分子生物学实验报告

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分子生物学实验报告

专业：****** 班级：*** 指导老师：** 学生姓名：*** 目录：

实验一 质粒DNA的小量制备

实验二 DNA的含量、纯度与分子量的电泳法测定 实验三 感受态细胞的制备及转化

实验四 PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测

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2010.05.29

分子生物学基础实验

分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。

实验一 质粒DNA的小量制备

一、实验原理

要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tcr），抗新霉素基因（Ner）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。

质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。

质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20

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个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。

所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。

质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。

二、实验目的

1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂

材料：大肠杆菌E.coli，含pBR322质粒。 试剂：

1. LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，用NaOH调pH至7.3左右。如固

体培养基则添加15g/L琼脂。

2. 溶液Ⅰ（pH8.0G.E.T缓冲液）：50 mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L EDTA。灭菌后

存放。

3. 溶液Ⅱ（0.2mol/LNaOH(内含1％SDS)）：预先配制1％SDS母液，临用前一天晚上加入

0.2mol/LNaOH，4℃保存。

4. 溶液Ⅲ（pH4.8乙酸钾溶液）：5mol/L乙酸钾60mL、冰乙酸11.5mL、双蒸馏水28.5mL。 5. 酚/氯仿液(V/V＝1/1)：酚为重蒸酚，配制时，先将氯仿中加入异戊醇，使其体积比为24:1，然后等

量的加入重蒸酚，混匀，并用0.1mol/LTris-HCl (pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，于棕色瓶中存放，并在上面覆盖等体积的0.01 mol/LTris-HCl(pH7.6)，4℃保存。

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6. 无水乙醇 7. 70％乙醇

8. pH8.0 TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl、1mmol/LEDTA，其中含RNA酶20μg/mL。 仪器：

恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、台式高速离心机、台式小型振荡器、EP管(1.5mL微量离心管)、加样器(20uL～lmL)、吸头。 四、操作步骤 （一）培养细菌

将带有质粒pBR322的大肠杆菌接种在含50μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。注意：添加Amp时，须待LB培养基冷却到50℃左右方可加入。 （二）从菌落中快速提取制备质粒DNA

1．取1.4mL菌液置于1.5mL Ep管中，7500rpm离心1min。

2．弃上清，加入150μL GET缓冲液，在涡旋混合器上充分混匀，在室温下放置10min。

3．加入200μL新配制的0.2mol/L NaOH(内含1％SDS)，加盖，颠倒（不要振荡）2～3次，使之混匀，冰上放置4min，最多不能超过5min。

4．加入150μL冰冷的乙酸钾溶液。加盖后，颠倒数次使之混匀，冰上放置15min。

5．4℃，10000rpm离心5min，上清液吸至另一干净的1.5mL Ep中，如上清液浑浊则需重新离心一次。 6．于上清液中加等体积酚/氯仿液，振荡混匀，4℃，12000rpm离心2min，小心吸取上清液，转移至另一1.5mL Ep管中，注意勿将两液相中间的白色蛋白薄层吸出。

7．向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置３min。用离心机于10000rpm离心5min。小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。

8．用0.5mL 70％乙醇洗涤沉淀一次，10000rpm离心3min，除尽乙醇，室温自然干燥(将离心管倒置于一张纸巾上)，备用。

9．用25uL含无DNA酶的胰RNase(20 ug／mL)的TE重新溶解DNA，置于4℃保存，供下午电泳使用。贮存于-20℃备用，可长期保存。 五、注意事项

1．收集菌体提质粒前，培养基要去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。

2．在添加溶液Ⅱ与溶液Ⅲ后溶液的混合一定要柔和，采用上下颠倒的方法，千万不能在旋转器上剧烈

振荡。其中加入溶液Ⅱ后，溶液变成澄清，并有黏性；加入溶液Ⅲ后，出现絮状沉淀。

3．苯酚具有腐蚀性，能造成皮肤的严重烧伤及衣物损坏，使用时应注意。如不小心皮肤上碰到苯酚则

应用碱性溶液、肥皂及大量的清水冲洗。

4．苯酚可以用于抽提纯化DNA，由于苯酚的氧化产物可以使核酸链发生断裂。所使用的苯酚在使用前

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必须经过重蒸，且都必须用0.1mol/LTris-HCl (pH7.6)进行平衡。所以取酚/氯仿/异戊醇时应取下层溶液，因为上层是Tris-HCl液隔绝空气层。

