植物生理学实验讲义2

实验一 植物组织渗透势的测定（质壁分离法）

实验目的：

观察植物组织在不同浓度溶液中细胞质壁分离的产生过程及其用于测定植物组织渗透势的方法。

原 理

当植物组织细胞内的汁液与其周围的某种溶液处于渗透平衡状态，植物细胞内的压力势为零时，细胞汁液的渗透势就等于该溶液的渗透势。该溶液的浓度称为等渗浓度。

当用一系列梯度浓度溶液观察细胞质壁分离现象时，细胞的等渗浓度将介于刚刚引起初始质壁分离的浓度和尚不能引起质壁分离的浓度之间的溶液浓度。代入公式即可计算出渗透势。

器材与试剂：

1．显微镜 、载玻片及盖玻片、镊子、刀片

2．100mL浓度为1mol/L蔗糖溶液: 用蒸馏水配成0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50mol/L的蔗糖溶液各50mL。

称34.23g蔗糖用蒸馏水配成100ml，其浓度为1mol/L（母液）。再配制成下列各种浓度： 0.50mol/L：吸母液25ml+水25ml 0.45mol/L：吸母液22.5ml+水27.5ml 0.40mol/L：吸母液20.0ml+水30.0ml 0.35mol/L：吸母液17.5ml+水32.5ml 0.30mol/L：吸母液15.0ml+水35.0ml 0.25mol/L：吸母液12.5ml+水37.5ml 0.20mol/L：吸母液10.0ml+水40.0ml 0.15mol/L：吸母液7.5ml+水42.5ml 0.10mol/L：吸母液5.0ml+水45.0ml 3．实验材料 洋葱鳞茎

实验步骤：

1． 将带有色素的植物组织（叶片），一般选用有色素的洋葱鳞片的外表皮、紫鸭

跖草、苔藓、红甘蓝或黑藻、丝状藻等水生植物，也可用蚕豆、玉米、小麦等作物叶的表皮。

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撕取下表皮，迅速分别投入各种浓度的蔗糖溶液中，使其完全浸入，5—10分钟。

2． 从0.5mol/L开始依次取出表皮薄片放在滴有同样溶液的载玻片上，盖上盖玻

片，于低倍显微镜下观察，如果所有细胞都产生质壁分离的现象，则取低浓度溶液中的制片作同样观察，并记录质壁分离的相对程度。

3． 实验中必须确定一个引起半数以上细胞原生质刚刚从细胞壁的角隅上分离的

浓度，和不引起质壁分离的最高浓度。

4． 在找到上述浓度极限时，用新的溶液和新鲜的叶片重复进行几次，直至有把握

确定为止。在此条件下，细胞的渗透势与两个极限溶液浓度之平均值的渗透势相等。

将结果记录下表中。

测出引起质壁分离刚开始的蔗糖溶液最低浓度和不能引起质壁分离的最高浓度平均值之后，可按下列公式计算在常压下该组织细胞质液的渗透势。

??s?RTiC

??s为细胞渗透势。

R为气体常数=0.083×105/L·Pа/mol·K。 T为绝对温度，单位K，即273℃+t，t为实验湿度。 I为解离系数，蔗糖为1。

C为等渗溶液的浓度，单位为mol/L。 则：??s=0.083×105×(273℃+t)×1×C

作业与思考题：

1． 绘制细胞质壁分离前后的细胞图。 2． 计算植物细胞的渗透势。

实验二 植物组织水势的测定（小液流法）

实验目的：

了解植物组织中水分状况的另一种表示方法及用于测定的方法和它们的优缺点。

实验原理：

植物组织的水分状况可用水势来表示。植物体细胞之间、组织之间以及植物体与环境之间的水分移动方向都由水势差决定。将植物组织放在已知水势的一系列溶液中，如果植物的

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水势小于溶液的渗透势（溶质势），则组织吸水而使溶液浓度变大；反之，则植物细胞内水分外流而使溶液浓度变小；若植物组织的水势与溶液的渗透势相等，则二者水分保持动态平衡，所以外部溶液浓度不变，而溶液的渗透势即等于所测植物的水势。

组织的吸水或失水会使溶液的浓度、密度、电导率以及组织本身的体积与质量发生变化。根据这些参数的变化情况可确定与植物组织等水势的溶液。

可以利用溶液的浓度不同其比重也不同的原理来测定试验前后溶液的浓度的变化，然后根据公式计算渗透势。

仪器药品：

试管、毛细滴管、移液管、剪刀、镊子、甲烯蓝、菠菜叶片

操作步骤：

1．首先配制一系列不同浓度的蔗糖溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mol/L）各10 ml注入8支试管中，各管都加上塞子，并编号。按编号顺序在试管架上排成一列，作为对照组。

2．另取8支试管，编好号，按顺序放在试管架上，作为试验组。然后由对照组的各试管中分别取溶液4ml移入相同编号的试验组试管中，再将各试管都加上塞子。

3．用剪刀将菠菜叶剪成约0.5cm2大小相等的小块60—80片。向试验组的每一试管中各加相等数目（约10片）的叶片小块，塞好塞子，放置30分钟，在这段时间内摇动数次，到时间后，用大头针沾取少许甲烯蓝粉末加入每一试管中, 并振荡, 此时溶液呈蓝色。

