，见下表：

饲用微生物添加剂应用效果平均数（2000年）（%）

动物类型 提高增重 提高饲料 降低 降低 提高产蛋量 转化率 发病率 死亡率 或产奶量 猪 14.28 7.86 22.9 7.5 / 家禽 7.1 9.05 21.10 3.88 6.3 反刍动物 10.89 4.2 15.8 7.3 家兔 10.89 11.78 14.13 8.54 / 鱼虾 12.5 11.86 14.63 /

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第六节 动物微生态制剂应注意的事项

一、安全性

在菌种的筛选时，一定要进行系统的安全性毒理学试验，确定无毒副作用，并经权威机构鉴定后，方可用于生产，避免可能存在的隐患。特别是有些细菌的长期使用后，可能因理化及微生物毒素或菌体本身的原因，引起突变，产生负面影响。因此，应定期对生产菌进行安全性检测。

二、活性

活菌制剂质量不稳定，在饲料加工过程中要经过混合、制粒、运输等环节，尤其是在制粒过程中，要保持80-100℃的高温，容易失活。活菌制剂必须保证含有一定量的活菌数，同时应保证生产菌株在一定的传代范围之内。

三、选择性

动物微生态制剂有很多的类型，每一类型都有较适应的使用对象，应根据不同种属的动物，不同生理阶段，环境条件和使用目的不，使用时加以选择。

不同的动物适合使用不同的菌种。反刍动物如牛羊类，适合使用曲霉、酵母、及芽孢杆菌。若给反刍动物使用过多的乳酸菌，反而会扰乱其消化系统，引起不良反应。而单胃动物适合使用乳酸杆菌、芽孢杆菌、酵母菌。水产动物适合使用沼泽红假单孢菌、芽孢杆菌、酵母菌，其中沼泽红假单孢菌和芽孢杆菌，不但在动物体内起作用，而且对致良水的环境起着重要作用。

微生态制剂在动物的不同生长发育阶段，使用效果不一样。总的来说，在动物的幼龄期、老龄期、冷热应激期、病后初愈期、消化道疾病期等使用，均能取得最显著的效果。因此，幼龄期的乳猪、仔鸡、仔鸭、羊羔、牛犊、老龄期的母猪、产蛋鸡鸭等，使用剂量要大于中青年时期，环境恶劣时也需要加大用量。

四、有效性

影响活菌体效果的因素有很多，应通过动物实验证实并正确使用，以保证使用效果。

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（一）、用时间要早：根据先入为主的理论，通过先入菌占居地位，减少或阻碍病源菌的定居。因此，在动物出生后，应尽早添加微生态制剂是可取的。

（二）、用时间要长：微生态制剂在进入机体后，要有一段时间进行微生物群系调整，应长期连续喂养，才能达到理想的效果。

五、微生态制剂与日粮营养的关系

日粮蛋白和限制性氨基酸的平衡程度，影响着微生态制剂的效果。在低蛋白质或氨基酸不平衡的日粮中添加更为有效。New man（1988年）报道，在低蛋白质且未添加赖氨酸的日粮中，添加微生态制剂，生猪的平均日增重率和饲料效率分别提高14%和7%。但在蛋白质和赖氨酸都得到了满足的平衡日粮中添加微生态制剂，上述两项指标反而不如对照。

六、微生态制剂与抗生素的关系

各种抗生素对每一类微生物生态制剂的抑制作用不一致。若是有强烈抑制作用的抗生素，与生态制剂同时使用，可能会影响其效果，必须了解各种抗生素与所有微生态制剂之间的关系。大部分资料认为，抗生素和微生态制剂之间存在拮抗作用，在生产中，不能将两者混和使用。而Cusdldo报道（1991年），抗生素和微生态制剂两者混和使用，也会产生协同作用。

七、微生态制剂在适宜添加量

微生态制剂的添加剂量并不是越多越好，其使用量依菌种生产工艺及使用对象的不同而不同。每一种微生态制剂产品都需要通过大量的饲养试验来确立最适添加剂量，对于复合型的微生态制剂不能简单地按总菌数来换算，因为不同菌的生长速度，抗逆性不一样。一般按厂家建议的添加量进行添加即可。

芽孢杆菌类在猪饲料中每头每天能采食到菌数在2×108～6×108个较合适，鸡、鸭类每只每天采食1×108～4×108个较合适，牛、羊类每头每天采食1×108～5×108个。考虑到饲料加工过程中的损失，可以按此标准添加剂量上浮50%～100%。酵母菌类在猪饲料

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中每头每天采食量为5×109～8×108个为宜，鸡、鸭类为3×108～8×108个。 乳酸菌类主要用于乳猪，几乎没有用量限制，其使用主要受制于成本。

