分子生物学实验讲义 - 图文

实验一 大肠杆菌感受态细胞制备及质粒转化

一、实验目的

1．了解和掌握大肠杆菌感受态细胞制备的原理和基本操作方法 2．了解和掌握质粒DNA转化大肠杆菌细胞的原理和方法

二、实验原理

用物理或者化学的方法处理细菌细胞，能让细胞处于一种容易吸收外源DNA的状态，即感受态。制备感受态的方法和多，如CaCl2法、特殊试剂诱导法、原生质体法、电击法等。转化是将外源DNA分子引入受体细胞的过程，所用的受体细胞一般是不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（Rˉ，Mˉ）。CaCl2转化法的原理是由于细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，外源DNA与Ca离子形成羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经热激处理后，菌体细胞膜通透性发生改变，从而吸收DNA复合物。CaCl2转化法在细菌的转化研究工作中得到了广泛的应用和不断的改进，使不同菌株的转化效率大大提高。

本实验以大肠杆菌DH5a菌株为受体细胞，用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pBS质粒共保温，实现转化。由于pBS质粒（图1）带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr ），可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS质粒，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS质粒。转化子繁殖后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。

图1 质粒pBS图谱

三、实验材料、仪器设备及试剂 1．实验材料

大肠杆菌DH5α菌株（菌液中加入50％甘油，冻存－70℃，可供下次使用）、pBS质粒（Amp r） 2．仪器设备

高压灭菌锅、恒温摇床、超净工作台、分光光度计、冷冻高速离心机、恒温水浴锅、50 mL离心管、1.5 mL Eppendorf离心管、移液器及枪头、试管、培养皿、碎冰、超低温冰箱

3．试剂及溶液

（1）LB培养基（1 L）：NaCl 10 g，胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，固体培养基含琼脂15 g，高压灭菌；

（2）氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）母液：配成 50 mg／mL水溶液，过滤除菌，－20℃保存备用； （3）0.1 mol／L CaCl2：超纯水配置，高压灭菌； （4）双蒸水，高压灭菌；

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四、实验步骤

1．大肠杆菌感受态细胞的制备

（1）取大肠杆菌DH5a菌株在LB平板上划线，37℃倒置培养12 h。

（2）挑取单菌落接种于含5 mL LB培养基的试管中，在37℃振荡培养12 h，直至对数生长后期。 （3）取上述培养菌液0.5 mL菌液接种于含50 mL LB培养基的250 mL三角瓶中，在37℃振荡（240 r／min）培养约2至3小时，至OD600＝0.4~0.6左右。

（4）取1 mL培养液放入1.5 ml离心管，冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。 （5）在4℃下，4 000 r／min离心10 min，去上清。

（6）用600 μL冰预冷的0.1 mol／L CaCl2溶液将菌体轻轻悬浮起来，再在冰上放置20 min。 （7）在4℃下，4 000 r／min离心10 min，去上清。

（8）用200 μL冰预冷的0.1 mol／L CaCl2溶液将菌体轻轻悬浮起来，感受态细胞可在冰浴中放置，24 h之内直接用于转化。也可加入占总体积15％的甘油，混匀后，将菌液分装到1.5 mL的离心管中，每管100 μL，放入－70℃冰箱中备用。

2．细胞的转化

（1）取100 μL感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。

（2）加入pBS质粒DNA溶液2 μL（总量不超过50 ng，体积不超过10 μL），轻轻摇匀，冰上放置30 min。另取100 μL感受态细胞悬液，加入同体积的灭菌水代替质粒DNA，作为对照组。

（3）42℃水浴中热激90 s，热激后迅速置于冰上冷却3～5 min。

（4）向管中加入400 μL LB液体培养基（不含Amp），混匀后，37℃振荡培养45 min～1 h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Amp r ）。

（5）将上述菌液摇匀后取100 μL涂布于含Amp的LB平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养14～16 h。对照组一取100 μL 菌液涂布于含相应抗生素的平板上；对照组二稀释100倍后涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。

（6）统计每个培养皿中的菌落数。转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化率，公式如下：

转化子总数＝菌落数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积

转化频率（转化子数／μg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量（μg） 转化百分率＝（转化子总数／空白平板上菌落总数）×100％

五、注意事项

1．所收集菌液的OD600值不能过大，因此在震荡培养时应注意观察细菌的生长状况。 2．整个实验过程应在冰浴环境下进行。

3．热激是一个关键步骤，准确地达到热激温度非常重要。 4．由对照实验排除假阳性。

六、思考题

1．如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种现象？ 2．影响感受态细胞效率的因素有哪些？

3．用作电击转化的感受态细胞如何制备？试比较电击法与热激法。 主要参考文献：

1．[美]J. 萨姆布鲁克，E. F. 弗里奇，T. 曼尼阿蒂斯著，金冬雁、黎孟枫等译，《分子克隆实验指南》（第二版），科学出版社，北京，1996

2．[美]J. 萨姆布鲁克，D. W. 拉赛尔著，黄培堂、王嘉玺、朱厚础等译，《分子克隆实验指南》（第三版），科学出版社，北京，2003

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实验二 质粒DNA的提取及浓度测定

一、实验目的

1．了解质粒DNA提取的基本方法及其原理 2．掌握碱裂解法提取质粒的基本操作方法

二、实验原理

本实验主要通过碱裂解法小量制备质粒DNA。小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样，所得DNA有一定纯度，可满足限制性内切酶切割、电泳分析的需要。

在碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA的氢键断裂，致使宿主染色体DNA变性，但闭合环状的质粒DNA由于拓扑缠绕而不能彼此分开。当以pH 4.0的NaAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，质粒DNA迅速恢复原有的构型，重新形成超螺旋分子，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性，形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

在细胞内，质粒DNA常以超螺旋（ccc-DNA）形式存在。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松驰型的开环DNA（OC-DNA）。如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA（L-DNA）。在电泳时，同一质粒如以超螺旋形式存在，比其开环和线性DNA的泳动速度快。

此方法制备的质粒产量一般约为：每毫升原细菌培养物3～5 μg。此方法按适当比例放大可适用于100 mL细菌培养物。除了利用碱裂解法小量制备质粒外，还经常用到煮沸法，尤其是对于某些特殊的质粒，只能用煮沸的方法进行提取。

三、实验材料、仪器设备及试剂 1．实验材料

含pBS质粒的大肠杆菌DH5α菌株 2．仪器及耗材

冷冻台式离心机、超净工作台、高压灭菌锅、恒温摇床、恒温水浴锅、移液器及枪头、1.5 mL Eppendorf离心管、吸水纸、碎冰、紫外分光光度计

3．试剂及溶液

（1）LB培养基（1 L）：10 g NaCl，10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，pH 7.2，固体培养基含15 g琼脂。

（2）氨苄青霉素（Amp）母液：配成50 mg／mL水溶液，过滤除菌后，－20℃保存备用。 （3）75％乙醇

（4）TE缓冲液：10 mmol／L Tris·HCl，1 mmol／L EDTA，pH 8.0 （5）RNA酶：10 μg／mL （6）溶液Ⅰ

50 mmol／L 葡萄糖 25 mmol／L Tris·HCl，pH 8.0 10 mmol／L EDTA，pH 8.0

溶液Ｉ可成批配制，每瓶约100 mL，6.895×104Pa高压下蒸气灭菌15 min，贮存于4℃

（7）溶液Ⅱ（现配现用）

0.2 mol／L NaOH（临用前用2 mol／L贮存液稀释） 1% SDS（临用前用10%贮存液稀释）

（8）溶液Ⅲ（100 mL）（不灭菌）

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乙酸钾（5 mol／L） 60 mL 冰乙酸 11.5 mL 水 28.5 mL

所配成的溶液对钾是3 mol／L，对乙酸根是5 mol／L （9）Tris饱和酚 （10）氯仿

（11）无菌双蒸水（去离子水）

四、实验步骤 1．细菌培养

将含有质粒pBS的DH5α单菌落（实验一转化出的阳性菌落）接种在LB液体培养基（含100 μg／mL Amp）中，37℃培养12 h。

2．质粒制备

（1）取1.5 mL培养物放入灭菌的1.5 mL Eppendorf离心管中，4℃下12 000 r／min离心2 min，将剩余的培养物贮存于4℃。

（2）弃去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。

（3）加入100 μL冰预冷的溶液Ι，在漩涡振荡器上剧烈振荡，确保细菌沉淀在溶液Ⅰ中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。

（4）加200 μL新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物，确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管放置于冰上3～5 min。

（5）加150 μL用冰预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，温和颠倒离心管5次，溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，然后将管置于冰上3～5 min。

