A型流感病毒NS1蛋白研究进展(1)-修改稿 - 图文

A型流感病毒非结构蛋白NS1的研究进展

摘 要：A型流感病毒的非结构蛋白NS1全长约为230aa，包含RNA结合区和效应区两个重要的功能区。A型流感病毒中，NS1是绝无仅有的非结构蛋白，它能够对流感病毒表现出的致病性、毒力等起到相应的调节作用。当前阶段，NS1蛋白全长及两个重要功能区的结构也已经解析，我们可直观的认识其各个功能位点的作用机制。本文关于NS1蛋白的进化、结构、调节病毒的致病性等方面做简要综述。 关键词：A型流感病毒；非结构蛋白NS1；致病性；功能；结构

A型流感病毒属正黏液病毒科，RNA病毒属，是一种严重危害人类及禽畜健康的病毒，感染人、禽、猪等约20种以上的物种。其基因组为单股负链RNA，包含8个大小不同的RNA片段，其中第8条RNA编码非结构蛋白1，即NS1，全长约为230aa。作为A型流感病毒中极为关键的非结构蛋白，其调节活性相对较好。NS1蛋白，只能在已感染病毒的细胞中存在，而单个病毒粒子是没有NS1的，所以才被称为非结构蛋白。NS1能够对流感病毒表现出的致病性、毒力等起到相应的调节作用，其功能位点氨基酸具有很强的遗传保守性。而流感病毒的高度变异性，限制了流感疫苗的使用，常用的抗流感药物也逐渐出现耐药性，因此对NS1的细致探讨，为临床诊断和预防A型流感病毒指明了方向。这几年，NS1蛋白相关的进化、组成、调节病毒的致病性等方面都做了深入的研究，本文对此简要综述。 1. NS1蛋白基因的分群及进化分析

NS1蛋白，最显著的特征在于拥有NS基因编码。NS基因序列有着明显的同源性，据此可将NS基因划分成两个等位，其一为基因群A，其二为基因群B。群内基因具有较强的同源性，高达90%；群和群之间的同源性则只有72%左右[1]. Ludwig等[2]研究发现，基因群A编码所

有的人、猪、马的流感病毒和部分禽流感病毒的NS1蛋白，而基因群B则编码其余的禽流感病毒的NS1蛋白。Suarez[3]等人选取106株NS基因进行分析（均为A型流感病毒，且来自不同地点）。他分别对基因群A、B进行分类，前者被分成成5个分支，后者则被划为2个分支。William G等[4]将研究地点确定为意大利北部，时段为1999-2003年。通过对该地域40株与禽流感病毒（H7N1）相关的NS1基因，最终得出：编码生长正常（230aa）的毒株数量共计16株，C-端缺失编码（220aa）的毒株数量共计6株，其余18株毒株间断性缺失编码（224aa），且C端间隔性缺失者均带有较强的致病性。刚开始流行时，致病性偏低的毒株均拥有较为正常的NS1基因序列；最后，逐渐开始缺失。

2. NS1蛋白的结构

NS1蛋白目前被分为RNA结合区和效应区（即RBD和ED）两个重要的功能区。第1～73位aa为RNA结合区，其中19～38位aa是核心区，能与异源RNA结合[5]。RNA结合区由3个α螺旋（分别是1～30位，30～50位，50～73位aa）构成，它们之间通过环相连，第二个螺旋中的R38位和K41位是NS1蛋白的功能性位点，对NS1蛋白和dsRNA结合具有重要作用[6，7]，第一个NS1全长结构就是将这两个功能性位点突变为丙氨酸后结晶解析出来的。从74位aa开始至羧基端，为NS1的效应区，效应区的功能包括阻断宿主mRNA的剪接，逐渐酸化多聚腺苷，抑制核转运等等[8]。除此之外，34～44位和203～237位是2个核定位信号区（NLS）。34-44位相对较为保守，且普遍出现于A型流

