WB实验步骤详细总结

蛋白提取（所有操作在冰上进行）

1. 裂解

1) 配裂解液：PMSF=100：1，（裂解液和PMSF在-20℃保存，提前一天4℃解冻）

取2ml裂解液，加20μl PMSF混匀

2) 称取30mg组织，切碎放入标记好的AP管中，加入600μl上述1中液体（加入液

体与组织比例为20：1），冰上静置10min

2. 匀浆

先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头） 在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s，两次（间隔5s），冰上静置30min 3. 离心（在基础4楼416室）

1) 自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个1.5的离心管（①，②两个标记，③加少量

超纯水，③号是为了离心平衡，对称放置）

2) 将离心机预冷至4℃为止，以1200×10r/min离心15min 3) 用移液枪将上层清液取出放入①②号管中 4. 变性（上样缓冲液：样品=4：1）

将样品转移至2~3个0.5mlAP管中 加上样缓冲液，100℃变性10min 仪器屏幕：

5. 保存

变性结束后，打开AP管盖放一下气，然后4℃保存，点样是取出即可用

S5 S5 100．0 00：10 00：10 温度（℃） 时间（时：分钟） WB实验步骤

1.

清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

2. 配制分离胶 1) 2)

准备：1ml枪（蓝色枪头），200μl枪（黄色枪头）10μl（白色枪头）

10%分离胶的配置：（用50ml烧杯。1.0mm板配1.5块胶，1.5mm板配2块板） 5.91ml 4.95ml 3.75ml 150μl 150μl 9μl 超纯水 丙烯酰胺（30%）避光保存极易失效 Ph8.8Tris?HCL 10%SDS AP（催化剂促凝作用） TEMED 混合摇匀（用移液枪抽吸混匀液体，不要将液体完全打出防止气泡） 3.

灌胶

沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用1ml移液枪，不要将移液管内液体完全打出防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止

4.

水封

立即用1ml超纯水进行水封（利用重力把胶压平），如有气泡则用针头吸出防止影响电泳效果，等待20-30min

5.

浓缩胶的配制（5%）

4.13ml 1ml 750μl 60μl 60μl 6μl 超纯水 丙烯酰胺（30%）避光保存极易失效 Ph6.8 Tris?HCL 10%SDS AP（催化剂促凝作用） TEMED 搅拌混匀立即灌胶至溢出，插入梳子（10孔或15孔）凝胶30min或20min 6. 1)

电泳（电泳液最多使用两次）

安装电泳装置

低板对内，上方夹住，往两板中加入电泳液至黑线并观察是否漏液，缓慢拔掉梳子（注意两手平衡拔出防止拔歪）

2) 点样（不易时间过长，防止样品条带扩散） Mark 样品 4μl 8μl （Protern ladder）推荐9μ，实际4μ已经足够 7-10μl均可内参挑齐即可 组数少时尽量靠中间点样，边缘易跑歪 3)

连接电泳仪

电泳池与电泳盖连接：黑对黑，红对红电永池的两个电极插入电极盖孔内，打开开关恒压电泳 先调电压至70mV，跑约20min。（Mark跑开，分出彩带即可） 再调电压至120mV，跑约60min。（不能跑过下面的玻璃板）

注：Mark的条带从红色条带往下依次为：70→55→40→35→20，待测蛋白的分子量再哪一区域就在哪一段剪。用绿色的切板切割待测区域，边缘留点空余，以防止切到条带。放入装有转移液的皿中浸泡 7. 1)

转膜（转移液可用3-4次）

剪四层滤纸（大小与膜相，近可大不可小）浸入转移液皿中。然后再讲其剪成与胶一致大小（胶始终保持湿润） 2) 3)

剪PVDF膜（用上述滤纸，勿用手直接接触PVDF膜），然后用甲醇活化10s以上

“夹三明治”再大塑料盆中加入少量转移液，将夹板、海绵、滤纸、膜均放入浸泡，夹板黑板在下、两层滤纸→胶→膜→两层滤纸（胶的大分子量条带在上方，即在右上方） 4) 5)

安装转膜装置：黑板对黑板，电极黑对黑，红对红。加入转膜液至满（否则仪器无法启动） 打开开关，调节电流至100mA，转膜2h（恒流）盆中加满冰 转膜成功标志：胶上的条带均转移的膜上，胶呈无色 8.

封闭 1)

配制5%脱脂奶粉： 2.5g脱脂奶粉 50mlTBST 2)

小烧杯中混匀加入皿中 将膜取出放入上述加入了5%脱脂奶粉中的皿中常温慢摇60min（转移液回收其余清理掉，转移液可以重复利用2次）

9.

一抗 1)

用TBST配，每一格加5ml TBST，再分别加入抗体 抗体的量： 2l（Psmad2l）免抗 2l（Psmad2l）免抗 Jnk免抗 内参（小鼠抗GAPH）单抗，中杉金桥 2) 3) 10. 洗脱

用TBST在皿中洗脱，摇床10min每次，洗三次。 11. 二抗

1)

用3%的脱脂奶粉 1.5g的脱脂奶粉

50mlTBST 2)

每格吸入5ml 3%脱脂奶粉，抗体与奶粉比例均为1:5000，即加入1μl

注意：吸入微升时，一定要检查是否吸到液体，一抗用鼠抗则二抗用鼠抗，一抗用免抗二抗用免抗 3) 12. 洗脱

用TBST在皿中洗脱，摇床10min每次，洗三次。

膜分别加入小格，慢摇1-2h（常温）

小烧杯中混匀加入皿中 膜上用圆珠笔标记，分别放入小格中（正面朝上） 4℃冰箱中，慢摇过夜（正面朝上，摇床416室）

1:1000 1:500 1:1000 1:5000 5μl：5ml 10μl：5ml 5μl：5ml 1μl：5ml 58（分子量） 58 双带 36 13. 显影：

1) 2) 3) 4)

U盘

A液，B液（显影液。4℃保存）

所需物品 200μl枪+枪头（黄） 膜（置于皿中）

开机后自动预冷，温度降到1-20℃才可 显影液现配现用（A液：B液=1：1）

膜正面朝上放于暗箱，（即大分子量再左上角）用移液枪吧显影液均匀涂在膜上

先点击自动曝光，看下效果，显示不清晰再手动该曝光时间，内参一般显影15s（影像的条带粗细深浅一致则说明已调齐）内参好说明各步实验操作均无误，目的蛋白结果好坏就取决于抗体的专一性。

5) 每张图保存多张不同清晰度的以备用，拷贝至U盘

试剂配方：

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