有毒有害物质检测

第六章 兽药残留检测技术 第一节 兽药残留

兽药残留是指动物性产品的任何可食部分含有兽药母化合物或其代谢物。 兽药最高残留限量（MRL）：是指某种兽药而在食物中或食物表面产生的的最高允许兽药残留量（单位μg/kg, 以鲜重计）。

休药期：是指自末次给药到动物允许屠宰或其动物性产品（乳、蛋等）获准上市的间隔时间。 兽药的危害：过敏、致畸、致突变、致癌 一、常见兽药

主要有：抗微生物药(抗生素、抗菌药和抗病毒药)、抗寄生虫药(抗蠕虫药、抗原虫药、杀虫药)、激素类及生长促进剂等。

1、抗微生物药是指对病原微生物(细菌、真菌、支原体、病毒等)具抑制或杀灭作用,主要有用于全身感染的抗生素、磺胺药及其他化学合成抗菌药。

2、抗寄生虫药是指能杀灭或驱除动物体内外寄生虫的药物。 3、激素与其他生长促进剂

(1)性激素 (2)生长激素 (3)甲状腺素 (4)人工合成的蛋白质同化激素 (5)镇静剂和β-肾上腺素阻断剂 二、常见兽药残留的种类与危害 1. 抗生素类药物

青霉素类最容易引发超敏反应, 四环素类、链霉素有时也能引起超敏反应。轻至中度的超敏、极度超敏反应损害听力及肾脏功能。 2. 磺胺类药物

主用于抗菌消炎, 如磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶, 磺胺眯, 菌得清、新诺明等。 引起结晶尿、血尿、管型尿、尿痛、尿少甚至尿闭。 3. 硝基呋喃类药物

主用于抗菌消炎, 如呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因等。

对人造成的危害是胃肠反应和超敏反应，长期摄入可引起不可逆性末端神经损害。 4. 抗寄生虫类药物

主要用于驱虫或杀虫, 如苯并咪唑、左旋咪唑、克球酚、吡喹酮等。

对人主要的潜在危害是其致畸作用和致突变作用。对于妊娠期的孕妇有可能发生胎儿畸形，对所有消费者来说, 可能由于其致突变作用使消费者发生癌变和性染色体畸变, 从而其后代有发生畸形的危险。 5. 激素类药物

主要用于提高动物的繁殖和加快生长发育速度, 使用于动物的激素有性激素和皮质激素。而以性激素最常用, 如孕酮、睾酮、雌二醇、甲基睾酮, 丙酸睾酮、苯甲酸雌二醇、己烯孕酮等。

摄入性激素残留超标的动物性食品, 可能会影响消费者的正常生理机能, 并具有一定的致癌性, 可能导致儿童早熟、儿童发育异常、儿童异性趋向等。 二、食物中兽药残留（重点掌握） (1)兽药残留的来源

①不正确地应用药物,如用药剂量、给药途径、用药部位和用药动物的种类等不符合用药指示,这些因素有可能延长药物残留在体内的时间,从而需要增加休药的天数; ②在休药期结束前屠宰动物;

③屠宰前用药掩饰临床症状,以逃避屠宰前检查; ④ 以未经批准药物作为添加剂饲喂动物;

⑤药物标签上的用法指示不当,造成违章残留物;

⑥饲料粉碎设备受污染或将盛过抗菌药物的容器用于贮藏饲料;

⑦接触厩舍粪尿池中含有抗生素等药物的废水和排放的污水(如猪经常摄入这种污水);

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⑧任意以抗生素药渣喂猪或其他食品动物等滥用抗生素,是出现抗生素残留的主要原因。 (2)兽药残留的种类（掌握）

第一类是以游离或结合形式存在的原药及其主要代谢物。,因代谢和排泄迅速,不会在动物体内蓄积。但这些物质可能具有毒性作用,而且被人摄入后在体内可生成高度活化的中间产物,，因而对消费者具有潜在的危害性。

第二类是共价结合代谢物,因其从机体排出相对较慢,它们的存在对于靶动物有潜在的毒性作用,而对于消费者,由于结合残留在人体内不可能再活化,其生物利用率和含量均低,可能只显示很低的毒性。 三、兽药残留的危害——五点

动物性食品中的兽药残留对人体健康的影响,主要表现为①变态反应与过敏反应、②细菌耐药性、③致畸作用、致突变作用和致癌作用,④激素(样)作用、⑤一般毒性作用等多方面。

细菌耐药性是指有些细菌菌株对通常能抑制其生长繁殖的某种浓度的抗菌药物产生了耐受性。 第二节 样品前处理

1、样品前处理是指样品的制备和对样品中的待测组分进行提取、净化、浓缩的过程。

2、残留分析中的样品主要是各种食用组织(肌肉、脂肪、肝、肾、皮、血液、蛋、奶及其加工食品)。 3、活体检测中一般采集血浆、尿液和粪便;屠宰场主要采集某种药物的靶组织及其他高浓度的样本,如肝、肾、胆汁、注射部位的组织等。