4．用毛细滴管从试验组的各试管中依次吸取着色的液体少许，然后伸入对照组的相同编号试管的液体的中部，缓慢从毛细滴管尖端横向放出一滴蓝色试验溶液，并观察小液滴移动的方向。如果有色液滴向上移动，说明溶液从细胞液中吸出水分而被冲淡，比重比原来小了；如果有色液向下移动，则说明细胞从溶液中吸了水，溶液变浓，比重变大；如果液滴不动，则说明试验溶液的密度等于对照溶液，即植物组织的水势等于溶液的渗透势。

记录液滴不动的试管中蔗糖溶液的浓度。 重复测定一次。

按??w?RTiC计算水势。式中??w为细胞水势。

作业与思考题：

3． 计算植物细胞的水势。

3

4． 为什么蓝色试验液滴不动说明试验溶液的密度等于对照溶液?

实验三 叶绿体色素的提取、分离及理化性质的鉴定

（纸层析法）

实验目的：

了解叶绿素提取分离的原理以及它们的光学特性在光合作用中的意义。

实验原理：

叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。从植物叶片中提取和分离色素是对其认识和了解的前提。利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用丙酮提取。并可根据它们在不同有机溶剂中的溶解度不同以及在吸附剂上的吸附能力不同, 将它们彼此分离开。

分离色素的方法有多种，纸层析是其中最简便的一种。当溶剂不断地从层析滤纸上流过时，由于混合物中各成分在两相（即流动相和固定相）间具有不同的分配系数，它们的移动速度不同，使样品中的混合物得到分离。

器材与试剂：

大试管、台天平、研钵、量筒、烧怀、漏斗、软木层、新华滤纸； 丙酮、四氯化碳、无水硫酸钠、碳酸钙、石英砂

操作步骤

1．称取新鲜叶子2 g，放入研钵中加丙酮 5ml，少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，再加丙酮 5 ml，然后以漏斗过滤之，即为色素提取液。

2．取准备好的滤纸条（宽2 cm），将其一端剪去两侧，中间留一长约1.5cm，宽约0.5cm的窄条，如图。

4

3．用毛细管取叶绿素溶液点于窄条的上方，注意一次所点溶液不可过多。如色素过淡，用电吹风吹干后再点1一2次。

4．在大试管中加入四氯化碳3—5ml及少许无水硫酸钠。然后将滤纸条固定于软木塞上，插入试管内，使窄端浸入溶剂中（色素点要略高于液面，滤纸条边缘不可碰到试管壁），盖紧软木塞，直立于阴暗处进行层析。

5．经过0.5一1小时后，观察分离后色素带的分布。最上端橙黄色为胡萝卜素，其次黄色为叶黄素，再下面蓝绿色为叶绿素a，最后的黄绿色为叶绿素b。

6、铜代反应 取上述色素丙酮提取液少许于试管中, 1滴1滴加浓盐酸,直至溶液出现褐绿色, 此时叶绿素分子已遭破坏, 形成去镁叶绿素。然后加醋酸铜晶体少许, 慢慢加热溶液, 则又产生鲜亮的绿色。此即形成了铜代叶绿素。

作业与思考题：

1． 绘制叶绿体色素的柱层析图谱

2． 提取叶绿素时为什么要加入少量CaCO3, 加多了会出现什么问题?

实验四 叶绿素 a和b含量的测定（分光光度法）

实验目的：

熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。

实验原理：

如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽有明显的差异，但吸收曲线彼此又有些重叠；在这种情况下要分别测定两个组分，可根据Lambert-Beer定律，通过代数方法，计

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实验七 赤霉素 3的生物鉴定

（水稻幼苗第二叶叶鞘伸长的“点滴法”）

实验目的

学习并掌握利用水稻幼苗第二叶叶鞘伸长的“点滴法”测定赤霉素3)的方法，了解赤

霉素对叶鞘伸长的作用

实验原理

赤霉素能刺激幼嫩禾本科植株的节间伸长。将GA3 点滴于水稻胚芽鞘与第一叶之间，在一定的浓度范围内，第二叶叶鞘的伸长与赤霉素浓度的对数成正比。通过测定第二叶叶鞘伸长来进行赤霉素含量的生物测定。

器材与试剂

1. 实验仪器 光照培养室、移液管, 洗耳球, 高压灭菌锅, 小镊子, 刻度尺, 移液枪

2. 实验试剂 饱和漂白粉溶液, 琼脂, 500μmol/LGA3 母液（称取8.6mgGA3 (GA3 相对分子质量:346.38)溶于少量无水或95%乙醇中，再用水湿稀释至50ml；用蒸馏水稀释母液配制0.1、1、10、100μmol/L的标准溶液） 3. 实验材料 水稻种子