（6）4℃下12 000 r／min离心15 min，将上清转移到另一干净灭菌的1.5 mL离心管中。

（7）加等体积酚：氯仿（1：1，V／V），盖紧管口，剧烈振荡混匀使溶液成乳浊状，4℃下12 000 r／min离心15 min，将上清转移到另一干净灭菌的离心管中。

（8）加入2.5倍休积的无水乙醇，混匀，室温放置15 min。 （9）4℃下12 000 r／min离心10 min。

（10）弃去上清液，将离心管倒置于吸水纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。 （11）用1 mL 75%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，4℃下12 000 r／min离心2 min。按步骤（10）所述方法去掉上清，放于室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体。

（12）用100 μL含RNA酶（20 μg／mL）的灭菌去离子水溶解核酸沉淀，37℃消化30 min。 3．质粒浓度测定

取出部分质粒（体积视比色皿的大小而定），用去离子水稀释200倍，测定OD260、OD280。如果OD260 / OD280 大于1.8，则认为所提取的DNA比较纯。OD260=1相当于双链DNA的浓度为50μg/mL，计算所提质粒的浓度，将数值标于管壁上，–20℃存放。

五、注意事项

1．从细菌沉淀中或核酸沉淀中去除上清液时，一定要彻底，不能留有残余。 2．加入溶液Ⅰ后要充分悬浮，加入溶液Ⅲ后要轻轻颠倒混匀。

3．用酚-氯仿抽提后要小心吸取上清液，宁可少要上清液，也不能将处于中间层的杂质吸上。 4．用75％的乙醇溶液洗涤核酸沉淀时一定要非常小心，防止将核酸同溶液一起弃掉。并且要尽可能将全部沉淀洗于管底，以免损失。

六、思考题

1．质粒的基本特性有哪些？

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2．碱裂解法提取质粒的实验中，溶液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各有何作用？酚和氯仿各有何作用？ 3．在碱法提取质粒DNA操作过程中应注意哪些问题？ 4．质粒制备和纯化的方法有哪些？

主要参考文献：

1．[美]J. 萨姆布鲁克，E. F. 弗里奇，T. 曼尼阿蒂斯著，金冬雁、黎孟枫等译，《分子克隆实验指南》（第二版），科学出版社，北京，1996

2．卢圣栋主编，《现代分子生物学实验技术》（第二版），中国协和医科大学出版社，北京，1999

实验三 DNA酶切及琼脂糖凝胶电泳

一、实验目的

1．学习限制性内切酶作用的原理

2．掌握使用限制性内切酶消化DNA的基本操作 3．掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的基本操作

二、实验原理

1．限制性内切酶对DNA的切割作用

限制性内切核酸酶（也称限制性内切酶）是一种识别并且切割特定核酸序列的水解酶，是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的。细菌细胞内同时存在一对酶，分别称为限制性内切酶（限制作用）和DNA甲基化酶（修饰作用）。它们对DNA底物有相同的识别顺序，但生物功能却相反。由于细胞内存在DNA甲基化酶，它能在限制性内切酶所识别的若干碱基上甲基化，就避免了限制性内切酶对细胞自身DNA的切割破坏，而对感染的外来噬菌体DNA，因无甲基化而被切割破坏。限制性核酸内切酶就像是一把锋利的“分子剪刀”，可以在特定的部位，将DNA双链切开。限制性核酸内切酶各有其特异的切割位点。我们可以根据需要，选择特定的限制性内切酶，就可以获得一个特定的DNA片段，这就是我们所要的目的基因。我们还可以用相同的限制性内切酶去切割载体DNA分子，所得的DNA片段和载体DNA分子就会有相同的碱基互补的粘性末端。根据碱基配对原则，用连接酶将这些不同来源的DNA片段“对接、缝合”起来，就成为一个新的杂交分子，即重组DNA分子。

目前已发现的限制性内切酶有数百种。EcoR I是常见的限制性内切酶，识别和切割的序列为： G ↓ AATTC

上述6个核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少个酶解片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶中的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子质量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。

限制性内切酶的作用效率是受多方面因素影响，如DNA纯度、缓冲液成分、温度条件等。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸管头。对DNA进行酶切时，首先要选择合适的缓冲液。对于单酶切，应选用该酶的最适缓冲液；对于双酶切或三酶切，应选用一种能使所有酶都充分作用的缓冲液。若两者可用同一缓冲液，则可同时进行酶切。若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，去掉该内切酶，重新沉淀核酸，然后用加入第二种酶进行反应。DNA的纯度对酶切效果的影响也很大，因为蛋白质、酚、氯仿、SDS等杂质都会抑制限制性内切酶的活性。

2．DNA的琼脂糖凝胶电泳

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5．引物合成的基本原理是什么？

主要参考文献：

1．[美]J. 萨姆布鲁克，E. F. 弗里奇，T. 曼尼阿蒂斯著，金冬雁、黎孟枫等译，《分子克隆实验指南》（第二版），科学出版社，北京，1996

2．赵永芳主编，《生物化学技术原理及应用》（第三版），科学出版社，北京，2003

实验五 DNA重组

一、实验目的

1．学习DNA重组技术的基本原理 2．综合运用DNA重组各项技术

二、实验材料、仪器设备及试剂

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图3 质粒pET30a的图谱

1．实验材料

（1）原核表达载体pET30a，见图3，储存于大肠杆菌DH5α中。 （2）DNA片段为实验四中的PCR产物。 （3）大肠杆菌DH5α感受态细胞。 2．仪器设备

超净工作台、高压灭菌锅、水浴锅、0.2 mL PCR管、移液器及枪头、碎冰、微波炉、水平电泳槽、电泳仪、紫外检测仪、凝胶照像系统。

3．试剂及溶液

（1）灭菌的重蒸水

（2）T4 DNA连接酶及缓冲液

（3）10×TAE电泳缓冲液：1 L含48.4 g Tris，11.4 mL 冰乙酸，7.4 g Na2EDTA （4）DNA上样缓冲液：50％甘油，0.25％溴酚兰，4℃储存或－20℃冻存

（5）溴化乙锭：配制成10 mg／mL母液，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可 （6）琼脂糖 （7）DNA分子标准

（8）质粒小量提取试剂盒：从公司购买 （9）DNA胶回收试剂盒：从公司购买

四、实验步骤

1．培养含质粒pET30a的大肠杆菌，具体操作见实验二。用试剂盒提取质粒，操作步骤完全按照说明书进行。质粒浓度测定见实验二。

2．取2个0.5 mL无菌小离心管，用KpnⅠ和BamHⅠ两种限制性内切酶同时对质粒pET30a和PCR产物进行酶切，总体系均为50 μL。

灭菌重蒸水 34 μL 内切酶反应缓冲液（10×） 5 μL

质粒或目的DNA片段 10 μL（总量约2 μg） KpnⅠ 0.5 μL BamHⅠ 0.5 μL

加入限制性内切酶后，枪头在反应混合液中反复吸吐几下，使得酶能够完全加入到反应体系中，并能与其它成分充分混匀。酶从冰箱取出后放置在冰上，使用完毕，应立即放回冰箱。

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3. 将上述酶切产物全部上样，分别经0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外灯下用刀片切下含目的DNA条带的凝胶。尽量去掉不含DNA的多余凝胶。

4．从凝胶中回收DNA，操作步骤按照试剂盒说明进行。

5．将回收的两种DNA片段进行连接。在0.5 mL无菌小离心管中依次加入下列溶液，总体积为20 uL：

灭菌的重蒸水 2.5 μL

10×连接酶缓冲液 2 μL pET30a酶切片段 5 μL 目的基因酶切片段 10 μL

T4 DNA连接酶 0.5 μL

加入连接酶后，枪头在反应混合液中反复吸吐几下，使得酶能够完全加入到反应体系中，并能与其它成分充分混匀。16℃连接过夜。

4. 取10 uL上述连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，操作见实验一。

五、思考题

1．解释T4 DNA连接酶工作的原理。它对反应温度、时间、DNA分子数量及末端特性有何基本要求？ 2．什么是T/A克隆？

实验六 植物组织总RNA的提取、变性电泳及Northern杂交

（一）植物组织总RNA的提取及变性电泳 一、实验目的要求

1．学习和掌握真核细胞总RNA提取的原理 2．掌握真核细胞总RNA提取的基本操作方法 3．学习和掌握RNA甲醛变性胶电泳的原理和基本操作

二、实验原理

真核细胞绝大部分RNA为rRNA（主要为28S、18S、5.8S和5S四种）（占80～85％）、tRNA与小分子RNA（占10～15％）和mRNA（占1～5％）。mRNA含量极低，但种类繁多，不同mRNA的大小和序列相差较大，长度从几百到几千个碱基不等。这些相异的RNA分子合起来实际上编码了细胞内所有的多肽。mRNA主要存在于细胞质中，大部分mRNA均与蛋白质结合在一起形成核蛋白体。mRNA的提取对于进一步研究基因的结构及其表达调控是必要的。原核生物的mRNA半衰期较短，提取困难。而真核生物的mRNA较稳定，相对来说比较容易提取。

