胸腺五肽纳米粒的制备及其处方优化

广东药学院学报

JournalofGuangdongPharmaceuticalUniversity

Aug．2012，28（4）

药剂学

胸腺五肽纳米粒的制备及其处方优化

单紫筠

1，2，3

11111，3，4

，谭银合，杨志文，余思琴，陈宝，吴传斌

（1．中山大学药学院，广东广州510006；2．广东药学院药科学院，广东广州510006；3．广东省创新药物制剂工程技术研究开发中心，广东广州510006；4．中山大学药物制剂工程研究开发中心，广东广州510006）

摘要：目的建立制备胸腺五肽纳米粒的方法并对其处方进行优化，为制备符合要求的压力定量吸入气雾剂奠定基础。方法将胸腺五肽、卵磷脂、乳糖溶于叔丁醇-水的混合溶剂中，冷冻干燥，将冻干产物用异丙离心除去多余的卵磷脂以得到纯药物纳米粒。采用星点设计-效应面法对其中水、卵磷脂、胸腺五醇混悬，

肽的用量进行优化，因胸腺五肽的含量受此处方影响不显著，所以只选取纳米粒的粒径、粒径分布为结果213．5卵磷脂∶叔丁醇、胸腺五肽∶水的比例分别为0．5（mL∶mL）、考察指标。结果最优处方：水∶叔丁醇、

（mg∶mL）、17．0（mg∶mL），即水的用量1．5mL、卵磷脂的用量640．57mg、胸腺五肽的用量25．57mg、叔丁醇的用量3．0mL。按此处方制备的纳米粒粒径在150nm左右，多分散系数为0．1以下，含量均能保持在98%以上。结论采用该方法制备胸腺五肽纳米粒，质量佳，重现性好，方法简便，具有良好的应用前景。关键词：胸腺五肽纳米粒；制备方法；处方优化；星点设计-效应面法中图分类号：TQ460．4；R94

文献标志码：A

doi：10．3969/j．issn．1006-8783．2012．04．001

8783（2012）04-0355-06文章编号：1006-

Anovelbottom-upprocesstoproducethymopentinnanoparticlesandtheirformulation

optimization

2，33，4

SHANZi-yun1，，TANYin-he1，YANGZhi-wen1，YUSi-qin1，CHENBao1，WUChuan-bin1，

（1．SchoolofPharmaceuticalScience，SunYat-SenUniversity，Guangzhou510006，China；2．SchoolofPharmacy，

GuangdongPharmaceuticalUniversity，Guangzhou510006，China；3．GuangdongResearchCenterforDrugDeliverySystems，Guangzhou510006，China；4．ResearchandDevelopmentCenterofPharmaceuticalEngineering，SunYat-senUniversity，Guangzhou510006，China）Abstract：ObjectiveAnovelbottom-upprocesswasdevelopedtoproducenanoparticlescontainingthymopentinandtheformulationwasoptimizedtoproducedesirablenanoparticlesfordevelopmentofpressedmetereddoseinhaler（pMDI）ofthymopentin（TP-5）．MethodsAsolutionofTP-5，lecithinandlactoseintert-butylalcohol（TBA）/

waterco-solventsystemwasfreeze-driedtogeneratenanoparticlesandresiduallecithinwaswashedoffin

lyophilizatethroughcentrifugation．Formulationparameterssuchaslecithincontentinorganicphase，watercontentinTBA/waterco-solvent，andTP-5contentinwaterwereoptimizedwiththecentralcompositedesign-response

surfacemethodology．AstheretainedcontentofTP-5innanoparticlesdidnotsignificantlyvarywiththeabove

formulationparameters，onlyparticlesizeandsizedistributionofTP-5nanoparticleswastakenasresponseparameters．ResultsTheratiosofwatertoTBA，lecithintoTBAandTP-5towaterintheoptimumformulationwereseparately0．5（mL∶mL），213．5（mg∶mL），17．0（mg∶mL），bywhichTP-5nanoparticleswithabout150nmofthemeanparticlesizeand0．1ofpolydispersityindex（PI）andtheretainedcontentofTP-5above98%weregained．

