_葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型的研究进展_吴酬飞

α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型的研究进展

吴酬飞,许　杨﹡

,李燕萍

(南昌大学中德联合研究院食品科学教育部重点实验室,江西南昌　330047)摘要:α-葡萄糖苷酶抑制剂(a l p h a -g l u c o s i d a s e i n h i b i t o r s ,α-G I )是可用于治疗2型糖尿病的一类新型药物,广泛存在于植物果实、叶片和种子等组织器官中。近15年来,国内外从中草药中寻找新的α-G I 的研究渐趋活跃,逐渐成为防治糖尿病的热点。随着α-G I 的不断发现,构建更加符合人体糖尿病病理生理特征、更加具有临床意义的α-G I 高通量体外筛选模型,对降糖药的研发具有重要的意义。本文综述了以中草药为来源的α-G I 筛选研究进展,并对各种方法存在的问题和今后研究思路进行了探讨。

关键词:α-葡萄糖苷酶抑制剂;糖尿病;中草药

中图分类号:R 977.1+5,R 927.1　文献标识码:A 　文章编号:1674-0440(2008)01-0009-04

P r o g r e s s o nr e s e a r c ho f s c r e e n i n g m e t h o d s f o r a l p h a -g l u c o s i d a s e

i n h i b i t o r s f r o m C h i n e s e m e d i c i n a l h e r b s

W UC h o u -f e i ,X UY a n g ,L I Y a n -p i n g

(S i n o -G e r m a n y J o i n t R e s e a r c hI n s t i t u t e ,t h e K e y L a b o r a t o r y o f F o o dS c i e n c e o f M O E ,

N a n c h a n g U n i v e r s i t y ,N a n c h a n g 330047,C h i n a )

A b s t r a c t :A l p h a -g l u c o s i d a s e i n h i b i t o r s a r e n o v e l h y p o g l y c e m i c d r u g s w h i c h h a v e b e e n u s e d i n t h e t r e a t -m e n t o f t y p e 2d i a b e t e s m e l l i t u s s i n c e 1980s .I t h a s l o n g b e e n r e a l i z e d t h a t m a n y n a t u r a l l y o c c u r r i n g s u b -s t a n c e s i n p l a n t m a t e r i a l s s u c ha s f r u i t s ,l e a v e s ,s e e d s e t c ,h a v e i n h i b i t o r y e f f e c t o n a l p h a g l u c o s i d a s e .R e c e n t l y ,t h e r e s e a r c h o f s c r e e n i n gn e wa l p h a -g l u c o s i d a s e i n h i b i t o r s b o t h a t h o m ea n d a b r o a d h a s b e c o m e p o p u l a r a n d t h e t o p i c f o r t r e a t i n g a n d p r e v e n t i o n o f d i s e a s e s i n c l u d i n g d i a b e t e s m e l l i t u s .W i t h i n c r e a s i n g d i s -c o v e r y o f a l p h a -g l u c o s i d a s e i n h i b i t o r s ,i t i s n e c e s s a r y t o c o n s t r u c t a r e l i a b l e h i g h -t h r o u g h p u t w a y f o r s c r e e n i n g a l p h a -g l u c o s i d a s e i n h i b i t o r s .S u c h a c t i o n m a y h e l p t h e d e v e l o p m e n t o f a p o t e n t i a l f u n c t i o n a l f a c t o r f o r l o w e r i n g b l o o d g l u c o s e .I n t h i s p a p e r t h e a d v a n c e o f s c r e e n i n g m o d e l s f o r a l p h a -g l u c o s i d a s e i n h i b i t o r s f r o mC h i n e s e h e r b a l d r u g s a n d t h e i r d r a w b a c k s a r e r e v i e w e d ,t h e f u t u r e w a y o f r e s e a r c h i n t h i s f i e l d i s a l s o d i s c u s s e d .

K e y w o r d s :a l p h a -g l u c o s i d a s e i n h i b i t o r s ;d i a b e t e s m e l l i t u s ;C h i n e s e m e d i c i n a l h e r b s

　收稿日期:2007-07-03

　基金项目:长江学者和创新团队发展计划资助(N O .I R T 0540)

　作者简介:吴酬飞,男,在读硕士研究生,研究方向:微生物分子生

物学,E -m a i l :z j l x y w c f 20021108@y a h o o .c o m .c n

＊通讯作者:许　杨,女,教授,博士生导师,研究方向:微生物和食品生物技术,T e l :0791-*******,E -m a i l :x u y a n g 1951@163.c o m 　　糖尿病是一种内分泌代谢紊乱性疾病,临床以

