PKC激活γδT细胞转录因子NF-κB的作用

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I S S N1 0 0 7—8 7 3 8细胞与分子免疫学杂志 ( C h i n J C e l l M o l I m m u n o 1 ) 2 0 1 1, 2 7 ( 6

论著

文章编号： 1 0 0 7—8 7 3 8 ( 2 0 1 I ) 0 6— 0 7 0 2— 0 3

P KC O激活

细胞转录因子 N F - K B 的作用

孙大康，安新业，孔祥华。,宋向芹， 赵延婷。中心实验室，山东滨州 2 5 6 6 0 3 ) (滨州医学院附属医院：临床医学实验中心，检验科，

[摘要] 目的：探讨经 T细胞受体 ( T C R)途径激活人 8 T细胞时，新型蛋白激酶 P K C 0在促进转录因子 N F - K B活化中的

电泳迁移率变动分析 ( E l e c t r o p h o r e s t i e Mo b i l i t y S h i f t A s s a y, E MS A),并通过流式细胞术 ( F C M)检测 T细胞活化分子 C D 6 9的表达情况，以观察 P K C 0在激活T细胞中的作用。l材料和方法1 . 1材料 M t b A g参照文献自制 J,Mt b为 H 3 7 R a株；抗

作用。方法：常规分离健康人外周血单个核细胞 ( P B MC ),用结核杆菌耐热性多肽抗原 ( M t b A g )诱导扩增，获得 V 9 V 2 T

细胞富集的细胞群 ( M t b A T )。P K C 0抑制剂 ( R o t t l e r i n )预处理 Mt b A T,抗C D 3单克隆抗体 ( m A b )刺激后收集细胞，通过电泳迁移率变动分析(E MS A)检测转录因子 N F— K B活性变化；经流式细胞术 ( F C M)检测 T细胞活化分子 C D 6 9的表达情况。 结果： - y 8 T细胞经抗 C D 3 m A b刺激， N F— K B活性增强；R o t—

C D 3 mA b为美国宾夕法尼亚大学医学院微生物系 C a r d i n g博士惠赠；L i g h t S h i f t M T C h e m i l u mi n e s c e n t E MS A K i t( P I E R C E公

l f e i f n预处理使抗 C D 3 m A b诱导的 N F— K B活化程度显著减弱， 并抑制 T细胞活化分子 C D 6 9的表达。结论：P K C 0在人 3 ' 8 T细胞经 T C R途径激活 N F— K B过程中具有重要作用。 [关键词] 8 T细胞；蛋

白激酶 C O;核转录因子. K B;电泳迁移率

司); N F— K B单链寡核苷酸探针由上海生工合成并进行 3 端生物素( B i o t i n )标记，序列： 5, - A G T T G A G G G G A C, I『 I C C CAGG C一 3, 3 一 T C A AC T C C C C TG AAA GGG TC C G- 5 ;Ap r o i f—

n i n ( 2 3 6 6 2 4 ),L e u p e p t i n ( 1 0 1 7 1 0 1 ) ( R o c h e公司 );抗人 C D 3

[中图分类号] R 3 9 2 . 1 2

[文献标识码] A

F I T C和抗人 C D 6 9 F I T C ( A n e e B公司 );抗人 T C R 3, 8 - P E( B D

公司); Mi n i P r o t e a n 3 C e l l电泳仪 ( B I O . R A D公司 );D Y Y .Ⅲ

北京六一仪器厂 );F A C S C a l i b u r流式细胞仪据 T细胞抗原识别受体的不同， T淋巴细胞分为型转印电泳槽 (B D公司 )。 e t l￣ T细胞和 -/ S T细胞两大类。7 8 T细胞主要分布在 ( . 2方法皮肤、肠上皮、肺等部位，在正常人外周血中表型多 1

为V 9 V 8 2 T C R,仅占外周血 C D 3 T细胞总数的 1%一1 0%¨ 。 8 T细胞在机体固有免疫应答及适应性免疫应答之间具有重要的桥梁作用，其参与调节机体免疫应答的功能正逐渐被人们所认识]。在对结核分枝杆菌感染的免疫应答过程中特别是在早期

1 . 2 . 1 细胞的体外扩增

抽取健康成年人外周血，常规密度

梯度离心法分离获取 P B MC,用含 5 0 m/ L新生牛血清、 E

5 0 m E/ L A自体血清的 R P MI 1 6 4 0培养液调整细胞密度为( 1— 2 )×1 0 / L,种入 2 4孔细胞培养板中，每孔 1 m L。加入 Mt b A g 5 /孔激活 T细胞，置于 3 7￣ C、 5 0 mE/L C O 2培养箱中培养细胞，每隔 3— 4 d每孔补加重组人 I L - 2 5 0 I u/￣ L,根

