Western Blot 步骤
更新时间:2024-02-27 07:53:01 阅读量: 综合文库 文档下载
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8.1.3 细胞收集与裂解
(1)细胞收集:常规胰蛋白酶消化、离心收集细胞于1.5mL eppendorf无菌管,并做好标记。(2)细胞洗涤:4℃,2500rpm离心5分钟,用4℃预冷的1×PBS洗涤两次。(3)细胞裂解:用100μL事先配好的含有1mM PMSF的RIPA裂解液吹打悬浮细胞,放入-20℃冰箱15分钟,再次吹打悬浮,放入-20度冰箱15分钟。(4)蛋白离心:如此重复两次后,4℃,12000rpm离心10min,取上清(蛋白质)。(5)蛋白总浓度测定:取5μL(或2-5μL)上清用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白总浓度,实验根据说明书实验步骤操作,测出蛋白-吸光度标准曲线及各组蛋白总浓度。(6)蛋白变性:剩余蛋白样部分以4:1的体积比与5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混匀,沸水浴5min。(7)蛋白浓度均一化:待样品自然冷却后,根据蛋白浓度测定结果,用RIPA稀释好的1×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液将各组蛋白调至相同浓度,放入-20度冰箱保存备用。
8.2 SDS-PAGE胶配制
(1)10% SDS-PAGE下层胶配制:按照说明书,依次加入相应体积的超纯水、30?r-Bis、下层胶缓冲液(4×)、10%APS和TEMED,充分吹打混匀后加入1mm厚度垂直电泳槽中,在胶上方轻轻加入超纯水压胶使胶上表面保持平整。(2)5% SDS-PAGE上层胶配制:室温下放置40min左右后,将压胶用的超纯水倒掉,吸除干净,按照说明书,依次加入相应体积的超纯水、30?r-Bis、下层胶缓冲液(4×)、10%APS和TEMED,充分吹打混匀,将配好的上层胶溶液加在下层胶上面,插入梳子。
8.3 蛋白电泳及转膜
(1)蛋白电泳:待电泳胶凝固好后,将胶板放入电泳槽内,加入电泳液,垂直拔出梳子,在加样孔中依次加入等量制备好的样品及4μL蛋白标准;90V恒压下电泳,待样品转移至上层胶和下层胶界面处后,将电压改成恒压110V。在蛋白指示线电泳至距下端1cm左右时终止电泳。
(2)蛋白转膜:待蛋白标准各条带充分分离后,停止电泳;根据所需要的蛋白大小及蛋白标准条带切取所需要的蛋白,将PVDF膜做好标记并记录,用甲
醇活化30s左右后,按照胶在阴极、PVDF膜在阳极的原则,在配好的转膜液中进行170mA恒流转膜,转膜过程中周围加冰水降温。
8.4 抗体孵育及显影
(1)PVDF膜封闭及洗涤:恒流转膜2h,关掉电泳仪电源,取出转上蛋白质的PVDF膜,放入封闭液中,封闭液封闭1-2h后,1×TBST洗涤2次,每次5min。(2)一抗孵育:将PVDF膜转移到相应的以1:1000比例稀释的一抗稀释液中孵育过夜;1×TBST洗涤3次,每次5min。(3)二抗孵育:将PVDF膜转移到相应的以1:1000比例稀释的二抗稀释液中,室温孵育1-2h;1×TBST洗涤5次,每次5min;(4)蛋白显影:暗室中,在X射线摄影暗匣里将PVDF膜含有蛋白质的一面朝上地铺在平整的保鲜膜上,在PVDF膜表面加上配好的BeyoECL Plus混合液,盖上保鲜膜;待反应10-30s后,在其上方盖上3层显影胶片并压片,根据蛋白条带发光情况决定显影时间长短;待显影结束后,将胶片转移到显影液中显影,待条带深浅基本不变后将胶片转移到定影液中定影,定影完成后再将胶片转移到自来水中水洗干净,凝胶成像系统拍照。
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