植物mRNA的分离纯化是研究植物基因表达、植物的发育、代谢调节控制的分子基础等重要实验技术。由于植物材料中mRNA含量极低，又极易受RNase的分解破坏，因此制备mRNA是一件比较困难的工作。同时由于各种mRNA的物理化学性质非常接近，因此分离纯化对某种蛋白专一性的mRNA更是困难。目前所用的方法大多是制备某种组织中的总mRNA。植物材料中分离纯化对某种蛋白专一性的mRNA还是晚近才开始的。

植物RNA的提取，主要包括以下4个步骤： ①用机械研磨等方法破碎植物组织细胞；

②加人蛋白质变性剂，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA； ③抑制内源和外源RNase活性；

④将RNA、DNA、蛋白质及其他细胞物质分开。

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因为核糖残基在2′和3′位都带有羟基，所以RNA比DNA的化学性质更活跃，易于被污染的RNA酶降解。由于RNase非常稳定，目前尚无使RNA酶失活的简易方法，链内二硫键的存在使许多RNA酶可抵抗长时间煮沸和温和变性剂，变性的RNA酶可迅速重新折叠。和大多数DNA酶不同，RNA酶不需要二价阳离子激活，因此难以被缓冲溶液中加入的EDTA或其它金属离子螯和剂失活。因此在提取RNA时要尽量创造一个无RNA酶污染的环境，操作时要戴口罩和手套，尽量避免RNase的污染。实验过程中要使用RNase抑制剂，DEPC（二乙基焦碳酸酯）是RNase的强抑制剂，常用来抑制外源的RNase活性。实验前所有玻璃器皿要用高温（180～260℃长时间烘烤，所有试剂及塑料器皿须用DEPC处理，以除去外源RNase。提取缓冲液中一般含SDS、酚、氯仿、胍盐等蛋白质变性剂，也能抑制RNase活性，并有助于除去非核酸成分。

现在已有多种较为成熟的分离总RNA的方法，其中3种最为常用，它们分别是苯酚法、胍盐法和氯化锂沉淀法。苯酚法是用SDS变性蛋白并抑制RNase活性，经多次酚／氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAc和乙醇沉淀RNA。胍盐法是用异硫氰酸胍（或盐酸胍）和巯基乙醇变性蛋白并抑制RNase活性，经酚／氯仿抽提后．再沉淀RNA。氯化锂沉淀法是Li在一定pH下时使RNA沉淀。本实验主要介第一种方法，同时介绍现在较常用的一步制备总RNA的方法——Trizol试剂提取法（参照Invitrogen公司的Trizol试剂使用说明）。

三、实验材料、仪器设备及试剂 1．实验材料 玉米或水稻幼苗 2．仪器设备

冷冻台式离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、紫外检测仪、移液器、灭菌枪头及1.5 mL离心管、灭菌量筒（包括1 L、500 mL和100 mL量程）、灭菌剪刀、灭菌大镊子、液氮、碎冰。

3．试剂及溶液

1．RNA制备所需的试剂和溶液

（1）无RNA酶灭菌水（即DEPC水）：去离子水中加入0.01% DEPC（V／V），充分摇匀，37℃避光处理过夜后高压灭菌。注意DEPC为致癌物，注意在通风橱中操作，高压灭菌后DEPC会分解，毒性消除。

（2）RNA提取缓冲液（SD溶液）100 mL：

DEPC H2O 59.9 mL

1 M柠檬酸钠（pH 7.0） 2.64 mL（注：事先配好，单独灭菌） 10℅十二烷基肌氨酸 5.28 mL（注：事先配好，单独灭菌） 异硫氰酸胍 50 g

在60℃下搅拌溶解，储于棕色瓶中，用前加 β-巯基乙醇（14.3 mol／L）至终浓度为0.2 mmol／L。 （3）水饱和酚（pH 8.0）

（4）2 mol／L NaAc（pH 4.0）：调pH值后，加入0.01% DEPC（V／V），充分摇匀，37℃避光处理过夜后高压灭菌。

（5）氯仿／异戊醇（49：1） （6）无水乙醇 （7）75%乙醇 （8）灭菌水

2．RNA变性电泳所需的试剂和溶液 （1）0.3% H2O2：用灭菌水稀释配制

（2）10×MOPS缓冲液：4 mol／L MOPS（吗碄代丙烷磺酸）；0.1 mol／L NaAc；10 mmol／L EDTA，pH 7.0，高压灭菌。

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＋

（2）5×变性上样缓冲液

水饱和溴酚蓝 16 μL 500 mmol／L EDTA（pH 8.0） 80 μL 37%（12.3 mol／L）甲醛 720 μL 甘油 2 mL 甲酰胺 3 084 μL 10×MOPS缓冲液 4 mL 加DEPC处理的水至10 mL，4℃贮存。 （3）SYBR Green I荧光染料 （4）琼脂糖

四、操作方法 1．总RNA的制备

（1）用干净剪刀剪取1 cm长新鲜玉米幼苗叶片2~3片，立即放入无菌的1.5 mL离心管中，加液氮后迅速用干净镊子捣碎成粉末，期间注意避免被液氮冻脆的叶片由于解冻而发生潮解，从而引起RNA的降解。加入RNA提取缓冲溶液500 μL。

（2）依次加入50 μL 2 mol／L乙酸钠（pH 4.0），500 μL 水饱和酚，100 μL氯仿／异戊醇（49：1），充分混匀后置冰上10 min。

（3）4℃下12 000 r／min离心15 min，取上清液转入另一离心管中。 （4）加等体积异丙醇，－20℃沉淀0.5 h。 （5）4℃下12 000 r／min离心15 min，收集沉淀。

（6）加500 μL 75％乙醇洗涤沉淀，晾干沉淀，注意不能太干，否则不易溶解。 （7）沉淀的RNA溶于50 μL DEPC 处理的无菌水中。 （8）取10 μL用1％普通琼脂糖凝胶进行电泳检测。

（9）在紫外灯下观察结果。注意观察总RNA的18S、28S特征条带。

2．RNA甲醛变性电泳

（1）变性琼脂糖凝胶的制备。预先用0.3％的H2O2浸泡电泳槽、制胶板和梳子10 min，再用灭菌水冲净。称1.0 g琼脂糖，加72 mL DEPC处理的水，加热溶化，冷却至60℃。在通风橱内加入10×MOPS缓冲液10 mL，甲醛（37％）18 mL，混匀后倒胶。

（2）制备样品。在一个无菌离心管中，取16 μL RNA样品与4 μL 变性上样缓冲液混匀。65℃温育5～10 min．迅速在冰上冷却5 min，瞬时离心数秒。

（3）电泳。上样前预电泳5 min，点样后以5 V／cm的电压电泳0.5～1 h。 （4）待溴酚蓝迁移至凝胶长度的2／3处，结束电泳。 （5）在紫外灯下观察结果。注意观察条带的数量及特征。

（二）Northern杂交 一、实验目的

1．学习和掌握Northern杂交技术的原理 2．掌握Northern杂交技术的一般操作

二、实验原理

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图4 转移装置示意图

Northern杂交是一项用于检测特异性RNA的技术，RNA混合物首先按照它们的大小和相对分子质量通过变性琼脂糖凝胶电泳加以分离。分离出来的RNA被转至硝酸纤维素膜或尼龙膜上。用一个放射性同位素或酶标记的DNA或者RNA探针与固定的RNA进行杂交。杂交RNA的大小和密度可通过放射自显影技术或酶促颜色检测来显示。Nortlnern杂交常用于检测或定量特异RNA的表达。

经典毛细管转移法是一种简单可靠的方法。本实验采用毛细管转移方法，转移装置见图4，利用高盐溶液运输RNA至滤膜上。在转移过程中，核酸与滤膜发生牢固的非共价结合。

三、实验材料、仪器设备及试剂 1．实验材料

（1）制备好的总RNA样品 （2）待标探针

（3）随机引物标记试剂盒、32P-dCTP 2．实验仪器设备

冷冻台式离心机、恒温水浴锅、移液器及枪头、电泳仪、水平电泳槽、紫外检测仪、凝胶照相系统、尼龙膜、3 mm大张滤纸、玻璃板、磁盘、密封袋或容器转移装置、杂交温箱、UV-交联仪或烘箱、Sephadex G-25小层析柱、碎冰、放射性测量计数器、保鲜膜、X光片、X光片夹