4、食品样品前处理

食品分析中样品前处理,包括了抽样、制备和提纯。 一、生物样品的类型（必须掌握）

兽药残留分析中,最常用的生物样品是组织样品,其次是奶、血液和尿液样品。 (1)动物组织

肝或肾组织为代谢或排泄器官,残留物浓度高,消除缓慢,因此常被作为残留检测的靶组织。 (2)尿样

尿液的主要成分是水、尿素及盐类。它是一种良好的细菌培养基,因而需立即冷藏或防腐处理。

若欲在室温下保存,应在收集尿样后,立即加入防腐剂。在所有体液样品中,尿样最容易获得,并且样品量多,内含药物(母体药物及代谢物)浓度高;正常尿液中仅含微量蛋白质,不需去蛋白处理。

尿中药物大多呈结合状态,主要以葡萄苷酸和硫酸酯结合物存在,因此无论直接测定或萃取分离之前,都必须将结合态的药物水解,使药物游离出来。

尿样pH变化范围大,分析前需调节到一致的pH值。 (3)血样

1、血液采集好之后,由于激活了一系列凝血因子,血中的纤维蛋白原形成纤维蛋白,血液逐渐凝固,上层析出澄清的黄色液体称为血清。

2、若采血后立即将血液转入有抗凝剂(常用肝素)的容器中,并轻轻摇匀,则血液不再凝结,放置后血细胞会缓缓沉降,1~2h沉降完全,上层的黄色液体称为血浆。

3、若抗凝血不离心,保持血浆和血细胞混合在一起,则称为全血。

4、血浆和血清的化学成分与组织液相近,测定血浆或血清中药物浓度,比全血更能反映作用部位药浓的变化,测定方法一般也可互相通用。 ⑷奶样

非解离性的或极性较低的药物易由血浆向奶中扩散,导致奶中残留。 与血浆样品类似,奶中的药物可与蛋白质结合。 因此在萃取之前,必须将结合态的药物游离出来。 ⑸蛋

禽蛋包括蛋黄和蛋清。与蛋清相比较,蛋黄基本上为疏水性环境,低极性药物的残留较多。

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二、去蛋白处理

1、为什么要除去蛋白？？

因为生物样品含有大量的蛋白质,蛋白质在测定过程中会形成泡沫、浑浊或出现沉淀而干扰测定。蛋白质还会污染仪器或恶化测定条件,如直接进样用液相色谱分析含蛋白质的体液样品时,蛋白质会沉积在色谱柱上,这不仅影响柱效,而且大大缩短色谱柱的使用寿命。 2、方法（掌握）五点 1、有机溶剂沉淀

甲醇、乙腈、丙酮和乙醇是沉淀蛋白常用的有机溶剂,尤以甲醇和乙腈为最常用。 2、酸性沉淀

常用的酸性沉淀剂有三氯醋酸和高氯酸,其他还有钨酸、钼酸、磷钨酸、磷钼酸和苦味酸等。

酸性沉淀剂能同蛋白质的阳离子形成不溶盐而沉淀,必要条件是溶液的pH要低于蛋白的等电点。 3、无机盐沉淀

无机盐中以硫酸铵最常用。常用的重金属盐类有汞盐、铜盐和锌盐等,它们能与蛋白质形成不溶盐而沉淀析出。 4、透析法

透析法与超滤法也是除去样品中蛋白的方法。很费时,溶质透过膜的程度与被测物的性质、温度有关,膜需常常更新,很难自动化,因此透析法一般不用于常规分析。 5、超滤法

① 与蛋白沉淀法相比,其优点是适用于小量样品,不稀释试样,也不改变试样的pH,尤其适于含对酸碱不稳定的化合物的样品,用于样品的浓缩、脱盐、不同分子尺寸的分离。

② 如果待测物易被某种酶分解,那么超滤除去该酶后就避免了待测物的分解。在残留分析中超滤法常用于牛奶、血液中游离药物浓度和药物-血浆蛋白结合率的测定。

③ 超滤法的缺点是待测物可能被结合在滤膜上而影响回收率,而且一些能与大分子蛋白结合的药物也会随着蛋白质被除去而丢失。 三、结合物水解 (1)酸水解

酸水解通常使用无机酸,如尿样中结合物水解可加入适量的盐酸液。加入盐酸的浓度、酸化时间以及是否需要加热等,随药物而异,但最终应通过实验确定。水解后的样品呈强酸性,必要时可用碱液调整pH后再进行萃取。 (2)酶水解