5．酚/氯仿/异戊醇抽提时，应充分混匀。经酚/氯仿/异戊醇抽提后，吸取上清液时注意不要把中间的白

色层吸入，其中含有蛋白质等杂质。

6．实验中，涉及酚/氯仿溶液的操作要格外小心，而且与之接触的吸头、Ep管，全部弃用，不回收。 7．有些质粒本身可能在某些菌种中稳定存在，但经过多次移接有可能造成质粒丢失。因此不要频繁转

接，每次接种时应挑单菌落。 六、思考题

1．裂解细菌时需注意的事项有哪些？

答：注意不能震荡，防止细菌DNA断裂，混到质粒里面去，导致提取的质粒不纯。 2．质粒的基本性质有哪些？

答：质粒的性质：原指一切独立于染色体外的遗传因子，但目前一般指微生物细胞中的染色体外遗传因子。它们是能自主复制的共价、闭合、环状的DNA分子，整个质粒通常编码若干个基因。由于质粒的存在往往可以使宿主细胞具有某些性状，而质粒的丢失并不影响宿主在正常条件下的生存。由质粒授予宿主的表型有抗生素耐药性的、产抗生素的、降解芳香族化合物的、产溶血素的、糖发酵的、对重金属耐受性的、产杆菌素的、植物肿瘤诱发的和产硫化氢的。根据质粒的复制类型分为松弛型复制(胞内维持高拷贝数，从几个到几十个)和严聚紧型复制(胞内仅1～3个拷贝)。一部分质粒可通过细菌细胞的接触而转移，使一些对药物敏感的细胞获得对某些药物、金属离子的耐受性或使受体细胞获得另一些特性。在基因重组技术中，有些质粒可用作基因载体。现在应用的载体基本上是在质粒的基础上改造而成的。

3、碱裂解法提取质粒DNA中各溶液的作用是什么？

答：各溶液的作用如下：

溶液Ⅰ 葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性。这一步溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在后续步骤中被除去

溶液Ⅱ 0.2M NaOH / 1% SDS破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。

溶液Ⅲ 3M 醋酸钾 / 2M 醋酸这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组DNA也被PDS共沉淀 4、抽提质粒DNA的方法包括哪几个步骤？ 答：DNA提取分为三个基本步骤： 1、 破碎细胞，并通过加入去污剂以除掉膜脂。

2、醋酸盐沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉细胞内的蛋白，如与DNA结合的组蛋白。

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实验三 感受态细胞的制备及转化

一、实验原理

感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子。转化是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。转化的基本原理是细胞处于0℃，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸混合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在选择性培养基平板上培养，可选出所需的转化子。

二、实验目的

1．学习和理解影响细胞感受态的因素，掌握感受态细胞的制备方法。

2．掌握质粒的转化方法。把体外DNA引入受体细胞，使受体菌具有新遗传性，并从中选择出转化子。 三、实验材料和用具

材料：自制的质粒DNA、大肠杆菌(E.coli)菌种(DH5α菌株)。 试剂：

LB琼脂平板 (无抗生素)、

LB琼脂平板 (含50μg/L氨苄青霉素)、 LB液体培养基5mL(无抗生素)、 LB液体培养基100mL(无抗生素)、

LB液体培养基5mL(含50μg/L氨苄青霉素)、 0.1mol/LCaCl2溶液(灭菌备用)。 仪器：

恒温培养箱、恒温摇床、接种环、涂布器、冷冻离心机、离心管、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅。

四、操作步骤

(一)大肠杆菌感受态细胞的制备

1．从新活化的E.coliDH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于5mL液体培养基中，37℃振荡培养过夜，

直至对数生长期。将该菌悬液以1：50接种于50mL LB液体培养基中，37℃快速振荡培养3～4h。 2．取5mL培养液放入离心管中，在冰上放置10min，于4℃5000rpm离心10min。