高血糖、葡萄糖耐量减低及胰岛素释放试验异常为

主要标志。根据发病机制不同,分为1型糖尿病

(胰岛素依赖型)和2型糖尿病(非胰岛素依赖型),

后者约占糖尿病总数的85%以上。迄今为止,治疗2型糖尿病的药物根据治疗机制不同主要分为[1]:(1)促胰岛素分泌剂:如磺酰脲类;(2)胰岛素增敏剂:如屈吉他宗(t r o g l i t a z o n e )等噻唑烷衍生物;(3)α-葡萄糖苷酶抑制剂(α-G I ):如阿卡波糖等。α-G I 具有作用温和持久、毒副作用小甚至无毒的优点[2],得到越来越多国内外研究者的青睐。1　α-葡萄糖苷酶抑制剂的降血糖机制α-葡萄糖苷酶包括位于小肠腔的α-淀粉酶、小·

9·国际药学研究杂志　2008年2月　第35卷第1期

肠刷状缘的麦芽糖酶、α-糊精酶和蔗糖酶等。正常

人进食后,食物中的碳水化合物如淀粉先经α-淀粉酶作用生成麦芽糖、麦芽三糖、α-糊精等,随后和蔗糖一起通过蔗糖酶等α-糖苷酶水解作用生成葡萄糖、半乳糖和果糖,经肠壁细胞吸收而被机体利用。糖尿病患者因代谢障碍而导致血糖浓度发生异常改变。预防和治疗这类疾病的有效方法之一是限制或延缓多糖在消化道内分解,为此就必须降低α-葡萄糖苷酶活性。α-G I 通过可逆地占据α-葡萄糖苷酶与糖的络合位点,抑制α-葡萄糖苷酶催化多糖降解为单糖,从而延缓肠道碳水化合物的吸收。与其他口服降糖药及胰岛素治疗相比,α-G I 类药物最显著的特征是能有效阻止糖尿病患者的餐后血糖升高

[3]

,使患者血糖平稳且缓慢地维持在一定水平,

改善血糖稳定指数;由于抑制了α-葡糖糖苷酶对肠

道碳水化合物的分解速度,避免了餐后可能发生的血糖过高

[4]

。另外,α-G I 具有调节脂肪生成、抗

A I D S 病毒感染等作用。因此,α-G I 成为安全高效的抗糖尿病药物。

2　α-葡萄糖苷酶抑制剂的种类

根据文献报道:在天花粉、虎杖、人参、山药、麻黄、灵芝等[5]70余种中药和松树[6,7]

等植物的果实、叶片和种子中都存在具有降血糖作用的成分,而某些成分具有类似酶抑制剂的作用。α-G I 成分随来源物不同而不同,主要有多糖、生物碱、苷类、多肽、糖苷类、黄酮类、皂苷和酚类等。桑叶热水提液具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性,对其降糖作用及有效成分的研究发现,桑叶多糖有较强的糖吸收抑制

活性[8]

。从野生苋属植物籽实中提取得到的一种新型α-G I ,降血糖活性呈剂量依赖关系。其由9个氨基酸残基组成,是目前报道的分子量最小的α-G I [9]

。采用不同溶剂萃取和逐级分离方法,从甘草中提取的甘草酚有明显的α-糖苷酶抑制活性。其降血糖活性也呈剂量依赖关系且作用迅速

[10]

。

3　α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型的研究

迄今为止,许多学者在α-G I 筛选模型方面进行了大量的研究工作。研究对象主要有:酶-抑制剂模型(体外筛选模型)和高血糖动物模型(体内筛选模型)。应用上述筛选平台,先后陆续发现了70余种中草药提取物具有α-糖苷酶抑制活性和数十种降糖活性因子。但由于现有的筛选模型不够完善,筛

选得到的α-G I 体内外活性差异巨大,有的在体内甚至完全没有抑制活性,所以构建新型的筛选平台已迫在眉睫。

3.1　酶-抑制剂模型3.1.1　以4-硝基酚-α-D -吡喃葡萄糖苷为底物的酶-抑制剂筛选模型　4-硝基酚-α-D -吡喃葡萄糖苷(P N P G )是麦芽糖类似物。以P N P G 为底物测定中草药提取物或降糖活性成分对α-葡萄糖苷酶抑制活性大小,从中草药中筛选强活性降糖活性因子是目前最常用、最经典的筛选方法。其基本操作过程:首先向磷酸钾缓冲液的酶活力测定系统中加入α-葡萄糖苷酶,37℃保温10m i n ,加入P N P G 后,37℃反应10m i n ,加入N a 2C O 3终止反应,在400n m 处测定酶作用下释放的硝基酚的吸光度。然后再取筛选样品加入酶活力测定系统中,先将酶于37℃保温10m i n ,再加底物37℃反应10m i n ,加入N a 2C O 3终止反应,在400n m 处测定酶作用下释放的硝基酚的吸光度。最后将两次吸光度值相比即得抑制百分率。这一筛选方法的建立为α-G I 的体外筛选奠定了基础,被公认对α-G I 的研究具有里程碑式意义。筛选过程经济、快捷,并可进行体外直接筛选,因此,这一筛选模型特别适用于α-G I 的初步筛选。