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第七节 畜禽微生态制剂的研究方向

一、筛选项同适用于特定日粮类型及特定动物种类的菌种。

二、筛选项出具有特殊用途的菌株，来满足动物对某一方面的要求。如产色素的菌株可以促进家禽皮肤鸡卵菌的着色，产植酸酶的菌株，可以提高饲料中磷的利用率，减少环境污染，筛选出能够利用纤维素分解菌生长及活性的菌种，以用于采食低粗饲料，筛选出除臭能力强的菌株，可以减少粪便对环境的污染。

三、加速包被技术的研究，寻找高效、廉价、无毒副作用的包被材料，优化包被工艺，用来包裹那些耐性较差，其他特性较好的菌株。

四、加快微生态制剂与抗生素关系的研究。抗生素的滥用已带来了严重的健康及环境问题。目前在疾病治疗方面，仍然离不开抗生素，但抗生素预防疾病和促进生长的作用，完全可以用其他安全的物质来代替，微生态制剂被认为是有前途的此类产品。

五、发展趋势。从国外开发和使用效果看，复合菌制剂较单一菌株的益生菌作用效果更好。复合菌制剂一般都有协同作用。为了提高微生态制剂的有效性，人们正着力于益生菌的辅助剂的研制与开发。如微胶囊的应用。同时人们也在开发和研究益生菌与其他制剂间的联合使用，如酶制剂、酸制剂、中草药等，充分利用制剂间的协同作用。益生菌作为转基因工程菌的研究已有报道，主要是将益生菌作为基因工程的受体菌，使之表达一些有用的外源基因，扩大其生物学特殊功能，从而达到一种制剂发挥多种功能的目的，还可以利用此来增强益生菌的稳定性。益生菌生产菌株的稳定性，一直是一大难题，以休眠形式代替活菌形式投入到饲料中饲喂动物是值得探讨的问题，再利用基因工程技术，使休眠的益生菌在动物体内特定位点激活，以发挥其预期效力。利用遗传工程技术，改善益生菌的耐热、耐酸等抗外界不良环境特性，采用各种生物技术开发出更多的益生菌品种，是值得深入研究的问题。

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本研究采用葡萄糖、蔗糖、大豆粉、玉米分、土豆粉、麦麸六种物质作为培养菌种的培养基碳源，研究其与菌体产量的关系，结果表明：对乳酸杆菌、芽孢杆菌、酵母菌三种微生物生长作用最好的碳源是葡萄糖。除了葡萄糖以外，能使乳酸杆菌快速生长的碳源还有蔗糖和土豆淀粉。而对芽孢杆菌来讲，除了葡萄糖以外，没有作用效果特别明显的葡萄糖替代品。酵母菌的碳源，除了作用最佳的葡萄糖以外，蔗糖和大豆粉作用效果较好。发酵培养不同的菌种，对碳源的浓度要求各有差异，但差异不明显。结果表明，混合发酵时，葡萄糖的含量以2%最佳。工业生产应用中，可以用土豆粉和大豆粉替代葡萄糖作为碳源，以浓度6.0%效果最佳。

（六）、培养基氮素营养与菌体产量的关系。

本研究采用上述植物油、蛋白胨、大豆粉、玉米粉、土豆粉、麦麸六种物质作为培养菌种的培养基氮源研究其与菌体产量的关系，结果表明：上叙所有氮源的效果都不如蛋白胨。对乳酸杆菌来言，最好的氮源是蛋白胨，除此以外，其他氮源的效果明显较差。原因是乳酸杆菌类微生物一般没有蛋白酶，不能分解蛋白质，氮源只能利用蛋白肽类物质。因此，在工业生产应用中，最好加入蛋白胨作为乳酸杆菌的氮源，以缩短“延迟期”的时间。对芽孢杆菌和酵母菌而言，除了蛋白胨可以作为氮源以外，植物油、大豆粉、玉米粉等也有一定的作用效果。本研究结果显示，在混合发酵过程中，蛋白胨的最佳用量为0.5%，植物油的最佳用量为0.3%。因大豆粉、玉米粉、土豆粉、麦麸四样物质，在作为培养基时，既可以提供氮源，又可提供碳源，因此，最佳使用量以作为碳源的6%为准。

五、非营养性物质与益生菌菌体产量的关系

本研究选取了低聚木糖、低聚果糖、低聚甘露糖三种寡糖，以及土霉素、金霉素、杆菌肽锌三种常用的抗生素来研究这些非营养性物质对益生菌的作用。低聚果糖和低聚木糖由山东龙力生物科技有限公司提供，低聚甘露糖由美国奥特奇公司提供。试验采用的乳酸杆菌培养基为MRS培养基，芽孢杆菌培养基为BPY培养基。酵母菌采用麦芽汁培养基。培养时间均为48h，乳酸杆菌和芽孢杆菌的培养温度为37℃，酵母菌的培养温度为32℃，培养初始PH值均为6.4，酵母菌和芽孢杆菌采用好气性培养，乳酸杆菌采用厌