3．可用加样器将残余液体尽量去净，用1mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置15～

30min。

4．于4℃，5000rpm离心10min。

5．弃上清，加入200μL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻，即制成了感受态

细胞悬液。

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6．制好的感受态细胞可在冰上放置，24h内直接用于转化实验，也可加入占总体积95％左右高压灭菌

过的甘油，混匀后分装于Ep管中，-70℃条件下可保存半年至一年。 (二)细胞转化

编号 样品 对照1 对照2 质粒 2 / 2 感受态细胞 100 100 / 无菌水 / 2 / 0.1mol/LCaCl2 / / 100 取200μL摇匀后的感受态细胞悬液，进行下一步的转化，转化如下（单位：μL）： 样品组即为我们的转化组：100μL感受态细胞＋2μL质粒DNA 对照1为受体菌对照组：100μL感受态细胞＋2μL无菌水

对照2为质粒DNA对照组：100μL0.1mol/LCaCl2＋2μL质粒DNA

将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42℃水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却3～5min。上述各管中分别加入400μL LB液体培养基，使总体积为500μL，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37℃振荡培养30min，使受体细胞恢复正常生长状态，并使转化体产生抗药性。 (三)平板培养

取各样品培养液100μL分别接种于含氨苄青霉素和不含氨苄青霉素的LB平板培养基上（分别记为Amp—和Amp＋），涂匀。37℃培养24h，待菌落生长良好且未相互重叠时停止培养。 (四)检出转化体

受体菌对照组A 质粒对照组B 转化实验组C

五、注意事项

不含抗生素培养基- 有大量菌落长出 无菌落长出 有大量菌落长出

含抗生素培养基+ 无菌落长出 无菌落长出 有菌落长出

结果分析

本实验未产生抗药性菌株 质粒DNA不含杂菌 质粒进入受体菌中产生抗药性

1．这一个实验中的所有操作均要为无菌操作，在超净工作台内进行。 2．细胞转化中，42℃水浴90s要准确操作。

3．制备感受态细胞过程中，需要在冰上放置的一定不要在室温中放置。

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思考题

1．感受态细胞制备好后，为什么在转化前还要在冰上放置？

答：细菌处于0℃，CaCl2 的低渗溶液中，菌细胞会膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面（因为DNase会消化外源DNA，如形成抗DNase的物质有利外源DNA的生存），从低温突然提高到42℃短时间热刺激，应激反应下可产生大量cAMP，而cAMP可改变细胞膜通透性，促使细胞吸收 DNA复合物，从而大大提高转化率。 2．思考转化后平板培养应有的结果、分析自己培养的情况。

答：实验涉及两种菌体，一为不含氨苄抗性基因的细胞，二为含有氨苄抗性基因的细胞。细胞一因为不含苄抗性基因，所以会被氨苄杀死或抑制生长，所以这种细胞只能在不含有氨苄的培养基上生长。细胞二为含有氨苄抗性基因的细胞，能对氨苄产生抗性，故而这种细胞既能在不含有氨苄的培养基上生长，又能在含有氨苄的培养基上生长。

A组中只有菌体和CaCL2而无抗性基因，所以只有在不含氨苄的培养基上才能看到菌落，而在含有氨苄的培养基上不可能有菌落，否则为培养基染菌。

B组中只有CaCL2和含有抗性基因的质粒而没有细胞，所以不管在那种培养基上都不应该长出菌落，否则即为染菌。

C组中含有CaCL2、含有抗性基因的质粒和不含氨苄抗性基因的大肠杆菌细胞。在CaCL2的作用下，细菌细胞壁结构发生变化，导致含有抗性基因的质粒进入细胞，此过程即为转化。此时的细胞即为细胞二，所以不管是在含有氨苄的培养基上还是在不含有氨苄的培养基上都能观察到菌落。且在含有氨苄的培养基上观察到的菌落数应该比在不含有氨苄的培养基上都能观察到菌落数少，因为转化这个过程的效率不是100%，没有转入抗性基因的细胞就不能在含有氨苄的培养基上生长。 观察平板，结果与理论结果完全一致。 附录：