感病毒株身上，序列Asp-Arg-Leu-Arg-Arg；而后者仅发现在部分病毒株中。 2.1 RNA结合域

通过对PDB晶体结构当前所建立起的数据库进行检索，我们发现：A型流感病毒相关的NS1蛋白，共检索到6条RBD晶体记录。我们对6个被检索到PDB及其ID进行统计，结果如下：1）1NS1；2）1AIL；3）2ZKO；4）2ZOA；5）3F5T；6）3M8A。借助DiscoveryStudio2.1软件，我们对上述RBD结构做出系统分析，最终得出：二级结构均拥有相同的折叠方式，其区别仅在于两个细节方面：一个为loop区；另一个则为少数氨基酸侧链。RBD单体结构均由3个α-螺旋组成，分别为α1、α2、α3（分别是1～30位，30～50位，50～73位aa），螺旋之间由loop区连接[9]。RBD结构如图1所示[10]。通过结构分析，RBD结构域是一个对称的同源二聚体，这种二聚体结构在不同的毒株之间高度保守，6个螺旋的同源二聚体来识别dsRNA的[10,11]，其中R38位和K41位是NS1蛋白的功能性位点，对RBD的RNA结合至关重要。图2为RBD与dsRNA复合物晶体结构（PDB ID：2ZKO），二聚体和dsRNA结合比是1：1，已经解析出NS1 RBD与dsRNA的相互作用模式：RBD表面有一个较深的口袋，2个反向平行的a-螺旋a1、a1'形成口袋的底面，实现对dsRNA的结合，四壁由反向平行a-螺旋a2 、a2'形成。

引自[Liu, J., et al..Nat Struct Biol, 1997. 4(11): p. 896-9.]

图1 RBD的晶体结构

Fig.1 Cartoon representation of the RBD structure

引自[Cheng, A., S.M. Wong, and Y.A. Yuan. Cell Res, 2009. 19(2): p. 187-95.]

图2 RBD和RNA复合物的晶体结构

Fig.2 Overall structure of NS1A RBD bound to siRNA duplex.

截止今日，在NS1-RBD中，有关RNA结合功能仍未得到彻底明确。下列观点已得到医学界的认可：RBD、dsRNA两者间的结合能够对dsRNA起到一定的隔离作用，使其无法和细胞里面能够诱导I型干扰素激活的其他蛋白发生作用，最终使得宿主细胞不能产生β-干扰素，从而拮抗了宿主细胞的抗病毒反应。NS1蛋白的功能依赖于它结合的RNA类型：与成熟细胞mRNA的3'-poly（A）结合的时候，可抑制其mRNA核输出[12]；与双链RNA（dsRNA）的结合，通过间接阻止

α/β干扰素的生成来降低宿主细胞的抗病毒能力；与U6snRNA、U6atacsnRNA的结合，对前体mRNA的剪辑进行抑制[13-14]；另外NS1与病毒RNA结合后，再与结合eIF4GI的ED进行联合，以提高病毒的翻译等。 2.2 效应区结构

通过对PDB晶体结构当前已建立起的数据库进行检索，我们发现：A型流感病毒相关的NS1蛋白，共检索到9条ED晶体记录。我们对9个被检索到PDB及其ID进行统计，结果如下：1）2KKZ；2）3EE8；3）3EE9；4）3D6R；5）2RHK；6）2GX9；7）3F5T；8）2RHK；9）3KWI。借助DiscoveryStudio2.1软件，我们对上述RBD结构做出系统分析，最终得出：除在loop区以及羧基端末尾处有所不同外，二级结构几乎相同[15,16,17]。晶体学研究显示，效应区都可以独立的进行二聚化，每个单体由个7个β-链和3个α-螺旋组成。效应域包含细胞、蛋白两者间多个不一样的结合位点。最常见的有：1）延伸起始因子(简称eIF4GI)；2）双链RNA依赖的蛋白激酶(简称PKR)；3）多聚腺苷酸结合蛋白II（简称PAB II）等，它们均拥有蛋白的属性、功能。目前只有NS1-CPSF30复合物的晶体结构，NS1与其它蛋白的相互作用机制研究的并不是很清楚。此外，ED对NS1二聚体的形成和稳定有一定作用[16]。

2.3 NS1蛋白全长晶体结构

2008年12月, Bornholdt和Prasad等[15]报道了A型禽流感病毒株H5N1(A/Vietnam)内部NS1蛋白所具有的晶体结构（ID：3F5T），该

晶体结构通过X-射线晶体衍射法测定，见图3。

引自[Bornholdt ZA, Prasad BV. Nature, 2008, 456(7224): 985-8]

图3 H5N1非结构蛋白NS1 X-衍射晶体结构

Figure.3 X-ray structure of NS1 from a H5N1 influenza

virus(A/Vietnam/1203/2004)

研究认为：晶体中的ED、RBD这两种单体，和其他NS1蛋白所具有的单体结构大体上是相同的，RNA结合域结构与以前报道的单个功能域的二聚体结构没有大的区别，各个部分都参与二聚体相互作用。不过，ED结构域中，由于3个β-折叠、平移，这就促使其集中在单体中间位置，ED的作用界面也会发生变化。研究发现，在全长NS1蛋白晶体中，二聚体是是RBD和ED这两个不同的结构域（RBD、ED），依次在NS1单体所具有的结构域中起某种作用，最终产生链锁二聚体，而不是2个单体简单的聚集。基于此，研究人员提出：NS1