ConclusionThenovelbottom-upprocesswasdemonstratedtoproduceTP-5nanoparticleswithprocesssimplicity

andconvenience，goodreproducibilityaswellashigh-productquality．Keywords：thymopentinnanoparticles；bottom-upprocess；formulationoptimization；centralcompositedesign-responsesurfacemethodology

收稿日期：2012-05-03

Email：damaoyu2012@126．com；通信作者：吴传斌（1963－），作者简介：单紫筠（1989－），女，硕士研究生，男，教授，博士生导

Email：cbwu2000@yahoo．com。师，主要从事药物缓控释及靶向释药技术的研究，

网络出版时间：2012-06-3022：11网络出版地址：http：//www．cnki．net/kcms/detail/44．1413．R．20120630．2211．001．html

TP-5）为胸腺生成素Ⅱ胸腺五肽（thymopentin，

的免疫活性中心，它能提高T细胞的免疫能力，双向调节机体失衡的免疫功能，抗感染、抗肿瘤疗效显5的剂型只有冻干粉针，著。目前市场上TP-剂型单患者顺应性差。近年来，蛋白质多肽类药物的肺一，

部给药系统因具有良好的顺应性而成为热点

［1］

天津市光复精细化工研究所）；甲醇（色烷（分析纯，

谱纯，安徽时联特种溶剂股份有限公司）；超纯水；异丙醇（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）；KH2PO4、NaOH（分析纯，天津市福晨化学试剂厂）。

，其

2

2．1

方法

胸腺五肽纳米粒的制备

在表面活性剂卵磷脂与冻干保护剂乳糖的存在

中气雾剂因无创、轻便，便于携带、药物密封在耐压容器内可避免氧化分解等优点而广泛被病人与医务人员所接受

［2－3］

。5溶于叔丁醇-下，将TP-水的混合溶剂中，溶解完全后，置于冷冻干燥机中进行冻干，最后将冻干物进行纯化处理以得到纯药物纳米粒。具体步骤如下：称5、取适量TP-乳糖放入西林瓶中，加入超纯水溶解作为水相；再称取适量卵磷脂放入50mL塑料离心管中，加入叔丁醇溶解形成有机相；在涡旋或者搅拌下，将水相缓慢加入有机相中，形成淡黄色澄清透明液。用液氮将所得溶液速冻成固体，在冷冻干燥机上（真空度25Pa、冷阱温度－55℃）冻干36h除去水与叔丁醇，得到被卵磷脂包裹的纳米粒（即冻干产物）。将冻干产物转移入5mL塑料离心管中，用5和适量异丙醇混悬（由于卵磷脂溶于异丙醇而TP-乳糖不溶于异丙醇），用离心机在25℃离心（转速12000r·min－1）2min，倾去含有表面活性剂的上收集含纳米粒的沉淀。再反复用异丙醇离心清液，

洗涤2次以去除残留的卵磷脂，即获得高度纯化的TP-5纳米粒。2．2

处方优化

为了进一步得到具有良好特性如粒径较小且分TP-5含量高的纳米粒，5制本文对影响TP-布均匀、

备处方的诸多因素进行了考察。在预实验的基础上，经过单因素考察，选取了对纳米粒性质影响较大，且作用效果不易预测的3个因素：水的用量（X1，mL）、mg）、TP-5的用量卵磷脂的用量（X2，（X3，mg）作为自变量（乳糖与叔丁醇的量分别固定为15mg与3．0mL），以所得的纳米粒的粒径（Y1，nm）、PI）（Y2）为因多分散系数（polydispersityindex，Expert8．0．5软件包（Stat-Ease变量，采用Design-Inc．，Minneapolis，USA）中的星点设计进行多元线性回归和二项式拟合，用效应面法优选处方条件，并进2。行预测分析。因素水平设计、实验设计见表1、因所制得纳米粒为纯药物纳米粒，所以未选取载药量及包封率作为实验考察的因变量。2．3