应用P N P G 为底物的酶-抑制剂筛选模型,已从中草药中筛选到一批具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的降糖活性因子,有的已广泛应用于临床实践中。沈忠明等[11]

采用P N P G 酶活性测定方法从几十种有降糖功效的中药材中筛选出具有显著抑制α-葡萄糖苷酶活性的中药五味子,但是还不清楚其抑制成分的结构和物质基础。由于该模型只能筛选到对麦芽糖酶有强活性的抑制类药物,无法筛选到同时对α-淀粉酶、蔗糖酶、麦芽糖酶等α-糖苷酶具有抑制作用的α-G I ,更是无法直接评价筛选得到的降糖物质在体内的药效作用。因此。该方法筛选得到的α-G I 假阳性率高、体内外活性差异较大或体内活性低、临床效果不理想。

3.1.2　以淀粉、蔗糖、麦芽糖为底物的酶-抑制剂筛选模型　作为第二代酶-抑制剂筛选模型,以淀粉、蔗糖、麦芽糖等α-葡萄糖苷酶直接水解物为底物的筛选模型的具体筛选过程与以P N P G 为底物的筛选模型基本相同,只是所用底物不同。其具有以下优点:(1)具有P N P G 底物筛选模型的经济、快捷,可在体外进行筛选等优点;(2)筛选得到的α-G I 靶向作用具体,作用机制确切。α-淀粉酶、蔗糖酶、麦芽

·10·I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o f P h a r m a c e u t i c a l R e s e a r c h 　2008F e b ;35(1)

糖酶等α-葡萄糖苷酶是体内碳水化合物消化吸收的关键酶,其作用底物分别为淀粉、蔗糖、麦芽糖等。如果一种物质抑制α-淀粉酶水解淀粉、或抑制蔗糖酶水解蔗糖、或抑制麦芽糖酶水解麦芽糖,则该物质就具有相应酶抑制活性;如果同时具有2种或2种以上的酶抑制作用,则该物质就具有2种或2种以上相应酶的抑制活性;(3)与P N P G底物筛选模型相比,假阳性率较低。另外,这种筛选模型还具有定向筛选的特点。基于上述优点,第二代酶-抑制剂筛选模型是一种行之有效的筛选方法。2004年,全吉淑等[12]以大豆为研究对象,以蔗糖-小鼠小肠粘膜蔗糖酶、麦芽糖-小鼠小肠粘膜麦芽糖酶为筛选模型,报道了大豆异黄酮和皂苷的I C50值分别为11.5 g·L-1和57g·L-1。

虽然早已有从人胰腺和唾液中成功分离纯化出α-淀粉酶的报道[13],但由于其材料来源有限,无法形成规模化生产,价格极其昂贵。因此,近年来的以淀粉、蔗糖、麦芽糖为底物的酶-抑制剂筛选模型所使用的α-淀粉酶大多为猪胰型酶,蔗糖酶、麦芽糖酶等,其他α-葡萄糖苷酶大多来源于酵母。猪、酵母的遗传型存在的差异造成它们所表达的酶也必然有差异。这一事实使该筛选模型无法做到与糖尿病患者体内情况完全一致,也无法直接评价α-G I的体内药效,最终还需要高血糖动物做药理试验研究。3.2　高血糖动物筛选模型

高血糖动物模型具体的筛选思路是:首先构建高血糖动物模型,然后将待筛样品注射或灌胃该动物模型,通过观察动物血糖浓度的变化评价该样品的药效作用大小,最后进行作用机制和作用靶位的研究。其主要包括四氧嘧啶、肾上腺素、氨基葡萄糖等所致的动物高血糖模型和原发性糖尿病小鼠(N O D小鼠)模型。