蛋白晶体内部的二聚体，往往是在交互式结合作用下得以产生。后续的研究人员也得出：二聚体链中，每3条便能够结合成寡聚体（呈螺旋管状）；单个螺旋中，均有NS1二聚体链的存在，数量为3个，所有已知的效应区配体结合位点全部暴露在寡聚体外表面，结合dsRNA的关键氨基酸位于中心通道的表面[12]。

3. 非结构蛋白NS1的功能

作为典型的多功能蛋白，NS1具有较强的调节活性，它能够对流感病毒表现出的致病性、毒力等起到相应的调节作用。人体在刚开始感染病毒时，便可监测到较多的NS1蛋白；该蛋白被磷酸化后，能够诱导病毒具体的复制过程，S42，T49，T215是主要的磷酸化位点。NS1蛋白的作用机制：1）NS1蛋白主要是对宿主蛋白相应的合成过程予以抑制，对细胞凋亡予以减少，对干扰素繁殖予以抑制等途径，从宿主方面间接进行抗病毒反应；2）促进mRNA顺利翻译，使病毒复制进程不断加快，最终提升流感病毒的致病力。 3.1 抑制宿主蛋白的合成

在真核细胞内部，成功转录的RNA经过后续加工和转运等，在基因表达过程中起着重要的作用，所以当病毒作用于细胞的转录后加工过程时，细胞功能就会少到严重的干扰。在宿主蛋白相应的合成过程中，NS1蛋白基本上需通过下列途径达到抑制目的。第一种，对宿主细胞mRNA自身的核输出起到抑制作用；通过结合小核RNA，对前mRNA相应的剪接进程起到抑制作用：通过与U6小核RNA（简称

snRNA）内部的茎环结构予以结合，对U6 RNA snRNA 介入mRNA所具有的剪接功能起到抑制作用；与双链RNA结合，抑制依赖于双链RNA的蛋白激酶活化：NS1蛋白通过结合双链RNA（dsRNA），具有较强的特异性，能够从PKR结合体上完全分离出dsRNA[18,19]，使PKR所产生的磷酸化过程受到干扰；通过对PKR原有的活性予以削弱，最终对细胞蛋白合成起到阻碍作用[20]。第二种，NS1蛋白可以和宿主体内的其他受体蛋白发生作用，对基因转录、加工翻译起干扰作用，并对宿主蛋白实际的表达量予以抑制，从而影响细胞的正常生理功能。有研究证明，NS1蛋白能够分别和Poly(A)、NS1两种结合蛋白（PABⅡ、NS1-BP）发生作用，使得蛋白pre-mRNA 3’端被迫剪切，引起多聚腺苷酸化，阻碍mRNA核正常输出等，最终对宿主蛋白的正常合成起到抑制作用[21,22,23]。 3.2 下调细胞凋亡

细胞凋亡（Apoptosis），即为使人体的内环境保持稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡，它不是一个病理过程，而是各种细胞或者生物为保持稳定、平衡或者是防御外部影响等做出的选择。根据细胞相应的凋亡机制，宿主的有机体可以将那些存在价值不高的细胞予以清除，从而缓解炎症反应。研究发现，NS1蛋白可能是通过抑制PKR-IFN途径和PI3K激活途径来下调细胞凋亡的。Zhirnov等[24]通过抽取两种不同类型的毒株（一种为野生型：流感病毒株；一种为突变型：NS1基因缺失）在细胞凋亡阶段所起到的诱导作用，结果得出：后种毒株可以对可合成干扰素（简称IFN）及其相关细胞（MDCK等）

凋亡起到促进作用，但无法与IFN的细胞（Vero）相互合成；两种类型的毒株不存在显著的差异。基于此，我们认为流感病毒株中的NS1蛋白对干扰素所起到的抗细胞凋亡过程具有明显依赖性。同时有研究显示，NS1蛋白能够上调细胞凋亡阈值，使被感染细胞的凋亡推迟。另外，通过PI3K激活途径NS1蛋白也可调节细胞的异常凋亡。Ehrhard C等[25]明确表示，NS1蛋白能够和PI3K相互结合并使其激活。通过诸多的级联反应，对感染细胞实际的凋亡过程予以抑制，使病毒得到成功复制。国内学者关于NS1对细胞凋亡过程所起到诱导作用的研究并不是很多，因此，对其进一步研究，能够更加深入的理解流感病毒的致病机制。