3．试剂及溶液

（1）10×SSC：1.5 mol／L NaCl，0.15 mol／L柠檬酸钠，pH 7.0，高压灭菌。 （2）用于尼龙膜的杂交溶液：

50％ 去离子的甲酰胺 0.25 mol／L Na3PO4（pH 7.3） 0.25 mol／L NaCl l mmol／L EDTA 7％ SDS

7% 聚乙二醇（PEG，MW=8 000） 100 μg／mL 鲑精DNA

最后加SDS和PEG，于45℃加热直至溶解 （3）10％ SDS。

（4）TE缓冲液：10 mmol／L Tris·HCl，1 mmol／L EDTA，pH 8.0

四、实验操作

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1．通过毛细管原理转移RNA至膜上

（1）电泳结束后，将凝胶放于10×SSC中浸泡30 min。

（4）将一张与凝胶大小一致的尼龙膜放入10×SSC中，同时剪四张与凝胶大小一致的滤纸放入10×SSC中

（5）进行印迹。在玻璃板上搭上滤纸桥，滤纸桥的两端浸泡在10×SSC中，桥上依次摆放滤纸、胶（正面朝下）、膜和滤纸，注意各层之间不要留有气泡。最后在滤纸上放一叠吸水纸，压上重物。使转移持续过夜，注意及时更换吸水纸。

（6）在RNA转移至膜上之后，将膜放入紫外凝胶照相系统进行拍照。在总RNA样品的两个主要的rRNA条带18S（约2.1 kb）和28S（约4.5 kb）位置处做上记号，以用做相对分子质量标准参照物。

（7）用2×SSC淋洗膜并晾干。用紫外交联仪进行交联1～2 min或在80℃烘烤10 min，使RNA与膜发生交联。

2．探针的标记

（1）取待标探针约100 ng，用TE缓冲液补足至总体积45 μL，沸水煮10 min变性DNA，冰浴10 min。 （2）将变性后的DNA溶液加入随机引物标记试剂盒（无dCTP，Amersham Pharmacia Biotech 产品），再加入5 μL的32P-dCTP（10μCi／μL，PerkinElmer 产品），混匀后37℃标记12 h。

（3）标记好的探针经Sephadex G-25小层析柱离心纯化。 （4）纯化后的探针沸水煮10 min，冰浴备用。 3．杂交和检测

（1）用2×SSC缓冲液将膜浸湿并洗涤5 min。

（2）在容器或密封袋中加足量的杂交液没过膜，于65℃预杂交30 min以上，以封闭非特异性结合位点。

（3）在预杂交液中加入已变性好的探针，继续于65℃振荡杂交12 h以上。

（4）回收含探针的杂交液，分别用65℃预热的0.1% SDS 、1×SSC、0.1% SDS＋0.5×SSC洗涤膜，每次10 min。

（5）检测背景信号，如果信号强，应在更加严格的条件下再漂洗几次（较低的盐浓度和较高的温度）。 （6）将膜用保鲜膜包裹起来，放于带有增感屏的X光片夹中，压上X光片（Kodak产品），－80℃放射自显影。

五、注意事项

1．RNA提取时，取材及研磨等动作要尽量迅速，减少RNA降解。

2．DEPC是一种具有致癌嫌疑的有机物，相关操作要在通风橱中完成。 另外DEPC对单链的 DNA或RNA具有破坏作用，利用DEPC处理过的溶液和物品都要经过高温灭活处理后才可以使用（DEPC会分解成水和CO2 ）。所有沾染DEPC的液体或物品在使用、遗弃前要高温灭活处理。

3．RNA操作的整个相关实验过程应该在超净台上完成, 操作者应配带口罩、帽子和手套。

4．在Northem杂交中，高质量的RNA样品和探针是关键。应严格按“无RNA酶环境”原则进行操作。 5．杂交和漂洗应在低于Tm（5～15℃）的条件下进行操作。 6．要严格控制漂洗时间和次数，具体依据检测器计数情况而定。 7．如果需要额外漂洗或再杂交，滤膜不应干涸。

8．整个操作时要戴上手套，特别注意不要直接用手或脏手套触摸滤膜。

六、思考题

1．控制Rnase活性的方法有哪些？DEPC作用的基本原理是什么？ 2．将核酸转移到膜上有哪些方法？

3．标记探针的方法有哪些？它们的原理是什么？

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主要参考文献：

1．曹晓风，王荣臣，阎隆飞等. 豌豆卷须cDNA文库构建及肌动蛋白基因序列分析. 科学通报，1993，38：1804～1808

2．郝福英、朱玉贤、朱圣庚等编，《分子生物学实验技术》，北京大学出版社，北京，2003 3．刘进元、常智杰、赵广荣等编，《分子生物学实验指导》，清华大学出版社，北京，2005

4．[美]J. 萨姆布鲁克，E. F. 弗里奇，T. 曼尼阿蒂斯著，金冬雁、黎孟枫等译，《分子克隆实验指南》（第二版），科学出版社，北京，1996

5．周俊宜主编，《分子生物学基本技能和策略》，科学出版社，北京，2005

实验七 豌豆肌动蛋白基因pEAC1的克隆

一、实验目的要求

1．学习和掌握真核细胞总RNA提取及RNA质量检测的基本原理和方法。 2．学习和掌握真核生物基因逆转录的基本原理和方法。 3．学习和掌握用RT-PCR克隆目的基因的基本原理和方法。

二、实验原理

PCR过程中，产物是一个指数增长的过程，使其成为检测核酸和克隆基因的一种非常灵敏的技术。一般经25~35轮循环就可使模板DNA扩增达106 倍。逆转录PCR（RT-PCR）包括逆转录（reversetranscription，RT）和PCR两个基本过程，逆转录是以mRNA为模板合成互补的cDNA（complement DNA）的过程；PCR是以逆转录得来的cDNA作为模板而进行的PCR过程。RT-PCR可用于cDNA克隆、基因表达检测和定量分析。由于cDNA包括了编码蛋白的完整序列而且不含内含子，只要略经改造便可直接用于基因工程表达和功能研究，因此RT-PCR成为目前获得目的基因的一种重要手段。

RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、表达差异，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。

逆转录时，可选用OligodT或目的基因特异性的引物。由于真核生物大多数的mRNA均具有polyA尾巴，可以很好地与OligodT结合，从而进行逆转录。但这种方法对RNA质量要求非常高，RNA如果稍有降解，就会使全长cDNA的量大大减少。与模板序列互补的特异性引物，适合序列已知的目的基因的克隆。

RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测或克隆多个基因的mRNA时比较有用。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。而一步法RT-PCR中，cDNA合成和扩增反应在同一管中进行，不需要打开管盖和转移，有助于减少污染。还可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA，因为整个cDNA样品都被扩增。对于成功的一步法RT-PCR，一般使用基因特异性引物(GSP)起始cDNA的合成。

经过RT-PCR产生的双链cDNA和一般DNA一样，可以插入到质粒或噬菌体中。但一般会在两端加上适当的接头，接头可以是在PCR引物上增加限制性内切酶识别位点片段，经PCR扩增后再克隆入相应的载体。也可以利用末端转移酶在载体和双链cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴，退火后形成重组质粒，并转化到宿主菌中进行扩增。

本实验以豌豆为材料，通过RT-PCR方法克隆肌动蛋白基因pEAC1的全长cDNA隆，为后续研究奠定基础。

三、实验材料、仪器设备及试剂 1．实验材料

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（1）豌豆幼苗

（2）上游引物actin P1：5’-GCGGTACCATGGCCGATGCTGAGGATAT-3’ （含KpnⅠ酶切位点）；下游引物actin P2：5’-GCGGATCCGAAGCATTTTCTGTGGACAAT-3’ （含BamHⅠ酶切位点）

2．仪器设备

冷冻台式离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、紫外检测仪、移液器、灭菌枪头、1.5 mL灭菌离心管、0.5 mL灭菌离心管、0.2 mL灭菌 PCR管、灭菌剪刀、灭菌大镊子、液氮、碎冰。

3．试剂及溶液

（1）RNA制备所需的试剂和溶液（见实验六）。 （2）逆转录酶及其缓冲液，直接购于公司。

（3）OligodT（16）：经公司合成的干粉溶于灭菌的重蒸水中，配成10 μmol／L，–20℃冻存。 （4）上游引物P1及下游引物P2：干粉溶于灭菌的重蒸水中，配成10 μmol／L，–20℃冻存。 （5）PCR操作所需试剂及溶液见实验四。

四、实验步骤

1．总RNA的浓度测定

取出部分所提取的总RNA（体积视比色皿的大小而定），用去离子水稀释200倍，测定OD260、OD280。如果OD260 / OD280 大于1.8，则认为所提取的RNA比较纯。OD260=1相当于RNA的浓度为40μg/mL，计算总RNA的浓度。