四氧嘧啶所致高血糖动物模型由于其构建方法成熟,以及由四氧嘧啶破坏胰岛β细胞所致的高血糖具有代表性而得到广泛应用。戚向阳等[14]研究发现,低剂量(0.5g·k g-1)、中剂量(1g·k g-1)的罗汉果提取物灌胃30d可明显降低四氧嘧啶高血糖小鼠血糖水平。罗汉果提取物低剂量(0.5g·k g-1)组小鼠的糖耐量曲线较对照组下移,餐后0.5h的血糖浓度明显低于对照组。这说明该药的作用机制可能与减弱四氧嘧啶对胰岛β细胞的损伤或改善损伤细胞的功能有关。

采用该筛选模型筛选药物的突出困难是:实验周期长,耗资大[15]、化合物用量大、难度大,无法做到同时进行上百种中草药或其成分筛选,更不能阐明其作用的有效成分及作用特定靶点。但具有检测方法比较深入细致、结果相对可靠等优点。因此基于高血糖动物模型的方法不太适合大量筛选的要求,但可用于进一步的生物活性验证。

3.3　其他筛选模型

3.3.1　微孔板筛选模型　为了筛选到强抑制活性的α-G I,研究人员往往必须同时检测数百种中草药甚至上千种活性组分对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。李婷等[16]建立的96孔微孔板筛选方法可进行体外的高通量筛选。该方法的一般反应步骤是:96孔板,160μL体系含2.5m m o l·L-1的底物和0.2U·m L-1的α-葡萄糖苷酶,37℃,p H7.0反应15m i n,分光光度计于400n m处检测。由于使用小体积样品筛选,微孔板筛选模型灵敏度高、筛选结果正确可靠,并具有体外高通量筛选等优点。因此,该方法将对高活性降糖因子的筛选起到巨大推动作用。

3.3.2　固定化酶筛选模型　据报道[17],α-葡萄糖苷酶在跨越双分子层膜多肽链锚定在膜上时,N端在内,C端在外。在体外进行α-G I筛选时,如果筛选得到的α-G I是通过与α-葡萄糖苷酶的N端相互结合而抑制其活性,那么,从理论上讲,该抑制剂在体内就会完全失去抑制作用。固定化酶筛选模型通过把α-葡萄糖苷酶的N端固定在载体上,模拟它在体内的存在状态,从中草药中筛选出作用于α-葡萄糖苷酶C端的α-G I。这种筛选方法既可排除作用于N端抑制剂的假阳性,又可直接在体外评价α-G I 的体内作用效果,还可以研究一些已知能够治疗糖尿病的天然产物的作用机制。与游离酶相比较,固定化酶筛选模型的酶由于N端被固定,其空间结构有所制约,从而使与底物结合受到一定程度的限制,导致其在实验中的活力偏低,但这正是它模拟酶的体内情况,所以实验中反映出来的数据更接近体内真实作用情况。

还有许多基于上述筛选模型衍生出来的筛选新方法也相继被报道[18,19]。如英国学者构建的以放射自显影技术为基础的、可用于寡糖α-G I筛选的筛选新途径等。

4　展望

基于α-葡萄糖苷酶分子水平的高通量筛选技术具有微量、快速、灵敏、准确的特点,可以在短时间

·

11

·

国际药学研究杂志　2008年2月　第35卷第1期

内对数以千、万计的样品进行测试。同时,对于同一

种样品,可以在不同的模型上筛选,大大增加了发现新药的几率,但目前高通量筛选模型还存在假阳性率高的问题。主要原因是由于不同来源的α-葡萄糖苷酶结构不同,所以α-G I 对不同来源的α-葡萄糖苷酶抑制活性会存在差异。如赤松皮乙醇提取物对人和猪胰型α-淀粉酶具有抑制活性,却对米曲霉(A s p e r g i l l u s o r y z a e )来源的α-淀粉酶无抑制作用[6]

。固定化酶技术可大大降低假阳性率。首先利用基因工程技术,实现人α-葡萄糖苷酶在原核或真核表达体系中大量表达;其次通过把α-葡萄糖苷酶的N 端固定在载体上,模拟它在体内的存在状态,从中草药中筛选出作用于α-葡萄糖苷酶C 端的α-G I 。这种筛选平台既可排除作用于N 端抑制剂的假阳性,又可直接在体外评价α-G I 的体内作用效果。

近年来,随着计算机技术和生物信息学的快速发展,应用计算机虚拟配体技术

[21]

进行体外药物筛

选已经成为一种与高通量筛选互补的实用化工具。筛选过程无需消耗样品和其他实验材料,既省时又经济,但是目前还没有看到应用该技术筛选α-G I 类药物的相关报道。如果能够把它应用于α-G I 早期筛选工作,将会大大加快新型α-G I 类药物研制速度。

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