1. pH8.0 G.E.T.缓冲液 (灭菌后使用) ：

葡萄糖 0.991g EDTA-Na2 0.372g Tris-HCl 0.303g H2O 100mL

2. 5mol/L KAc：49.08g KAc溶于100mL H2O。

3. PH4.8乙酸钾溶液：取60mL 5mol/L KAc,11.5mL 冰醋酸，28.5mL H2O即可。 4. 0.2mol/LTris-Cl：2.422g溶于100mL H2O。

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5. 0.2mol/LHCl：取1.724mL浓HCl稀释到100mL。

6. pH8.0 0.1mol/L Tris-HCl：取0.2mol/LTris-Cl 50mL加入29.2mL 0.2mol/LHCl，补H2O至100mL

即可。

7．pH8.0 10mmol/LEDTA-Na2：3.722g EDTA-Na2溶于一定量的 H2O中，用固体NaOH调节其pH

值，最后定容至100mL。

8．pH8.0TE：取10mL pH8.0 0.1mol/L Tris-HCl，10mL pH8.0 10mmol/L EDTA -Na2，最后定容至

100mL，调节pH至8.0。含RNA酶（RNaseA）20ug/mL。

9．pH7.6 0.1mol/L Tris-HCl：取0.2mol/LTris-Cl 50mL加入38.5mL 0.2mol/L HCl，补H2O至100mL

即可。用于饱和酚/仿混合物。

10．酚/仿溶液（按如下体积和顺序加入试剂）

饱和酚：重蒸酚 12.5mL 三氯甲烷 12mL 异戊醇 0.5mL

用pH7.6 0.1mol/L Tris-Cl平衡2～3次，在饱和酚/仿上，加入等体积的pH7.6 0.01mol/L Tris-Cl保护，棕色瓶保存，4℃存放。

11．5×TBE： 称取Tris-Cl 21.8g，硼酸11.0g和EDTA-Na2 1.4g用蒸馏水溶解，定容至400mL。临用

时稀释为0 .5×TBE。

12．0.1 mol/LCaCl2：5.5g CaCl2溶于500mL H2O。灭菌后备用。 13．无菌水。

实验四PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测

【实验目的】

? 掌握PCR扩增技术的基本原理 ? 掌握PCR的常规操作

? 熟悉PCR反应体系中六种主要成分的作用 ? 了解PCR技术的应用

? 掌握琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的方法 ? 熟悉DNA在电泳过程中迁移率的决定因素

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【实验原理】

1. PCR基本原理

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于在体外快速扩增DNA，类似DNA的细胞内复制过程:由一对引物介导，通过温度的调节，使双链DNA变性为单链DNA、单链DNA能与引物复性（退火）成为引物-DNA单链复合物、以及在dNTPs存在下DNA聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链DNA（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个PCR循环；一般通过20-30个循环之后，就可获得大量（106倍）的要扩增的DNA片段。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

重复循环“变性—退火—延伸”三个过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

2. PCR反应体系

标准的PCR反应体系 本实验所用的PCR反应体系（50 μl）

10×扩增缓冲液 4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+ 加双或三蒸水 10μl 200μl 10～100μl 0.1～2μg 2.5 μl 1.5mmol/L 100 μl

ddH2O 10×PCR Buffer (含Mg2+) 10mM dNTPs 引物 模板 (质粒DNA) Taq酶 38.75 ul 5 ul 1.25 ul 1.25 +1.252 ul 0.5 ul word完美格式

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3、 琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片断的典型方法，其特点为简便、快速。DNA片断琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同，DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小及构想有关。对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。在凝胶中加入少量溴化乙锭（有毒！），其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种光络合物，在254~365nm波长紫外光照射下，呈现桔红色的荧光，因此可对分离的DNA进行检测。电泳时以溴酚蓝及二甲苯氰（蓝）作为双色电泳指示剂。其目的有：①增大样品密度，确保DNA均匀进入样品孔内；②使样品呈现颜色，了解样品泳动情况，使操作更为便利；③以0.5×TBE做电泳液时溴酚蓝的泳动率约与长700bp的双链DNA相同，二甲苯氰（蓝）则与2Kbp的DNA相同。