粒径及PI的测定

5依照星点设计表，按“2．1”项下方法进行TP-

由于大部分蛋白质多肽类药物在氢氟烷（HFA）抛射剂中的溶解度很小，所以药物一般以微粒的形式混悬于抛射剂中除

［5－6］

［4］

。与一般的微粒相比，

纳米粒可以躲避巨噬细胞的吞噬及黏膜纤毛的清

［7］

，增大药物在肺部的沉积率，从而提高药物

用于肺部给药系统的纳米粒的制的疗效。近年来，

备方法比较多，如高压均质法、微乳模板法、纳米沉淀法等

［8－9］

，但这些方法都存在很多的缺陷，如制备

工艺较复杂、对蛋白质多肽的结构破坏可能性大、能耗大、使用毒性有机溶剂等。

为了克服以上方法的不足，本文受本实验室溶菌酶纳米粒制备方法

［10］

的启发，首次将加有表面活

5纳米粒性剂与乳糖的叔丁醇-水混合溶剂用于TP-的制备，简化了制备流程，避免了使用可能会破坏蛋白质多肽结构的高速剪切法，且降低了能量消耗。由于叔丁醇的凝固点、低共熔温度、蒸气压均较高

［11］

，且毒性较低，所以将叔丁醇与水结合起来可

［12］

以极大地改善冻干效果进行处方优化。

。为了获得满意的TP-5

［13－16］

纳米粒粒径及其分布，采用了星点效应面设计

1仪器与材料

ChristAlpha1-4LSC型冷冻干燥机（博劢行仪

器有限公司）；MettlerToledoEL型电子天平［梅特；AnkeTGL-16C离勒-托利多仪器（上海）有限公司］12DTD超声波心机（上海安亭科学仪器厂）；SB25-清洗器（宇波新芝生物科技股份有限公司）；UKMarlvenZetaszierNano-ZS90粒度检测仪（英国马尔10Avpplus高效液相色谱文仪器有限公司）；CBM-SPD-20A紫外检测器，LC-20A输液仪（日本岛津，

SIL-20A自动进样器）。泵，

TP-5原料药（批号20100601，成都凯捷生物医药科技发展有限公司）；乳糖（美华生物技术股份有限公司）；卵磷脂（LipoidE80，药用级，德国）；叔丁醇、异辛

表2

星点设计表及其结果

ResultsofCentralcompositedesign

X2300．00300．00750．00750．00300．00300．00750．00750．00525．00525．00146．60525．00525．00525．00525．00525．00525．00525．00525．00525．00

X320．0020．0020．0020．0045．0045．0045．0045．0032．5032．5032．5011．4853．5232．5032．5032．5032．5032．5032．5032．50

Y1246．5556．1198．3468．6398．6675．1375．6488．1226．5768．2693．6205．1206．2316．8236．6238．8237．7234．7234．4236．6

纳米粒的制备，得到1～20号沉淀物。分别称取沉淀物少许放入1～20号西林瓶，超声分散于已用0．2μm微孔滤膜滤过的异辛烷（预实验表明所得水溶性纳米粒在异辛烷中可得到良好的分散）中，得到

－1

混悬样纳米粒质量浓度约为4mg·mL的混悬液，

Table2序号1234567891011121314151617181920

X11．202．501．202．501．202．501．202．500．762．941．851．851．851．851．851．851．851．851．851．85

Y20．2350．3310．2340．2540．3680．5010．2230．3750．2510．5610．5110．1350．1240．2380．1220．1250．1270．1240．1210．125

品液转入不结霜的石英皿，放入动态光散射仪的样ZS品托中，平衡2min后，用马尔文ZetaszierNano-90粒度检测仪进行测量，每个样品平行测量3份。2．4

含量的测定

参考《国家药品标准新药转正标准》第50册及肖远等

［17－19］

5含量测定方法（即报道的TP-

HPLC法）测定TP-5的含量并进行适当调整，具体方法如下。

色谱条件为色谱柱：PhenomenexLunaC18（5μm，4．6mm×250mm）；流动相A：50mmol·L－1磷酸盐缓冲液（以NaOH调节pH在7．0左右）；流动相B：甲醇；A泵流速：0．850mL·minmL·min