3.3 拮抗干扰素的产生

病毒感染细胞后，抑制干扰素的合成。机体产生2种类型的干扰素：INF-α/β、INF-γ。干扰素-α/β(IFN-α/β)在机体抗病毒过程中发挥重要功能，是宿主成功突破病毒感染基础和最为重要的防线。NS1蛋白，能够利用几种不同的影响机制对IFN-α/β的产生和释放发挥抑制作用。该类机制主要有：避免PKR、2'-5'合成酶（译为2'-5'oligoadenylate synthetase）两种物质被成功激活；对干扰素相应的调节因子起到抑制作用；阻止dsRNA活化的抗病毒信号传导通路等

[26,27]

。这些都与NS1蛋白的RNA结合区有很大关系。研究认为：对NS1

基因缺失毒株而言，它无法在有干扰素形成的细胞中顺利完成增殖或者是复制等过程；但在干扰素无法形成的细胞中，则能够大量繁殖、复制；上述提示：NSI蛋白在流感病毒复制阶段中，对干扰素具有明

显的阻碍作用[28]。

3.4 NS1蛋白与宿主蛋白相互作用

NS1、宿主两种蛋白能够彼此发生作用。经再次分布，宿主蛋白可以上升内部蛋白的表达，提升病毒对宿主细胞所具有的抗病毒能力。宿主蛋白，大体可分成下列几类：1）Staufen蛋白；2）NS1结合因子；3）Poly(A)结合蛋白?等等。Falcon A等[29]明确表示，NS1蛋白在特异性较高时可以和Staufen蛋白进行结合，该过程有助于我们科学定位病毒mRNA的具体位置，由此加快病毒蛋白的有效合成。Wolff T等[30]证明NS1蛋白同样可以和NS1-?相互结合，使病毒的复制能力得到提升，对机体所表现的抗病毒反应起到抑制作用，与病毒周期息息相关。Tomas等[31]经研究得出：NS1蛋白通过和eIF4GI发生作用，能够让eIF4GI和病毒mRNA 5'-UTR实现特异性地结合，最终促进病毒mRNA的顺利翻译。 4 展望

进入20世纪以来，流感病毒在全球不同领域均已传播开来，其范围、面积和速率可以说是史无前例的。一方面，它对国民经济、社会稳定造成恶劣影响；另一方面，则直接危害群众的健康甚至让部分人濒临死亡。目前，美国FDA认可和获批的抗流感病毒药物，数量仅为4种。按照各自的作用机制，我们可将其分成两大类。第一类，M2离子通道蛋白抑制剂；第二类，NA抑制剂。M2蛋白产生的耐药株具有致病性和传染性，且只有A型流感病毒才有M2离子通道蛋白，所以

M2离子通道蛋白抑制剂在临床上并没有被广泛使用。NA抑制剂奥司他韦据认为是目前所发现的特异性最高的药物，但由于流感病毒抗原的高度变异性，NA作为抗原之一，根据其结构设计出的抗病毒药物对于新型流感病毒的防治就有了局限性。流感病毒中，NS1实际上为非常特殊的非结构蛋白，其对病毒所具有的致病性、毒力等均有显著的调节作用。氨基酸，作为NSI的功能位点，其遗传保守性相对较为明显。因此，我们可将该类功能位点作为标准，对新一代A型流感病毒药物及其防控技术进行更深一步地探索；如以NS1突变株为参照，对致弱活疫苗进行研发；根据NS1内部的功能位点，尝试对某些抗病毒药物进行设计等。对NS1蛋白的结构、功能进行深入研究，将为流感病毒的预防及治疗提供更多的可能性。

M2离子通道蛋白抑制剂在临床上并没有被广泛使用。NA抑制剂奥司他韦据认为是目前所发现的特异性最高的药物，但由于流感病毒抗原的高度变异性，NA作为抗原之一，根据其结构设计出的抗病毒药物对于新型流感病毒的防治就有了局限性。流感病毒中，NS1实际上为非常特殊的非结构蛋白，其对病毒所具有的致病性、毒力等均有显著的调节作用。氨基酸，作为NSI的功能位点，其遗传保守性相对较为明显。因此，我们可将该类功能位点作为标准，对新一代A型流感病毒药物及其防控技术进行更深一步地探索；如以NS1突变株为参照，对致弱活疫苗进行研发；根据NS1内部的功能位点，尝试对某些抗病毒药物进行设计等。对NS1蛋白的结构、功能进行深入研究，将为流感病毒的预防及治疗提供更多的可能性。

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