【实验仪器、材料和试剂】

1、仪器：微量移液器，枪头(10μL,200μL)枪头盒，离心管(200μL)，PCR仪，电泳仪，电泳槽，凝胶成像系统。

2、材料：模板DNA 引物 3、试剂：dNTP TaqDNA聚合酶

【实验步骤】

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1. 按照以下顺序，依次添加入PCR管内。

ddH2O 38.75 ul 10×Buffer 5 ul dNTP 1.25 ul 引物 1.25 +1.25 ul 模板 2 ul Taq酶 0.5 ul

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2. 将配制好的PCR体系充分混匀后，离心。 3. 盖紧PCR管的盖子，插入PCR仪的孔内。 4. 设定好程序，开始PCR反应。

5. PCR反应结束后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

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【注意事项】

1. 换枪头，避免污染试剂 2. 酶置于冰上，且最后加入体系中 3. PCR管的盖子一定要盖紧，以防蒸干 4. PCR仪由指导老师操作

5. 琼脂糖凝胶电泳时，电泳方向为阴极→阳极 6. EB是强诱变剂，一定要戴手套保护自己

【思考题】

? PCR反应体系中主要成分有哪些？它们分别起什么作用？

答： 主要成分及其作用如下：

1、NDA聚合酶 将单个dNTP连接到NDA链上，其延长链的作用 2、dNTP 为新NDA链的合成提供原料

3、缓冲液 为PCR反应提供适宜的离子环境和恰当的pH值，保证反应的有效性和效率

4、双蒸水 提供液体环境 5、模板 提供NDA复制的母链

6、引物 识别复制起始点，与模板相结合，开始NDA的复制

? 为什么在PCR过程要使用三个不同的温度？

答：PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度使引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。这三个过程所需的温度都不相同，所以完整的PCR反应需要三个不同的温度。

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? 用PCR扩增目的基因，如何提高产物的特异性？ 答：可以从以下几个方面考虑

1，镁离子浓度过高会降低pcr扩增特异性

2，引物的设计是否存在问题，用软件分析下引物的特异性好不好。 3, 可以考虑用高保真聚合酶,如pfu,特异性极高,错误率低.

4、当模板是自己提取的时候，可能残留有乙醇，EDTA等影响pcr酶活性的物质。

? DNA在电泳过程中的迁移率取决于哪些因素？

答：DNA在电泳过程中的迁移率取决于DNA分子特性和电泳条件。 ⑴DNA分子大小 DNA分子越大在胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢，迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。

⑵DNA分子构型 对于质粒DNA分子即使具有相同分子质量，因构型不同也会造成电泳时受到的阻力不同，最终造成泳动速率的不同。常规电泳中质粒DNA分子的3种构型泳动速率：超螺旋最快、线状分子次之，开环分子最慢。

⑶不同的胶浓度 对于同种DNA分子胶浓度越高，电泳速率越慢。不同胶浓度对于DNA片段呈线性关系有所区别，浓度较稀的胶线性范围较宽，而浓的胶对小分子DNA片段呈现较好的线性关系。所以常规实验中对于小片段DNA分子的分离采用高浓度的胶分离（有时甚至用2％的凝胶），而对于分离大片段则用低浓度的凝胶。

⑷溴化乙锭 简称EB，电泳中的染色剂，具有扁平结构，能嵌入到DNA碱基对间，对线状分子与开环分子影响较小而对超螺旋态的分子影响较大。当DNA分子中嵌入的EB分子逐渐增多时，原来为负超螺旋状态的分子开始向共价闭合环状转变，电泳迁移速度由快变慢；当嵌入的EB分子进一步增加时，DNA分子由共价闭合环状向正超螺旋状态转变，这时电泳迁移速率又由慢变快。这个临界点的游离EB质量浓度为0.1g/ml~0.5g/ml，即电泳时所加的浓度。因此一般电泳可以忽略此因素，而对于特殊电泳，消除此因素影响可采用电泳后染色。 ⑸电场强度

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⑹电泳缓冲液

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