－1

－1

；B泵流速：0．150

；柱温：室温；检测波长：275nm；进样

TP-5峰与相邻杂质峰的分量：20μL。结果表明，

5峰计算应不低离度大于1．5，理论塔板数按TP-于1200。

“2．1”5纳测定方法：取按项下方法制备的TP-米粒沉淀物适量，精密称定，加入流动相溶解并稀释成每1mL中约含0．5mg的溶液，作为供试品溶液。精密量取20μL供试品溶液注入液相色谱仪，记录5对照品适色谱图。另取经P2O5干燥至恒重的TP-5量，同法测定，按外标法以峰面积计算样品中TP-的含量。

3．2模型拟合

以所得纳米粒的粒径（Y1）及PI（Y2）对水的用

TP-5的用量（X3）用量（X1）、卵磷脂的用量（X2）、Design-Expert8．0．5软件包（Stat-EaseInc．，

Minneapolis，USA）进行曲线拟合并进行多元线性回归及非线性估计的分析。所得回归方程如下：

多元线性回归：

Y1=45．26+211．78X1－0．38X2+3．83X3（r=0．7784，S=125．90，F=3．70，0．001＜P＜0．01）；

Y2=0．11+0．10X1－3．19×10－4X2+3．54×10－3X3（r=0．6402，S=0．12，F=8．20，0．01＜P＜0．05）。

二项式拟合：

Y1=790．17－433．40X1－1．57X2+6．17X3－0.17X1X2－2．94X1X3－3．30×10－3X2X3+224．83X21+1．54×10－3X22+0．07X2S=66．67，3（r=0．9648，F=14．97，P＜0．0001）；

Y2=1．28－0．83X1－1．41×10－3X2－5．23×10－3X3－4．87×10－5X1X2+2．60×10－3X1X3－8．58

－62×10－6X2X3+0．24X2X2+1．30×10－41+1．39×10

3

3．1

结果

处方优化

5纳米粒的粒径、根据星点设计制备得到的TP-

PI见表2。此外，1～20号纳据含量测定结果表明，米粒的含量均为最初投药量的98%以上，含量稳定，与预实验相吻合。

表1

星点设计的因素水平及代码

Variablesandcodesofcentralcompositedesign

因素水平值

－1．6820．76

－11．20

01．85

12．50

1．6822．94

Table1

因素X1（V/mL）X2（m/mg）X3（m/mg）

146．60300．00525．00750．00903．4011．48

20．00

32．50

45．00

53．52

X2S=0．048，F=17．34，P＜0.0001）。3（r=0．9694，

由拟合结果可知，二次多项式模型较多元线性

所以采用二次多项式作模型拟合度高且置信度高，

为进一步优化的数学模型。然而，根据统计软件对仍有部分参数项对方各项系数进行的t检验结果，

依次删除对方程影响不显著（P＞程的影响不显著，

0．05）的参数项，重新拟合，得回归方程：

Y1=1107．32－609．99X1－1．97X2+3．83X3+

－32222．10X2X2（r=0．9548，S=63．70，1+1．52×10

（实测值－预测值）/预测值×100%，结果见表3。

结果表明，验证实验的实测值和预测值相吻合，拟合方程的预报性良好，纳米粒的制备处方重现性良好。采用优化处方后制备的纳米粒进行透射电镜结果见图7。从图可见：纳米粒近球形，扫描观察，