2．提取出的总RNA经普通琼脂糖电泳检测，通过观察总RNA的18S、28S特征条带鉴定总RNA的质量。

3. 取高质量的总RNA进行逆转录。反应在0.5 mL灭菌离心管中进行，10μl逆转录体系包括：

灭菌去离子水 2.5 μL Rnase抑制剂 0.5 μL

总RNA 4 μL（总量1μg ） oligo dT（16）（10μmol/L） 0.5 μL 5×逆转录缓冲液 2 μL 逆转录酶 0.5 μL

在加入后两种成分前，混合物先在65℃加热5 min后，迅速放置冰上，使RNA充分变性并和引物充分结合。加入逆转录酶后，枪头在反应混合液中反复吸吐几下，使得酶能够完全加入到反应体系中。酶从冰箱取出后放置在冰上，使用完毕，应立即放回冰箱。

4. 在逆转录酶指定的温度下（一般为42℃左右）进行逆转录反应，反应时间一般为90 min。反应完毕后，70℃下10 min，对酶进行灭活。反应产物于–20℃冻存。

5. 以上述逆转录的cDNA作为模板进行PCR反应。总体积为50 uL，在0.2 mL灭菌的PCR管中依次加入：

灭菌的重蒸水 37.5 μL 10×Taq buffer 5 μL 2.5 mmol／L dNTP 2 μL actin P1（10 μmol／L） 2 μL actin P2（10 μmol／L） 2 μL cDNA 1 μL

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Taq酶 0.5 μL

加入Taq酶后，枪头在反应混合液中反复吸吐几下，使得酶能够完全加入到反应体系中。酶从冰箱取出后放置在冰上，使用完毕，应立即放回冰箱。

6．将上述PCR管放入PCR仪中，设计程序：94℃预变性3 min，然后将下列三个步骤进行35个循环：94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，最后于72℃下保温10 min。

7．取10 μL PCR产物，用浓度为0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

8．经电泳鉴定大小正确后，可继续交送公司测序。将测序的序列与NCBI上的序列进行比较，确定是否为豌豆的肌动蛋白基因。

实验八 大肠杆菌表达重组蛋白及目的蛋白的免疫印迹鉴定

一、实验目的

1．学习和掌握SDS-PAGE技术的基本原理及操作 2．学习和掌握大肠杆菌表达重组蛋白的基本原理和操作 3．学习和掌握蛋白质免疫印迹的基本原理和实验操作

二、实验原理 1．SDS-PAGE

电泳是指带电粒子在电场中泳动的现象。蛋白质是两性电解质，在一定的pH值条件下带有电荷，因此蛋白质分子可以在电场中泳动。不同的蛋白质分子由于其氨基酸组成不同而带有不同的电荷，因此其在电场中泳动的速度不同，从而可以把不同的蛋白质分子分开。

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺(Bis)在自由基引发剂（常用过硫酸铵）及催化剂（常用四甲基乙二胺，TEMED）的作用下聚合而成的多孔网状结构凝胶。它的网孔大小与蛋白质分子大小在同一个数量级，因此它对蛋白质分子具有分子筛效应，也就是对不同大小的蛋白质分子阻力不同。由于蛋白质分子带有不同电荷，因此它在电场作用下所受到的电荷作用力不同，也就是在电场中移动的动力大小不同，我们通常称之为电荷效应。为了测定蛋白质分子量大小，需要消除不同蛋白质的电荷效应。当在蛋白质样品中加入一定量的SDS及强还原剂时，蛋白质会变性解聚，蛋白质亚基会与多个SDS结合形成复合物，SDS与蛋白质的结合密度很大，其重量比约为1.4：1，由于SDS本身带有负电荷，从而使整个蛋白质亚基带有大量的负电荷，由于SDS的结合，所引入的净电荷约为蛋白质本身净电荷的10倍，从而大大削弱了不同蛋白质本身所带电荷的差异，较大程度上降低了电荷效应。SDS-蛋白质复合物具有棒状结构，棒的直径与蛋白质种类无关，约为1.8 nm，而棒的长度则与蛋白质分子量成正比，从而消除了蛋白质分子形状对蛋白质迁移速度的影响。因此，加入SDS后，蛋白质在凝胶中迁移的速度只与其分子大小有关，其迁移率与蛋白质分子量的对数成正比。

2．大肠杆菌表达重组蛋白

大肠杆菌中重组蛋白的表达主要有两种模式——组成型及诱导型，主要由表达载体本身决定。在大肠杆菌中表达的外源蛋白对大肠杆菌本身的生长来说，多为有害的，因此，目前常用的都是诱导表达型载体，如pET系列。在大肠杆菌增殖阶段，外源蛋白不表达，然后改变培养条件，诱导外源蛋白表达。诱导条件也有多种，比如加入IPTG或者乳糖，或通过温度变化诱导表达。目前常用的多为IPTG诱导表达载体。

大肠杆菌中表达重组蛋白，为了纯化的方便，往往在目的蛋白上融合有纯化标签，这些标签多为亲和标记，能与特定的物质结合，通过亲和层析将融合蛋白结合在介质上，除去杂蛋白，通过改变洗脱条件，再将融合蛋白或目的蛋白直接洗脱下来。目前有多种纯化标签，比如多聚组氨酸，在低浓度咪唑条件下可与结合在介质上的镍离子结合，通过提高咪唑浓度可以把融合蛋白洗脱下来。再比如FLAG标签，可与结合在介质上的FLAG抗体结合，然后通过降低pH值或加入EDTA把融合蛋白洗脱下来。此外还有S-Tag、

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CBD标签等等。纯化标签虽然方便了目的蛋白的纯化，但有时候会影响目的蛋白的功能或应用，因此在纯化标签与目的蛋白之间往往还有蛋白酶酶切位点，纯化后可以用特定的蛋白酶将纯化标签切掉，比如pET表达载体系统，在His-Tag与目的蛋白之间融合有肠激酶（Enterokinase）识别位点(AspAspAspAspLys-)，可以将融合蛋白从镍柱上洗脱下来后再加肠激酶水解；也可以直接水解镍柱上的融合蛋白，直接获得没有标签的目的蛋白。有的Tag与目的蛋白之间有内含肽位点，比如pMAL表达载体系列，它在标签CBD与目的蛋白之间含有内含肽，内含肽本身具有蛋白酶及肽连接酶功能，在还原条件或温度、pH值条件改变时会发生类似RNA的自剪接，从而除去纯化标签CBD。

本实验在目标蛋白的氨基端融合有His-Tag，它能特异的与结合在介质上的镍离子结合，从而可以通过金属螫合亲和层析一次性分离获得高纯度的目标蛋白。金属螫合亲和层析介质价格相对较低，是目前应用最广的原核表达纯化方法之一。

由于表达的目的蛋白融合有His-Tag，可以用抗His-Tag的抗体来检测该融合蛋白。 3．蛋白质的免疫印迹

蛋白质的免疫印迹鉴定，是利用了抗原与抗体反应的专一性来达到鉴定目的的。用已知的抗体（或抗原）来鉴定未知的抗原（或抗体）。首先要有已知的抗体（抗体一般有单克隆及多克隆抗体两种，前者免疫活性好，但价格较高，在蛋白质免疫印迹中要用到两个抗体，一抗一般用单克隆抗体，二抗常为带有标记的多克隆抗体，抗体的制备方法参看相关专业书籍），目前已经有很多商品化的抗体可供购买使用。

蛋白质免疫印迹主要由四个步骤组成，首先是蛋白质的凝胶电泳，然后将凝胶上的蛋白质转移到膜上固定，然后是抗原抗体免疫反应，最后是显色。因为抗原抗体反应往往受蛋白质空间结构差别的影响较小，主要与蛋白质氨基酸序列有关，所以凝胶电泳常采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。可以转移固定蛋白质的膜有多种类型，主要有硝酸纤维滤膜（NC膜）、尼龙膜和聚偏氟乙烯滤膜（PVDF膜）。硝酸纤维素膜是免疫印迹中应用最广的滤膜，尼龙膜与之相比优势在于它们可用不同抗体进行多次检测，但转移到尼龙膜上的蛋白质不仅没有合适的染色方法进行监测，而且抗体容易与滤膜非特异性结合，造成背景很高。PVDF膜与蛋白质的结合能力远高于硝酸纤维素膜，它常用于蛋白质的序列测定。

将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上后进行抗原抗体免疫反应。首先利用标准蛋白（常为脱脂奶粉或标准牛血清白蛋白）封闭膜上未结合蛋白质的位点，然后用已知的抗体作为一抗与膜上相关抗原反应，洗涤除去未结合的游离抗体后，再用带有显色标记的一抗的抗体（也就是二抗）再与一抗进行免疫反应，洗涤除去未反应的二抗后，就可以对膜进行显色鉴定。二抗上的显色标记一般为同位素或者酶，常用的为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，然后再加入相应酶的底物进行显色。Western免疫印迹可检测到ng级蛋白质的存在。