应答阶段，^ y 细胞可分泌大量 I F N一，杀伤 Mt b感据细胞增殖情况分孔扩增。 染的靶细胞，介导和调节炎

症反应 - 4 j。P K C 0是一 1 . 2 . 2细胞表型检测培养 1 4 d后收获扩增的 T细胞， 种新型的蛋白激酶 C( P r o t e i n K i n a s e C, P K C),选择用抗人 C D 3一 F I T C和抗人 T C R ' y 8一 P E进行细胞表面双荧光染F C M检测 8 T细胞所占比例。 性表达于 T淋巴细胞和肌细胞，对成熟 T淋巴细胞色，

. 2 . 3核蛋白抽提",/ S T细胞静息化处理的活化和 I L - 2的产生具有极为重要的意义。研究 1

用 R P MI 1 6 4 0将收

b A T洗 2次，重悬细胞于含 5 0 m L/ L新生牛血清的表明， P K C 0信号途径在结核分枝杆菌抗原 ( M y c o b a c— 集的 Mt P MI 1 6 4 0液中，不加重组人白细胞介素 2 ( r h l L - 2 ),继续培 t e r i u m t u b e r c u l o s i s a n t i g e n, Mt b A g )刺激 8 T细胞增殖 R

和分化中均起重要作用 _ 6 J。T细胞活化时，P K C 0如何激活下游的信号通路目前尚不清楚。本实验以 Mt b A g体外刺激健康人外周血单个核细胞 ( p e r i p h e r -a l b l o o d mo n o n u c l e a r c e l l, P B MC ),获得 V 9 V 8 2 T细

养2 4 h。调整不同处理组细胞总数均为 1×1 0 ,其中 2组分别用5 i x m o l/ L、 1 0￣ m o l/ L的 R o t l f e r i n预处理 2 0 m i n。抗 C D 3 mA b ( 5 m g/ L )刺激 3 0 mi n后，收集细胞提取核蛋白。分别收集不同处理组的细胞 ( 1×1 0 ),用冷 P B S洗涤细胞 1次， 4 o C, 4 0 0 g离心 5 m i n。重悬细胞于 4 0 0 I x L B u f e r A( 1 0 mm o l/ L H E P E S,p H 7 . 9,1 0 mm o l/ L K C 1,1 . 5 m m o l/ LMg C 1 2,0 .1 mmo￣L ED T A,0. 5 mmo l/ L DT Y,0 . 5 mmo l/ L

胞富集的细胞群 ( M t b A T)。通过特异性 P K C 0抑制剂R o t l f e r i n预处理，抗 C D 3单克隆抗体 ( m

A b )诱导

M t b A T细胞活化，对转录因子 N F . K B活性变化进行 P MS F, A p r o t i n i n 2 g/ m L, L e u p e p t i n 2 g/ m L ),涡旋混匀 1 0 s,收稿日期： 2 0 1 0—0 7—3 0;接受日期： 2 0 1 0—1 0—2 2

冰浴 1 0 mi n。加入 8 t x L 5 0 mL/ L N P— 4 0至终浓度 1 0 m L/ L, 涡旋混匀 1 0 S,冰浴 5 m i n。4℃, 6 0 0 0 g离心 1 m i n,弃上清。 4 0 0 I x L B u f f e r A重悬细胞核沉淀，涡旋混匀 1 0 s,洗涤细胞核

作者简介：孙大康( 1 9 7 3一),男，山东滨州人，讲师，硕士Te l:0 5 43 - 3 2 5 8 7 0 9:E— ma i l:s d k a a a@ 1 6 3 . c o n r

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I S S N 1 0 0 7— 8 7 3 8细胞与分子免疫学杂志 ( C h i n J C e l l Mo l I mm u n o 1 ) 2 0 1 1, 2 7 ( 6

3讨论

( 5 d、 1 0 d、1 5 d )以及活化分子 C D 6 9和 C D 2 5变化 ( 3

8 T细胞是一类数量较少的 T细胞亚群，基因多 d ),属于抗原刺激的中、晚期事件。本实验中 8 T细样性较 c x[ 3 T细胞少，基因重排较仅 B T细胞有限，细胞转录因子 N F— K B的变化 (刺激 3 0 mi n );以及活化分胞表型多为 C I M— C D 8一，仅少数为 C D 8。 8 T细胞子 C D 6 9的变化 (刺激 2 4 h ),反映了 P K C 0在抗原刺可以分泌 I F N￣/等细胞因子，而且多肽类结核杆菌耐激早期事件中的作用，我们的结果与前者在变化趋势 P K C 0参与^ y 6 T细胞转录因子热抗原激活的人外周血 6 T细胞高表达 C D 8 0、 C D 8 6 上相一致。综上所述，和 MHC . I I类分子，发挥抗原提呈作用。P K C 0是 N F . K B的激活，促进活化分子 C D 6 9的表达。一

种新型的 C a非依赖型蛋白激酶 c,活性受 D A G[ 1]B e e t z S,We s c h D,Ma i f s c h e n L,e t a 1 .I n n a t e i m mu n e f u n c

i t o n s o f h u m a n g a mm a d e h a T c e l l s[ J] .I m m u n o b i o l o g y, 2 0 0 8, 2 1 3 ( 3— 4 ):1 7 3—1 8 2 .