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氧培育。低聚糖的浓度设0.05%～0.3%六处理，抗生素的浓度设1单位/g-10单位/g十个处理，研究结果如下：

（一）、低聚糖的种类与菌体产量的关系。

本研究中采用低聚木糖、低聚果糖、低聚甘露糖三种寡糖研究低聚糖与乳酸杆菌、芽孢杆菌、酵母菌的生长关系。研究表明，三种低聚糖无论是哪一种，都对乳酸杆菌具有特别明显的促进作用，作用效果最好的是低聚果糖，但三种寡糖的作用效果比较，没有显著差异。而三种低聚糖对芽孢杆菌和酵母菌的生长促进作用不大，与空白对照比较，没有明显差异。

（二）、低聚糖的浓度对乳酸菌的影响。

本研究中采用低聚木糖、低聚果糖、低聚甘露糖三种寡糖（浓度分别为0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%）研究低聚糖浓度作用效果的影响，结果表明：对乳酸杆作用效果最好的是低聚果糖，但浓度要求较高，在0.2%左右达到最佳效果；作用达到最佳效果所需要浓度最低的是低聚木糖，在0.075%时，即达到最佳作用效果，随着浓度的增加，作用效果反而降低。研究结果表明，在微生态制剂中，添加低聚糖时，低聚木糖是首选的寡糖品种，用量少、作用效果也明显。

（三）、抗生素与菌体产量的关系。

本研究中采用了土霉素、金霉素、杆菌肽锌三种常用的抗生素研究其对活菌制剂中三种微生物的影响。结果表明：无论是土霉素、金霉素还是杆菌肽锌，都对乳酸杆菌、芽孢杆菌和酵母菌的生长有抑制作用，只是抑制作用的程度不同而已。抑制作用最大的是金霉素和土霉素，杆菌肽锌对三种菌体的抑制作用较小。抗生素对三种菌的抑制能力随着浓度（1～10单位/g）的增加而增强。研究结果，探索抗生素与活菌剂的伍配使用，土霉素和金霉素是不成功的，杆菌肽锌还能与与活菌剂伍配，但还需要进一步研究。

六、 三元活性微生态制剂的研制 （一）、菌制剂菌种的种类与数量

在本研究所制取的产品中，采用了三个菌种，一是本研究自行分离选育的乳酸菌—

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LS-9，二是从中国科学院微生物研究所菌种保存中心引入的枯草芽孢杆菌—AS1.884，三是产朊假丝酵母菌—AS2.120（来源与芽孢杆菌相同）

菌种数量：乳酸杆菌3.6×108个/ml，枯草芽孢杆菌1.3×108个/ml，产朊假丝酵母菌2.1×108个/ml，有效活菌数7.4×108个/ml。

（二）、活菌制剂的培养基配方

研究结果表明：培养乳酸杆菌、芽孢杆菌和酵母菌的最好碳源是葡萄糖。在生产应用中，葡萄糖的替代物，对乳酸菌而言是土豆粉，对酵母菌而言是大豆粉。培养上述三种菌的最好氮源是蛋白胨，生产应用中的替代物是植物油。为了缩短生产发酵过程中菌种的延迟期，需适量添加蛋白胨和葡萄糖。而针对不同的用途，选择不同的主体菌种，进而选择不同的碳源和氮源。

猪用活菌制剂，主体菌种是乳酸菌，主体碳源是土豆粉。反刍动物和禽类用的活菌制剂，主体菌种是酵母菌，主体碳源是大豆粉。经筛选项，其优化配方为：

主体碳源6%+葡萄糖2%+蛋白胨0.5%+植物油0.3%+K2HPO40.2%、KH2PO40.2%、CaCO31%、MgSO40.06%、MnSO40.025%。

（三）、低聚糖的种类和比例：低聚糖的种类是低聚木糖，其比例为0.5%。

（四）、卵黄免疫球蛋白（IgY）的比例：0.1%，在制剂中的有效含量为320滴度/g。

（五）、蝇蛆蛋白粉比例：1%，其有效成份为蝇蛆抗菌肽。

综上所述，三元活性制剂的配方如下：

活菌剂98.4%+低聚糖0.5%+卵黄免疫球蛋白0.1%+蝇蛆蛋白粉1%。

七、三元活性制剂稳定性研究

（一）三元活性制剂微胶囊包埋材料的选择。

本研究选择阿拉伯胶、变性淀粉、海藻酸钠、琼脂、麦芽糊精和玉米糖浆作为三元活性制剂的微胶囊包埋壁材，对其进行了微胶囊包埋对比试验，结果表明：海藻酸钠5%+

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变性淀粉35%+阿拉伯胶15%+麦芽糊精25%+玉米粮浆20%作为微胶囊包埋壁材，效果最佳，包埋率高达97%以上。芯材原料（微生态制剂）与混合壁材的比为1：1。混和均匀后，通过喷雾干燥制成成品。在研究过程中发现，2%的氯化钙溶液有利于胶囊的形成和菌种包埋率的保持。