本实验用6× His-Tag的抗体来检测融合有组氨酸标签的融合蛋白。

三、实验材料、仪器设备和试剂 1．实验材料

含有重组质粒的大肠杆菌BL21 2．仪器设备

电炉（或10 mg／mL 溶菌酶）、冷冻台式离心机、电泳仪、垂直板电泳槽、脱色摇床、转移电泳槽、移液器（1000μl、100μl、10μl和2.5μl）和配套枪头、烧杯（50 mL，250 mL，每组各1个）、培养皿（直径15 cm，10 cm每组各一个）、滤纸、硝酸纤维素膜（NC膜）、乳胶手套、平头镊子

3．实验试剂 SDS-PAGE部分：

（1）丙烯酰胺凝胶贮备液：称取丙烯酰胺29.2 g，甲叉双丙烯酰胺0.8 g，加蒸馏水100 m1搅拌溶解，滤纸过滤，滤液贮存于棕色瓶备用

（2）浓缩胶缓冲液：称取Tris 6.06 g，SDS 0.4 g，溶于80 mL蒸馏水，用3 mol／L HCl 调节溶液pH值到6.8， 蒸馏水定容到100 mL

（3）分离胶缓冲液：称取Tris 18.17 g，SDS 0.4 g，溶于80 mL蒸馏水，用3 mol／L HCl 调节溶液

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pH值到8.8， 蒸馏水定容到100 mL

（4）过硫酸铵溶液：称取过硫酸铵1 g，加蒸馏水10 mL，用时当天配制 （5）四甲基乙二胺（TEMED）：避光保存

（6）样品缓冲液（5×）：称取Tris 1.21 g，SDS 2 g溶解于50 mL蒸馏水，用3 mol／L HCl 调节溶液pH值到6.8，再加入甘油25 mL，巯基乙醇5 mL，溴酚蓝0.1 g，蒸馏水定容到100 mL。

（7）电极缓冲液：称取Tris 3 g，甘氨酸14.4 g，SDS 1 g，加蒸馏水至1 000 mL

（8）染色液：将500 mL甲醇和400 mL水与100 mL冰醋酸混合，加入2 g考马斯亮蓝R-250搅拌溶解，过滤后贮于棕色瓶备用

（9）脱色液：将500 mL甲醇和400 mL水与100 mL冰醋酸混合

（10）标准分子量蛋白（Marker）：低分子量，按说明配好，标明浓度，－20℃冻存。 蛋白质的诱导表达部分：

（11）0.5 mol／L的IPTG溶液（需过滤除菌）

（12）卡那霉素：用水配成50 mg／mL 母液，过滤除菌，－20℃冻存。 蛋白质的免疫印迹部分：

（13）电转移缓冲液：湿法转移缓冲液：称取1.93 g Tris， 9.0 g Gly，加蒸馏水500 mL溶解，加入200 mL甲醇，用重蒸水定容至1 000 mL。需事先配好并冷藏，待用。

（14）洗膜缓冲液（TBS-T）：称取Tris l.21 g，29.2 g NaCl，加重蒸馏水800 mL，调pH至7.5，加入0.5 mL Tween-20，定容至1 000 mL。共配5L，为方便，可配成1L的5×母液，调好pH值，Tween20临用前加。

（15）膜封闭液：含有3％脱脂奶粉的TBS-T缓冲液

（16）组氨酸标签抗体（一抗），为鼠抗6 × his-Tag的单克隆抗体 （17）碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG（二抗）

（18）显色溶液：碱性磷酸酶缓冲液（100 mmol/ L Tris?HCl ,100 mmol/ L NaCl , 5 mmol/ L MgCl2 , pH 9.5，重蒸水配制，共配200mL），临用前加入NBT和BCIP作为显色液，现用现配。

（19）膜染色液：0.2g丽春红溶于5ml冰乙酸，加入重蒸水定容至100ml。

四、实验步骤

（一）蛋白质的诱导表达

（1）将含有pET重组质粒的BL21菌种在LB固体培养基 (含50 μg／mL Kan) 上划线, 37℃培养12～24 h。

（2）用无菌牙签挑取单菌落接种到含5 mL LB液体培养基(含50 μg／mL Kan)的试管中，37℃振荡培养过夜。

（3）按照1：100比例分别接种到两瓶含50 mL液体LB培养基 (含50 μg／mL Kan)的三角瓶中，37℃培养3 h。

（4）取一瓶菌液加入IPTG至终浓度1 mM，诱导培养3 h，另一瓶不加IPTG继续培养3 h，作为对照。

（4）分别取诱导及对照菌液1.5 mL于1.5 mL小离心管中，5 000 r／min, 10 min离心收集菌体。 （5）用100 μL 1×样品缓冲液悬浮菌体，沸水煮5 min，冷却。 （6）12 000 r／min离心10 min，上清液用于电泳。 （二）SDS-PAGE 1．电泳槽的安装

目前国内大多数学生实验室用的是国产电泳槽。首先要将两个洗净擦干的玻璃板夹在一个硅胶套上，其中一个玻璃板上面高于另外一个玻璃板2～3 cm，上面高的玻璃板下面与胶条之间有一个狭缝。然后将硅胶套连同双层玻璃板夹在两个有机玻璃制成的半电泳槽上，注意有狭缝的一边在下面，矮玻璃板那面对着阴极。然后均匀用力将固定两个半电泳槽的四个螺丝拧紧，保证两个有机玻璃板中加入电极缓冲液后不

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漏溶液。称取2 g琼脂粉加入100 mL 电极缓冲液，在电炉上使琼脂化开，然后用胶头滴管吸取化开的琼脂，沿着胶条让琼脂溶液顺着玻璃板与胶条间的狭缝向下流，直到琼脂溶液流到高的玻璃板下与胶条间的狭缝处，用琼脂溶液将下面的狭缝封好。注意掌握琼脂溶液沿着双层玻璃板间上升的高度，最好控制在2mm左右，这样既保证狭缝不漏溶液，又可避免丙烯酰胺凝胶下面高低不平。待琼脂凝固后进行下步操作。

2．制分离胶

表7-2 分离胶的配制

分离胶浓度

丙烯酰胺凝胶贮备液（mL）

10％ 12.5％ 15％

5.3 6.7 8.0

分离胶缓冲液（mL）

4.0 4.0 4.0

蒸馏水（mL）

6.7 5.3 4.0

TEMED （μL）

10 10 10

10％过硫酸铵（μL）

80 80 80

总体积 （mL）

16 16 16

按照表7-2在烧杯中配制12.5％分离胶溶液。当加入10％过硫酸铵后，立即摇动烧杯，使各溶液混匀，然后倾斜电泳槽，使烧杯臂靠在高玻璃板上，让溶液顺着高玻璃板流入双层玻璃板之间，控制溶液高度距离矮玻璃板上缘2～3 cm，立即用胶头滴灌在凝胶顶部加入2～3 mm厚的水层，注意使水层顺着玻璃板缓慢流到凝胶溶液表面，避免水溶液冲入凝胶溶液中。然后在室温（20～30℃）等待30～60 min左右，凝胶凝固。

3．制浓缩胶

表7-3 浓缩胶的配制

浓缩胶浓度

丙烯酰胺凝胶贮备液（mL）

5％ 0.75 浓缩胶缓冲液（mL）

1.25 蒸馏水 （mL）

2.7 TEMED （μL）

10 10％过硫酸铵（μL）

30 总体积 （mL）

5

按照表7-3在烧杯中配制5％浓缩胶溶液。在加入过硫酸铵前，先将分离胶上面的水层倒掉，残留水较多的时候可以用滤纸条把残留的水吸去。当加入过硫酸铵后，立即摇动烧杯，使各溶液混匀，然后倾斜电泳槽，使烧杯臂靠在高玻璃板上，让溶液顺着高玻璃板流入双层玻璃板之间，直到将双层玻璃板间的夹缝倒满浓缩胶，然后插入梳子，在室温（20～30℃）等待30～60 min左右，凝胶凝固。

4．样品准备

将制备好的蛋白质样品溶液4份加入1份上样缓冲液，沸水浴煮沸5 min，然后离心（10 000 r／min, 5 min），上清液准备点样。标准分子量蛋白（Marker）按照商品说明书处理。

5．点样

首先将电泳槽中加入电极缓冲液，电极缓冲液液面在高玻璃板背面要超过电极线，在矮玻璃板一面要高过矮玻璃板。然后用微量进样器进行点样，一个泳道点标准分子量蛋白，其余泳道点未知分子量蛋白，根据蛋白质浓度确定点样体积，保证每个泳道蛋白质在30～50 μg左右。