实验步骤

1. 水稻灭菌30min（饱和漂白粉溶液）, 自来水冲洗。将种子置于垫有滤纸的培养皿

中, 加水淹没种子,在30℃培养箱中黑暗萌发2d, 此时大部分种子开始露白。 2. 配制0.9%的琼脂, 高压灭菌, 倒入直径9cm的培养皿中。

3. 选取芽长2mm左右的种子, 胚芽朝上且偏于一侧排放在培养皿中的琼脂上, 每皿30粒。在30℃、光强5000-10000lx的培养箱或培养室中, 连续光照培养, 注意保持湿度。 4. 2d后, 选取刚伸出第二叶叶尖的幼苗（苗长0.9-1.0cm ) 。用微量移液器将1μL不同浓度的GA3 标准溶液分别小心滴于幼苗的偏于一侧的胚芽鞘与第一叶叶腋间与第一叶

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之间, 主意要使小液滴正好停留在胚芽鞘与第一叶之间，不使滑落, 如小液滴滑落, 立即拔除这株幼苗。

5．幼苗继续培养3d后, 测定第二叶叶鞘长度

6. 以GA3 标准浓度的对数与叶鞘长度绘制标准曲线, 可以看到在一定浓度范围内, 第二叶叶鞘的伸长与GA3 浓度的对数成比例。

将待测溶液处理后测得的叶鞘伸长数值, 在标准曲线上查得其相应的GA3浓度, 即算得样品中GA3 含量。

注意事项：

1. 用GA3 处理幼苗时, 一定要使液滴停留于胚芽鞘和叶腋间。 2. GA3 母液的配制要精确, 稀释也要准确。

作业：

1、 绘制GA3 标准浓度的对数与叶鞘长度绘制标准曲线。 2、 分别采用小麦和水稻为实验材料，比较和分析实验结果。

实验八 植物体内丙二醛含量的测定

实验目的：

熟悉测定丙二醛（MDA）含量的常用方法

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实验原理：

植物器官在逆境条件下或衰老时, 往往发生膜脂过氧化作用, 丙二醛是其产物之一, 通常将其作为脂质过氧化指标, 用于表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。 在酸性和高温的条件下, 丙二醛可与硫代巴比妥酸(TBA)在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应，生成红棕色的三甲川（3、5、5－三甲基恶唑2、4－二酮），三甲川最大的吸收波长在532nm。但是测定植物组织中丙二醛(MDA)时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收。

植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。

低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁离子，通常植物组 织中铁离子的含量为100～300μg·g·DW，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe

＋

－1

-1

-1

3

的终浓度为0.5nmol· L 。在532nm和450nm波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛

含量。

器材与试剂：

1. 实验仪器 分光光度计, 离心机, 研磨器, 恒温水浴, 具塞试管，电炉。

2. 实验试剂 10%三氯乙酸, 石英砂,硫代巴比妥酸（TBA）溶液（用10%TCA配置0.6%的TBA溶液）

3. 实验材料 植物叶片。

实验步骤：

1. MDA的提取 冬天寒流刺激，植物为抵抗严寒，丙二醛含量会增加，取叶片1g将其剪碎, 加入10%三氯乙酸（TCA）2ml和少量石英砂，研磨；进一步加入8mLTCA充分研磨, 匀浆液以4000×g离心10min, 上清液即为样品提取液。

2. 显色反应及测定 吸取2mL提取液, 加入2mL0.6%TBA液, 混匀,在试管上加盖塞, 置于沸水浴中沸煮15min, 迅速冷却, 离心。取上清液测定532nm和450nm下的OD值。对照管以2mL水代替提取液。

3. 计算 MDA与TBA反应产物的最大吸收峰在532nm，TBA与可溶性糖（以蔗糖为例）的反应产物的最大吸收峰在450nm，吸收曲线彼此又有重叠。

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根据Lambert-Beer定律, 最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液, 它们的浓度C与OD值之间有如下关系

OD1 = Ca·εa1 + Cb·εb1 OD2 = Ca·εa2 + Cb·εb2

式中: OD1 为组分a和组分b在波长λ1 时光密度值之和; OD2 为组分a和组分b在波长λ2 时光密度值之和; Ca 为组分a的浓度 Cb 为组分b的浓度

εa1、εb1分别为组分a、b在波长λ1 处的摩尔吸收系数。

同理, 组分a、b在波长λ2 处的摩尔吸收系数分别为εa2、εb2。

已知蔗糖与TBA反应产物在450nm和532nm的摩尔吸收系数分别为85.40、7.40； MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下无吸收, 吸收系数为0, 于532nm波长下的摩尔吸收系数为155000。据

OD450 = C1×85.4 OD532 = C1×7.4+155000×C2

求解方程得:

C1=0.01171×OD450

C2=6.45×10×OD 532 -0.56×10×OD450

式中: C1 为可溶性糖与TBA反应产物的浓度，单位是mol/L; C2 为MDA与TBA反应产物的浓度，单位是mol/L。

-6

-6

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根据公式 C2, 然后再计算每克样品中丙二醛的含量μmol C2/100)

作业：

1、 计算植物叶片丙二醛的含量。

2、 分别采用两种不同植物叶片（菠菜和小麦）为实验材料，比较和分析两者的结果。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/srr6.html