1、是专一性很强的水解结合物的方法。通常使用的水解酶是β-葡糖苷酸酶或芳基硫酸酯酶,前者可专门水解药物的葡萄糖醛酸苷,后者水解药物的硫酸酯。也可用两者的混合物,将生物样品中药物的葡萄糖醛酸苷及硫酸酯同时水解。

2、优点：与酸水解相比,酶水解反应比较温和,一般不会引起被测药物分解；

3、缺点：酶试剂较贵、水解所需时间较长,使实验费用增加,此外酶试剂还会带入黏液蛋白等杂质,可能导致样品乳化或造成色谱柱阻塞。 (3)溶剂解

某些药物或内源化合物的硫酸酯,可随加入的萃取溶剂,在萃取过程中发生分解,通常称为溶剂解。也是分解结合物较温和的一种方法。 四、样品提取和净化

1、液-液萃取——是目前最常用的样品处理方法,其原因是:

①通过萃取可将被测组分自大量内源性物质中分离出来,减少杂质对测定的干扰; ②操作简单快速、经济实用; ③可将萃取液蒸发,使组分富集; ④可一次进行同类组分的萃取。

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溶剂选择应注意以下几点:①溶剂的极性②溶剂的沸点③溶剂的毒性④溶剂与水的互溶性——一般有机相与水相容积比以1:1或2:1为佳 2、固相萃取(SPE)

固相分离有两种实现样品纯化的途径。一种是保留杂质,待测组分不被保留而自然流出或者被洗脱;更为常用的一种途径是先使待测物完全保留在柱上,使干扰杂质随样品溶剂或洗涤液洗出,然后以小体积溶剂洗脱待测物。

优点：①快速,一般l~2min即可完成; ②回收率高,通常超过90%; ③精密度比较好;

④样品用量少,有一定的选择性,无乳化现象等。 3、基质固相分散技术（MSPD） 1、优点在于：

依靠机械剪切力、C18键合相的去垢效应和巨大的表面积，使样品结构破碎并且在填料表面均匀分散，浓缩了传统的样品前处理中所需的样品匀化、组织细胞裂解、提取、净化等过程，避免了样品匀化、转溶、乳化、浓缩造成的待测物损失，而且固定相处理样品的比容量大，提取净化的效率较高。

2、MSPD处理样品耗时短、节省溶剂、样品用量少，该方法已被用于近40种的兽药残留分析。 4、柱切换技术 优点：

①操作简单，全自动化，含蛋白样品可直接进样或简单地沉淀蛋白离心后即可进样；

②分析结果精密度高，一般无需内标，进样体积一般为0.2~1.0mL（血浆、血清因黏度较大，需稀释后进样），在线处理全过程由计算机程序控制，每个样品在同一预柱的相同条件下处理，分析结果的RSD一般小于5%。

③适于不稳定样品，如易光解、热不稳定样品的分析，全部过程在封闭状态下进行，避免了分离、浓缩等操作；

④富集作用，提高了检测灵敏度，尤其是极性较大的组分，无法用液-液萃取时，柱切换技术特别奏效。 5、超临界流体萃取（SFE）

既能溶解各种气体不溶解的物质,又有气体黏度小、渗透力强等优点,可以快速、高效地将被测物从样品中萃取出来。

6、固相微萃取（SPME） 7、免疫亲和色谱IAC 第三节 样品衍生化技术

一：衍生化是将样品中的待测组分制成衍生物,使其更适合于特定的分析方法。 (1)柱前衍生化

1、柱前衍生化是在色谱分离前,预先将样品制成适当的衍生物,然后进行分离和检测。

2、优点：衍生化试剂、反应时间和反应条件的选择都不受色谱条件的限制,衍生化后的样品能用各种预处理方法进行纯化和浓缩,也不需要附加特殊的仪器设备。

3、缺点：操作比较繁杂费时,容易引起误差,影响测定的准确度。 (2)柱后衍生化

1、柱后衍生化是样品经色谱分离后,使衍生化试剂与色谱流出组分在系统内进行反应,然后检测衍生物。 2、优点：操作简便、重复性好,色谱分离相衍生化连续自动进行,而且衍生化不影响组分的色谱分离。

3、缺点：需要附加输液泵、混合室和反应器等装置,由于柱出口至检测器间有较长的流程,可能发生色谱峰展宽。

实现柱后衍生化必须满足下列条件：

①衍生化试剂足够稳定,对检测器的响应可以忽略,不产生干扰;

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②衍生化试剂溶液与色谱流动相能互相混溶,混合后不产生沉淀或分层,而且色谱流动相适宜作衍生化反应的介质;