6．电泳

接好电极线，注意黑色电极线接黑色插头，红色电极线接红色插头，也就是矮玻璃板那面接负极。接通电源。电泳仪采用稳压的方式电泳，先用80～100 V电压（起始电流值不要超过15 mA），当样品进入分离胶后，提高电压到130～160 V（起始电流值不要超过30 mA），当溴酚蓝前沿距离胶下面2 mm左右时，关闭电源，停止电泳。

7．卸胶

先拔下电极线，然后放出电极液，拧开固定螺丝，打开电泳槽，取出双层玻璃板，卸下玻璃板上的胶条，启开双层玻璃板，胶片粘在其中一个玻璃板上，先去掉浓缩胶，然后将分离胶胶片小心移入培养皿内。

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8．固定染色

在培养皿内加入染色液，注意液面超过胶片表面2 mm左右。然后将培养皿放在摇床上振摇2～3 h。 9．脱色

回收染色液（可重复利用），用少量脱色液洗涤凝胶一遍，然后加入脱色液，液面超过胶片2 mm，然后将培养皿放在摇床上振摇，约6 h换一次脱色液，换2次以上。

（三）蛋白质免疫印迹 1．转移

电泳结束后，取出双层玻璃板，根据胶片大小裁剪硝酸纤维素膜，膜的四周比电泳胶片大0.3～0.5 mm左右，注意不能用手接触膜，最好只用镊子夹住膜的一个小角，也可戴手套操作，将裁剪好的膜放在转膜缓冲液中充分浸湿。将胶片取出放在转膜缓冲液中稍洗涤，铺好电转移夹子，黑色面在下面，依次放已经在电转移缓冲液中浸泡好的海绵垫、双层滤纸、聚丙烯酰胺凝胶、NC膜、双层滤纸、海绵垫，可以用玻璃板或试管轻轻滚动挤压，排出气泡，然后扣好夹子，制成“三明治”状。将“三明治”装入电转移电泳槽，注意黑色面对着负极，也就是蛋白质凝胶在负极一面，这样在电场作用下才能转移到硝酸纤维素膜上。接通电泳，调节电压在100 V左右，电转移2 h。

2．膜的染色与封闭

电转移结束后，取出“三明治”，用镊子小心取出NC膜，放在装有TBS-T的培养皿中，摇床上摇动3 min后倾倒去TBS-T，加入丽春红溶液染色2 min，检查电转移效果，并标记出标准分子量蛋白的条带位置。然后用TBS-T反复洗涤滤膜，洗去丽春红染色液。将膜放在封闭液中室温封闭2 h（或4℃过夜）。

3．免疫反应

滤膜用TBS-T洗涤（5 min × 3次）后，将滤膜放在含有一抗的TBS-T中（一抗的稀释倍数通过预实验确定，一般在2 000～10 000倍左右），在摇床上振摇2 h。用TBS-T洗涤（5 min × 3次）后，将滤膜放在含有二抗的TBS-T中（二抗的稀释倍数通过预实验确定，一般在5 000左右），在摇床上振摇2 h。用TBS-T洗涤（5 min × 3次）。

4．显色反应

将膜放在显色溶液中，室温反应10～30 min，观察到有抗原条带出现时立即倒去显色液，用蒸馏水充分洗涤滤膜，进行实验结果照相或记录。硝酸纤维素膜可以干燥后避光长期保存。

五、实验结果与分析

1．根据免疫印迹条带情况判断样品中目标蛋白的有无

2．根据标准分子量标准蛋白的位置，估计显色蛋白的分子量大小

六、注意事项

1．丙烯酰胺及甲叉丙烯酰胺未聚合前是神经毒剂，配制凝胶贮备液时最好在通风橱中进行，并戴手套及口罩。实验操作过程中尽量避免其直接接触皮肤或溅入眼睛，碰到皮肤上立即用水冲洗。

2．室温过低时，凝胶凝固需要更长的时间，冬季室温过低时可将灌好的电泳槽放在30～40℃温箱中加速凝结，或适当加大过硫酸铵及TEMED的用量。

3．为避免电泳过程中产生的热量引起过高的温度，可以考虑将电泳槽放在冰箱或冰浴上进行电泳。 4．在小离心管中煮沸样品时，最好事先用针在盖子上扎一个小眼，防止煮爆。

5．电转移的电压越大，转移时间越短，但转移效果较差，应根据实际情况确定电压及电转移时间。为了取得较好的实验效果，转移最好在4℃条件下，低压进行。。

6．硝酸纤维素膜价格较高，使用时应根据要转移胶片的大小进行剪裁，操作过程中避免接触手及其他赃物。

7．显色会随着时间的延长而加深背景，因此要控制好显色时间，能看到检测蛋白，背景较浅时即可终止显色。

8．抗体一般价格较高，使用后注意回收。

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七、思考题

1．实验中，为何在IPTG的诱导下能产生目的蛋白，如何能检测该蛋白的存在？ 2．影响蛋白质免疫印迹效果的因素有哪些？请结合你的实验结果说明。

分子生物学常用软件及介绍

随着越来越多的核酸序列和蛋白质序列被测定，研究人员面对的数据越来越复杂，计算机成为储存和分析这些信息不可缺少的工具。最初用于简单序列编辑的小程序已经不能满足分子生物学研究人员的需求，越来越多的公司和厂家开发出各种各样的软件包用于个人计算机（PC）上辅助研究人员进行数据分析，包括用于DNA分析的常用序列编辑、绘制限制性酶切图谱、搜寻开放阅读框架、翻译蛋白序列、对比序列、设计引物、搜索数据库和画遗传图谱；包括用于蛋白分析常用的同源性搜索、亲水性图谱绘制、二级结构预测、蛋白酶解消化和图谱、氨基酸分析和序列查找等等。根据用途和使用环境不同，它们可以在Windows、Macintosh、Unix、Dos等不同的操作系统下运行。下面简单介绍分子生物学研究中常用的软件：DNAMAN（核酸序列分析）、Primer Premier（引物设计）。

一、DNAMAN （1）主要功能

1. 序列编辑：包括新建一个序列，打开一个序列以及不同格式序列间的转换。 2. 序列搜索：核酸特定序列的搜索，从核酸序列６个阅读框架翻译到蛋白质进行氨基酸特定序列搜索，自动搜索重复序列，发夹结构序列搜索。

3. 核酸序列比较：二序列比对和多序列比对，分析序列间同源性关系，根据同源性比对结果画进化树。 4. 点阵分析：可以用于在二条不同的核酸或者蛋白质序列中查找同源片断。

5. 引物设计：可分析设计出引物的Tm值、GC百分比、引物二取聚体、引物错配等。

6. 限制性内切酶位点分析：分析酶切位点并作出图谱，可在不改变氨基酸序列的前提下对DNA序列进行沉默突变设计，模拟电流结果。

7. 氨基酸序列分析：从核酸序列翻译到蛋白序列，从蛋白序列逆翻译到核酸序列，蛋白疏水／亲水残基分析，PI值分析，二级结构预测等。

8. 自建数据库：可对数据进行查找、修改管理。 （2）以DNAMAN4.0为例介绍相关序列比对的使用方法

1. 选择菜单Sequence/Alignment/Multiple sequence alignment 2. 在弹出窗口中，选择Add file按钮，相关按钮作用如下：

Add File按钮：选择需要比对的序列文件，支持两种格式：.seq和.msd ，需要事先将自己的序列存成这两种格式。

Add DBase按钮：从用户自建的数据库中载入数据，需要用户事先建立自己的数据库。 Remove Selected按钮：清除不需要的序列。 Remove All按钮：清空全部载入的序列。

Type单选按钮：选择输入的序列是蛋白序列还是DNA序列。

Alignment 可以选择fast alignment 和 optimal alignment两种方式，结果可能有所不同，可以自由选择。 3. 选择确定按钮，得到比对结果。

4. 在弹出的窗口中，相关按钮的作用如下： Options按钮：可以改变比对结果颜色等参数。 Output按钮：选择Tree选项画进化树。

提示：若比对序列为蛋白序列，还可以选择Output中Hydrophobic/Hydrophilic分析氨基酸残基的疏水／亲

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水性。

（DNAMAN 下载网址：http://www.Lynnon.com/）

二、Primer Premier （1）主要功能及特点：

1. 引物设计

适用于PCR、杂交、测序的引物设计。特别适合长PCR引物设计，模版可长达50kb。 能自动在模版序列上搜寻最适引物。

支持手工查找——允许用户自定义引物的性质，查找符合这些性质的引物，或者逐个位点手工查找。

定点改变——对程序自动产生的引物可按设计意图在适当位置改变碱基。

设计简并引物——能够把蛋白序列逆翻译成核酸序列，在简并度低的位点进行引物设计。

自动同时分析引物的二级结构——能够自动分析引物形成的发夹结构，二聚体（self-dimers和cross-dimers）和错配位点。

能够理论上预测设计的探针所需的杂交时间。

可计算设计的引物在260 nm下的OD值和相对分子质量。 用于多引物反应体系中引物间互配分析。 分析已有引物在模版上的结合位点。

最后能全面详细对设计的引物给出分析报告，包括Tm值、碱基数、GC百分比、能势、可能存在所有的发夹结构，二聚体（self-dimers和cross-dimers）和错配位点等等。 2. 序列编辑功能