（二）三元活性制剂微胶囊包埋产品的热稳定性

本研究将制成的微胶囊包埋产品，通过70℃的高温热处理10min后研究其稳定性，结果表明，活菌的成活率高达88.7%，而没有经过包埋处理的产品，成活率只有41.5%（大部分是耐热性强的芽孢杆菌）。因此，经过微胶囊包埋后的三元活性微生态制剂完全可以制成颗粒饲料，而有效活菌含量不会因制粒过程中的高温而降低。

（三）三元活性制剂微胶囊包埋产品的酸稳定性研究。

本研究通过模拟胃液（含胃酸10%、胃蛋白酶1%、PH值4.0～5.0）测定了三元活性制剂微胶囊包埋产品的酸稳定性。结果表明：经微胶囊包埋处理后的三元活性制剂，通过模拟胃液2小时后，活菌的存活率还高达96.7%，卵黄免疫球蛋白的活性高达97%。而未包埋的产品，活菌的成活率只有77.4%，免疫球蛋白的活性只有91%，经过8小时的试验后，包埋后的产品活菌成活率仍然还有32%，而未包埋产品经过7小时后就已完全丧失了活性。

（四） 元活性制剂贮藏的稳定性

在三元活性制剂中，低聚木糖、卵黄免疫球蛋白及蝇蛆抗菌蛋白本身就具较强的贮藏稳定性，但是活菌制剂的耐藏性能就比较差。研究结果表明，经过微胶囊包埋处理的三元活性制剂，贮藏6个月后，活菌的存活率仍然高达92.9%，而未经包埋的产品只有51.1%的活菌存活率了。由此看来，微胶囊包埋技术，是延长微生态制剂货架期最有效的手段。贮藏更长的时间后，微胶囊包埋产品是否还具有较高的活性，仍需继续研究。

八、三元活性制剂抑菌能力的研究 （一）、菌制剂代谢产物的抑菌性

本研究将活菌制剂和“EM原”离心过滤后，取其上清液（代谢产物）进行了抑菌试

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验，并以培养基作第一对照，以乳酸作第二对照。结果显示，代谢产物对指示菌（动物肠道内常见的有益菌和病原菌）中的大肠杆菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌具有抑制作用，而对嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、青春双歧杆菌没有抑制作用。而活菌制剂的重要代谢产物乳酸，无论是对有益菌还是病原菌，都没有抑制作用。因此，本研究果证明，微生态制剂对病原菌起抑制作用的是其代谢产物，而这种代谢产物不是乳酸，而是乳酸以外的其他代谢物，如抗菌素等，具体是哪种物质起关键作用，还有待更深入研究。

（二）、活菌制剂代谢产物浓度对抑菌作用的影响。

本研究将活菌制剂离心过滤，取上清液（代谢产物）冻干后加无菌水，制成2.5～10倍浓缩液，以培养基作对照，进行了抑菌试验。结果表明，代谢产物的浓度越大，对指示菌的大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌能力越强。

（三）、三元活性制剂抑菌能力的比较

本研究比较了三元活性制剂、单项活菌剂、单项低聚木糖、单项免疫球蛋白、单项蝇蛆蛋白粉以及EM原的抑菌能力。结果表明，三元活性制剂的抑菌能力，明显高于单一物质和EM原，但作用效果（从抑菌圈直径大小上来看）并不是几种单一物质作用效果的累加。单一的低聚木糖，无论对哪种指示菌都没有抑制作用，单一的卵黄免疫球蛋只对特异菌种（抗原）如大肠杆菌和沙门氏菌有抑制作用，而对其他的病原菌没有作用。蝇蛆蛋白粉中起抑菌作用的主要成份是抗菌肽，是一种具有非特异免疫功能和广谱性抗菌能力的物质，对所有指示菌都有一定的抑制作用。

九、 三元活性制剂在畜禽养殖业中的应用研究

（一）、“春兴液”微生态制剂饲养断奶仔猪的效果

试验于2005年5月1日～28日，在湖南省桃源县畜禽良种场进行，用28日龄二元杂断奶仔猪（长×大）30头，在基础日粮中添加0.3%的三元活性制剂饲喂28天。结果表明：

1、试验组日增重为495.71g/头，比对照（298.93g/头）提高65。83%。

2、试验组平均日采食量为796.07克/日.头，比对照（546.4克/日.头）提高45.7% 3、试验组的料重（肉）比为1.61：1，对照组的料重（肉）比为1.83：1，试验组的

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