和磷脂调控。本实验用 M t b A g优势扩增 T细胞 ( V - y 9 参考文献：V 6 2型为主 ),P B MC经 Mt b A g刺激扩增 1 4 d后， 8 T细胞占 M t b A T细胞总数的 8 0%左右，可作为^ y 8 T细胞的模型。本研究用抗 C D 3 m A b作为刺激剂， 以R o t t l e r i n选择性阻断 P K C的活性，初步探讨 P K C

[ 2]K a l y n a S, C h o w AW.L i n k i n g i n n a t e a n d a d a p t i v e i m mu n i t y:h u m a nVg a mma 9 Vd e h a 2 T c e l l s e n h a n c e CD4 0 e x p r e s s i o n nd a HMGB - 1 s e - -

在 8 T细胞 N F . K B活化中的作用。R o t t l e r i n在阻断 P K C 0的同时，还可以阻断 P K C的活性；但P K C极少在 T细胞中表达 J,因此 R o t l f e r i n在 T细胞中的阻断效应主要是阻断 P K C活性的结果。本实验发现： 用R o t t l e r i n可显著抑制抗 C D 3 mA b诱导的 8 T细胞N F - K B的活化，提示经 T C R途径激活 7 8 T细胞时， P K C能够促进 N F . K B的活化。

c r e t i o n[ J] .M e d i a t o r s I n l f a m m, 2 0 0 9, 2 0 0 9: 8 1 9 4 0 8 . [ 3]L i B,R o s s ma n MD,I mi r T,e t a 1 .D i s e a s e— s p e c i i f c c h a n g e s i n g a m-ma d e h a T c e l l r e p e r t o i r e nd a f u n c t i o n i n pa t i e n t s w i t h p u l mo n a r y t u—

b e r c u l o s i s[ J] .J I mm u n o l,1 9 9 6,1 5 7 ( 9 ): 4 2 2 2— 4 2 2 9 . [ 4]P e n g M Y, Wa n g Z H, Y a o C Y,

e t a 1 .I n t e r l e u k i n 1 7 - p r o d u c i n g g a m mad e l t a T c e l l s i n c r e a s e d i n p a t i e n t s wi t h a c i t v e p u l mo n a r y t u b e r c u l o s i s

[ J] .C e l l Mo l I mm u n o l, 2 0 0 8, 5 ( 3 ): 2 0 3—2 0 8 .

[ 5]Ma r s l a n d B J,K o p f M.T— c e l f a t e a n d f u n c t i o n:P K C— t h e t a a n d b e— y o n d[ J] .T r e n d s I mm u n o l, 2 0 0 8, 2 9 ( 4): 1 7 9—1 8 5 .

本实验中，在R o t t l e r i n作用下^ y 6 T细胞 C D 6 9的 表达率显著降低，由( 4 7 . 1 6 - 4 - 1 . 4 )%降至( 3 0 . 4 8± 2 . 6 )%。活化标志分子 C D 6 9的表达率下降，可能与 R o t t l e r i n抑制 P K C之后，不能有效诱导 N F— K B活化， 无法有效触发 C D 6 9分子的转录启动有关。研究发现， M t b A g刺激 P B MC 3 d后， 8 T细胞 C D 6 9和 C D 2 5表达升高，而 R o t t l e r i n预处理显著地抑制了C D 6 9和 C D 2 5表达。该实验选用的细胞为 P B MC, M t b A g作用的细胞以初始 8 T细胞为主，本实验以 M t b A g优势扩增 T细胞为观察对象，主要反应了记忆性或效应性 T细胞接受抗原刺激时， P K C对下游转录因子 N F— K B活化的影响。朱安友等报道的

[ 6]朱安友，陈礼文，王凤超，等.蛋白激酶 c O信号途径在结核分枝杆菌抗原激活人 8 T细胞增殖和分化中的作用[ J] .中华微生物学和免疫学杂志， 2 0 0 8, 2 8 ( 1 0 ): 9 3 4— 9 3 8 . [ 7]L u H Z,L i B Q .E f e c t o f H MG— C o A r e d u c t a s e i n h i b i t o r s o n a c t i v a t i o no f h u ma n g a mma d e h a T c e l l s i n d u c e d b y My c o b a c t e

r i u m t u b e r c u l o s i s n— a

t i g e n s[ J] .I m mu n o p h a r m a c o l I mm u n o t o x i c o l, 2 0 0 9,3 1 ( 3): 4 8 5—4 9 1 .

[ 8]王

婧，李柏青.多肽类结核杆菌抗原激活的 8 T细胞表达抗原

提呈细胞表型和功能[ J] .细胞与分子免疫学杂志，2 0 0 9,2 5( 7 ): 5 8 8— 5 9 1 .

[ 9]A h ma n A, V i l l a l b a M.P r o t e i n k i n a s e C— t h e t a( P K C he t t a ): I t’ S a l l a - b o u t l o c a i t o n, l o c a t i o n, l o c a t i o n[ J] .I mm u n o l R e v, 2 0 0 3, 1 9 2: 5 3—63

M t b A g刺激时， R o t t l e r i n作用下 8 T细胞的分化比例

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