及时发音系统——输入序列的时候同时朗读输入碱基，减少输入错误。 翻译——提供从DNA翻译到蛋白、从蛋白反翻译到DNA功能。 可自定义密码子（如线粒体中密码子）。 查找特定序列。

3. 限制性内切酶位点分析（自带一个800余种酶的库）。

4. Motif分析——可简单分析并编辑核酸序列的motif（自带一个200余种常见motif的库）。 5. ClustalW alignments序列排列、多序列比较。 6. 构建引物数据库

（2）以4.11版本为例对其常用的功能做个简单的介绍

输入模版序列（可通过新建文件粘贴、新建文件手工输入或者打开已有文件的办法输入）后，软件界面左上角出现三个按钮：Primer Enzyme Motif。

1. Primer用于在PCR和核酸杂交中设计引物。点击后出现一新框。中间偏上是DNA序列与引物，可以用鼠标直接选择引物的位置。序列下方显示了各项参数，如Tm值、GC百分比，还包括发夹结构、二聚体及二聚体在链中出现次数，如没有的话出现None钮，如果存在该结构则为Found钮，点击可以察看该结构出现的具体位置，包括这样的引物的特性一目了然。

最上方是三个功能按钮Search Results Edit primers。 Search

搜寻引物，可选择PCR引物，序列引物，杂交探针，可以自己定义在正负链中搜索，搜寻范围，引物长度，PCR产物长度，可选择自动搜索手动搜索，还可设定搜索参数，如Tm，GC值，简并度，3' 端稳定性，二聚体，发夹结构等引物参数。设定完毕点击OK，即可得到结果列表，包括所有可能的引物数目，以及各项参数达不到要求筛去的引物，最下方显示的是最佳方案的个数，可以在Result项中详细察看搜索得到的结果。

Results

显示引物搜寻结果列表，可以选定正负链或PAIRS，表中显示了每个引物的位置长度，还可以点击每个引物方案察看其在链中位置及其各项参数，还可以选择所需要的并标记。

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Edit primes

可以点击链两侧的左右箭头来选定引物位置，可以任意编辑引物，添加或删除任一个碱基，修改任一个碱基，当编辑完毕，点Analyze钮就可以察看编辑的引物的各项参数。

2. Enzyme用于做序列的酶切位点，可以应用于基因操作中酸切部位和所用酶的选择。最上方有两个选择：序列分析的范围；酶切位点个数选择（可低于1~6）。点击后左右两边一栏酶，左边为所有酶，右边为选定的酶。

中间四个按钮分别为：

Add：从所有酶列表中选定所用酶加入右侧列表；

Delete：从选中酶列表，可以加入新的酶或删除已有酶；

Filter：如果不知道该选用哪几种酶，可用功能筛选所需酶，可用酶切位点碱基数（4bp~13bp）和切割后的接头Overhang来筛选。

所用酶选好后点击OK即可得到酶切结果，有四种格式： Table：酶切位点，位置。 Seq：整段序列及酶切位置。

Map：与上一项近似，用示意图的方式显示结果。 Non Cutter：切不动的酶。 3. Motif用于查找特定序列，如-10区，-35区，AGGA BOX，CAAT BOX，与基因表达调控有关的motif。最上方有两个选择：序列分析的范围；Motif位点个数选择（可低于1~6个）。左边一栏是所有特定序列，右边是选定的，中间按钮与Enzyme界面相似，只是没有Filter功能。输出有四种格式：

Table：Motif的位置，数量。 SEQ：整段序列及Motif的位置。

MAP：与上一项近似。用示意图的方式显示结果。 Motif absent：序列中不存在的Motif。

（Primer Premier目前最新版本是5.0，下载网址：http://www.premierbiosoft.com/primerdesihn/ primerdesign.html/）

三、GenBank 中Blast程序的操作 Blast是一种碱基局部对准检索工具，实质上是一种序列类似性检索工具，它运行blastp、blastn、blastx、tblastn、tblastx等五种程序的启发式检索算法；这五种程序是利用改进的Karlin和Altschul的统计学方法来描述检索结果的显著性。这些程序不支持主题形式检索，也就是不支持主题词、自由词、文本词等检索。

下面为五种程序的基本功能

程序 blastp blastn blastx tblastn tblastx

功能

将待查询蛋白质序列及其互补序列一起对蛋白质序列数据库进行查询 将等查询的核酸序列及其互补序列一起对核酸序列数据库进行查询

先将待查询的核酸序列按六种可读框架（逐个向前三个碱基和逐个向后三个碱基读码）翻译成蛋白质序列，然后将翻译结果对蛋白质序列数据库进行查询

先将核酸序列数据库中的核酸序列按六种可读框架翻译成蛋白质序列，然后将待查询的蛋白质序列及其互补序列对其翻译结果进行查询

先将待查询的核酸序列和核酸序列数据库中的核酸序列按六种可读框架翻译成蛋白序列，然后再将两种翻译结果从蛋白质水平进行查询

用户根据查询的目的和序列选择合适的blast程序，有助于获得满意的检索结果。

·Blast参数的设置。Blast提供了许多参数可限制用户的检索，以达到满意的结果。对于Blast基本检索，系统预设的参数默认值即可满足专需要，不需要用户重新设定。但是对于Blast高级检索，可开窗选

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择如下几种参数，也可以在输入框增加其它参数。

■ 直方图（HIstogram）：显示每次检索评分的直方图。有yes、no两种选择，默认值为yes。 ■ 描述（Descriptions）：限定描述性类似序列的条数。有default、0、10、100、250、500等7种选择，默认值为100。

■ 对准（Alignments）：限定检出的高积分片断配对（High-scoring Segment Pairs，HSPs）的数据库序列的条数，有default、0、10、100、250、500等7种选择值，默认值为50。如果检测到的数据库序列超出设定值，Blast仅显示最具统计学意义的配对序列，直到设定值。

■ 期望值（Expect，E值）：它是期望数据库中具有某一统计学意义配对序列的值。有default、0.001、0.01、0.1、1、10、100、1000等选择值，默认值为10，一般地，期望值越低，限制越严格，甚至会导致无随机配对序列。

■ Cutoff：设定高积分片断配对（HSPs）的Cutoff值。有default、60、70、80、90、100、110等7种选择值，其默认值一般通过期望值来计算得出。一般地，Cutoff值越高，其限制就越严格，甚至会导致无随机配对序列。

■ 矩阵（Matrix）：为Blast、BlastX、TBlastN和TBlastX程序指定一个交替记分矩阵。其默认值为BLOSUM62，e PAM40、PAM120、PAM250和IDENTITY等４种有效选择。但交替记分矩阵对BlastN不起作用。

■ 股（Strand）：把BlastN检索限定在数据库序列的股的首端或末端；或者把BlastN、BlastX、TBlastX检索限定在查询序列股的首端或末端的机读部分。

■ 过滤器（Filter）：过滤器可以过滤查询序列中低成分复杂性（ow compositional complexity）片断。它只过滤查询序列及其转录产物中的低成分复杂性片断，不能过滤数据库序列中的低成分复杂性片断。用户可以在Blast和Blast2.0的高级检索中选择相应的过滤程序以消除对检索结果的干扰，如不用过滤功能则选择“NONE”。但是在Blast和Blast2.0基本检索中，因为，系统对于不同的Blast程序设定了默认值，例如对于blastn程序，其默认值为“DUST”，对于其他程序，默认值为“SEG”，所以用户只须选择用不用过滤功能，而不必设定过滤程序。值得注意的是，过滤器中的SEG和XUN程序不能过滤SWISS-PROT数据库中的低复杂片断，因此，虽然过滤器可以应用于SWISS-PROT数据库序列，但并未起作用。

■ NCBI-GI：在输出结果中除存取号和位点名称（Locus Name）外，还可以选择NVBI-GI标识号。有yes和no两种选择，其默认值为no。

·Blast检索结果

Blast程序用大致相同的格式显示检索结果，它包括四个部分：一是程序的介绍；二是一系列配对数据库序列的描述，从积分高到低排列，一行描述一条序列；三是实际的序列对准；四是检索中设定的参数及其它统计数据。根据打分结果以及P值的大小，用户可以决定结果中是否有感兴趣的序列。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/smr8.html