平均粒径在150nm左右且分布均匀，表明制备的纳米粒有合适的粒径及分布，适合肺部给药。

700

600500400300200100

F=28．92，P＜0．0001）；

－62×10－3X3+0．232X2X2（r=0．9499，1+1．354×10

S=0．052，F=25．85，P＜0．0001）。

重新拟合后粒径与PI的相关系数r相对于线

r值降幅性拟合仍均有大幅提高，方程删项简化后，很小且置信度高，表明两方程仍有较大可信度。

3．3处方参数预测

固定一个变量为中值，把因变量与另2个因素按二项式数学模型拟合为三维曲面图与等高线图（图1～6）。由图可见，图1～图6中的曲面图均略呈山谷型并向一侧倾斜，在一定程度上随着水的含

5含量的下降、量与TP-卵磷脂含量的增加，所得纳

图1

粒径/mm

Y2=1．167－0．753X1－1．741×10－3X2+3．542

750.00

m(卵

磷脂

570.00

)/m

g

390.001.53

300.001.20

1.85

2.17

2.50

V(

/m水)

L

水的用量与卵磷脂的用量对粒径的效应面与等高曲线图

Predictedresponsesurfaceandcontourlineofparticle

Figure1

sizeasafunctionofwaterandlecithinandcontent

粒径/mm

米粒的粒径与PI均减小。从图中读出在所得纳米

X1、X2、X3的范围分别为1．20粒的粒径较小的区域，

～1．50mL，600．00～750．00mg，20．00～25．00mg，X1、X2、X3的范围分在所得纳米粒PI值较小的区域，

500．00～700．00mg，20．00～别为1．20～1．90mL，

27．00mg。再者，TP-5∶卵磷脂的比在实际生产中，例较高有利于降低成本，提高收率。根据使所得纳

米粒粒径与PI较小的各因素的取值范围与Design-Expert8．0．5软件包（Stat-EaseInc．，Minneapolis，

USA）给出的Solutions，5∶卵磷脂同时适当提高TP-的比例，优选最佳处方为：水∶叔丁醇、卵磷脂∶叔丁

TP-5∶水的比例分别为0．5（mL∶mL）、213．5（mg∶醇、

mL）、17．0（mg∶mL），即水的用量1．5mL、卵磷脂的

TP-5的用量25．57mg、用量640．57mg、叔丁醇的用量3．0mL。

3．4验证实验

TP-5、优化后得到的处方：水、卵磷脂、乳糖及叔

640．57mg、25．57mg、丁醇的用量分别为1．5mL、

15mg及3．0mL。再按照“2．1”项下方法制备3批

TP-5纳米粒样品，5纳米粒粒径、PI、分别进行TP-含±s）表示，量的测定。测定结果以均数±标准差（x珋并与拟合方程预测值相比，采用偏差表示，偏差=

图3图2

600

5004003002001002.50

45.0040.00

1.85

1.53

30.00

1.2020.00

2.17

V(水

)/m

L

m

-5(TP

)/mg

TP-5的用量与水的用量对粒径的效应面与等高曲线图Predictedresponsesurfaceandcontourlineofparticlesizeasafunctionofthymopentinandwatercontent

Figure2

500

粒径/mm

40030020010045.00

750.00660.00

480.00

20.00300.00

m(T

35.00

P-5)/m

g

m(卵

)磷脂

/mg

5的用量对粒径的效应面与等高卵磷脂的用量与TP-曲线图

Predictedresponsesurfaceandcontourlineofparticle

Figure3

sizeasafunctionoflecithinandthymopentincontent

第4期单紫筠，等．胸腺五肽纳米粒的制备及其处方优化359

0.50.4

PI

0.30.20.1750.00

2.50

m(卵

570.00

磷脂

)/m

g

1.53890.00

300.001.20

1.85

2.17

)V(水

/mL

图7

纳米粒的透射电镜图

TEMofthenanoparticles

图4水的用量与卵磷脂的用量对PI的效应面与等高曲线图

PredictedresponsesurfaceandcontourlineofPIasafunctionofwaterandlecithincontent

Figure4Figure7

4

0.40.3

讨论

PI

0.20.102.50

2.17

45.0040.00

30.00

1.2020.00

5纳米粒制备方法：本文建立了一种新的TP-5加入到含有乳糖与表面活性剂卵磷脂的叔将TP-丁醇-水的混合溶剂中，形成单相溶液，液氮速冻后再将冻干产物用异丙醇混悬后用离心冷冻干燥，

法进行纯化处理以得到纯药物纳米粒。在对其进行处方优化的过程中发现，卵磷脂在有机相中的

5浓度与水在叔丁醇-水混合溶剂中的比例对TP-纳米粒的粒径及PI有显著的影响。

本文主要通过卵磷脂的用量及液氮速冻来控

制所得纳米粒的粒径及粒径分布（PI）。液氮速冻可提高纳米粒晶核的生长速度，使同一时间内更多晶体生成。卵磷脂具有低相变温度及很高的表面活性，可事先吸附在叔丁醇水合物晶体的表面，减少表面张力。由于卵磷脂吸附在纳米粒的表面，在纳米粒子间产生位阻，使纳米粒相互接触的机会减少，因此纳米粒的粒径及粒径分布得到很

750.00

V(水1.851.53

)/mL

图5

m

)/mg5-(TP

TP-5的用量与水的用量对PI的效应面与等高曲线图

PredictedresponsesurfaceandcontourlineofPIasafunctionofthymopentinandwatercontent

Figure5

0.35

0.30.250.20.150.10.05

PI

45.00

m(T

P-5)

35.00

/mg

570.00480.0025.00)/mg脂20.00300.00

卵磷

好地控制。此外，卵磷脂还有利于在制备过程中

5的结构。保持TP-星点设计-效应面优化法是适宜进行非

线性拟合的优化法，通常在最佳条件附近，指标与影响因素之间的关系为非线性，此时不宜采用线性方程进行拟合，而应选用二次多项式或更高次的多项式进行拟合，以得到最佳的模型拟合度。本文中二次多项式模型的拟合相关系数达0．9548，模型可信度较高。验证实验的结果也证实所建立的数学模型具有极佳的预测性，表明该实验设计方法成功地对本处方进行了优化。近年来，制备肺部给药的纳米粒常采用微乳

［8－9］

。但是，模板法、纳米沉淀法等这些方法制备采用高速剪切均质易破坏蛋白质多工艺较复杂，

肽的结构，采用低凝固点的甲醇、二氯甲烷等有机

［13－16］

m(

图65的用量对PI的效应面与等高曲卵磷脂的用量与TP-线图

PredictedresponsesurfaceandcontourlineofPIasa

Figure6

functionoflecithinandthymopentincontent表3

±s，n=3）验证实验结果（x珋

Resultsoftheverificationexperiments粒径/nm

预测值实测值偏差/%

148．47146．30±18．77

1．46

PI0．0890．094±0．012

5．62

保留含量/%

99．298．7±1．20．50

Table3

360广东药学院学报第28卷

［9，20］

溶剂在－110℃冷冻干燥能耗大、对环境污染

5纳米粒的方法，简化了大。本文采用的制备TP-

［10］TANYin-he，YANGZhi-wen，PENGXin-sheng，etal．A

novel

bottom-up

process

to

produce

nanoparticles

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制备流程，避免了使用可能会破坏蛋白质多肽结由于使用了叔丁醇-水混合构的高速剪切。再者，

在－50～－55℃冷冻干燥很大程度上减少溶剂，

TP-5在60℃时24h内不会了能量的消耗。此外，

被破坏，冷藏条件下4d内基本稳定，冷冻条件下

1个月内稳定，200W、15min内超声不会影响其稳定性，本方法中还加入了一定量的乳糖与卵

TP-5更趋稳定。本方法制备的TP-5纳米粒磷脂，

质量佳且制备过程简单，在肺部给药中具有很好

的应用前景。

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(责任编辑:陈翔)

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