③衍生化试剂与色谱柱流出液的速度要匹配,混合迅速且均匀,以免产生噪声; ④衍生化反应必须迅速和重现性好,反应器设计要合理,以尽可能减少峰展宽。

第四节 抗生素类药物残留的危害分析与检测方法 一、氨基糖苷类抗生素

1、化学结构：由于其分子结构中都有一个氨基环醇环和一个或多个氨基糖分子,由配糖键相连接,因此最好称为氨基糖苷-氨基环醇类(Aminoglycoside-Aminocyclitol)抗生素,但因氨基糖苷类抗生素这一名称沿用已久

2、危害：该类药物的治疗浓度范围窄,不良反应较常见,主要为肾毒性、耳毒性、神经肌肉阻滞、造血系统毒性反应和过敏性反应,其中有些是不可逆毒性。

3、生物样品预处理：样品的预处理包括脱脂除蛋白、提取、净化和样品浓缩。 ①除蛋白的方法：

一是沉淀法,即在样品溶液中加入甲醇/盐酸溶液沉淀蛋白质。

二是酸提取法,即在样品中加入三氟乙酸、三氯乙酸、三氯乙酸/柠檬酸盐、高氯酸溶液沉淀蛋白质,将生物样品与酸溶液混匀或一起均质。某些情况下,如测定肾脏中阿布拉霉素,还需用浓氢氧化氨溶液对蛋白进行水解,保证有较好的样品回收率。蛋白水解包括酸解法或碱解法,上清液再经中和。 三是超滤法,经超滤法处理后的样品不会引入新的盐类污染及假色谱峰。

四是固相萃取法,这是近年来在残留分析中应用最广的一种快速、简便的除蛋白方法。 ①、提取

用高或低的pH值介质可有效提取生物样品中氨基糖苷类药物。

酸性介质：三氯醋酸、三氟醋酸、高氯酸、三氯醋酸-柠檬酸或甲醇-高氯酸溶液与样品一起均质、提取。 碱性介质：如甲醇-氢氧化氨溶液提取猪肾组织中的阿布拉霉素 ②、净化

净化方法包括液-液分配、固相萃取和基质固相分散技术(MSD)、在线痕量富集法等。

唯一例外的是阿布拉霉素,在辛烷磺酸离子对试剂介质中,可以用乙酸乙酯进行提取,提取回收率约90%。 4、分析方法

①、气相色谱法：样品脱蛋白和脱水后,用三甲基硅咪唑和七氟丁酰咪唑分两步衍生化,然后用电子捕获检测器（ECD）检测。

②、液相色谱法：氨基糖苷类药物可采用阳离子交换色谱柱或非极性反相色谱柱分离。检测器：紫外或荧光衍生化

二、四环素类 （一）样品处理

四环素类抗生素的四环母核上含有下列官能团:二甲胺基[-N(CH3)2]、酰氨基(- CONH2)、酚羟基和两个含有酮基和烯醇基的共轭双键系统。

本类抗生素是两性化合物,分子中存在酚羟基和烯醇型羟基,显弱酸性;同时含有二甲胺基,显弱碱性,故遇酸及碱,均能生成相应的盐。

1、提取：从生物样品中分离四环素类比较复杂,因为这类药物易与金属离子形成螯合物,以及与组织中的蛋白强烈结合,因此须用强酸或酸性脱蛋白剂进行提取。

2、净化：包括液-液萃取、固相萃取(SPE)、基质固相分散、超滤、免疫亲和色谱和在线痕量富集等方法。 （1）液-液萃取：

四环素类药物不溶于二氯甲烷等疏水性有机溶剂,因此液-液萃取利用疏水性有机溶剂将水相中的一些脂溶性杂质洗去。

（2）固相萃取(SPE)

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（二）分析方法 1、荧光分光光度法

2、薄层色谱法：荧光分光光度检测采用氯化镁和三乙胺显色,紫外分光光度检测采用快蓝BB和吡啶显色。 3、毛细管电泳法 4、高效液相色谱法

HPLC法是四环素类药物残留分析最常用的方法, 第五节 磺胺类药物残留的危害分析与检测方法

危害：能引起人的再生障碍性贫血,粒细胞缺乏症等疾病。 吸收后存在形式

游离型具抗菌作用,且能透过毛细血管进入各种体液和组织。

结合型无抗菌活性,也不能透入体液或组织中,但结合较疏松,能不断分解出游离型磺胺。 乙酰化是磺胺的主要代谢产物,无抗菌活性。 化学性质

本类药物水溶性较低,易溶于极性有机溶剂如乙醇、丙酮、乙腈、氯仿和二氯甲烷,难溶于非极性有机溶剂。 生物样品通过多次液-液萃取,可达到净化的目的。 1、提取

液体样品(如牛奶)可用水稀释过滤后,荧光直接检测,亦可用水性缓冲液或氯化钠溶液稀释,再进行净化处理。 组织样品(如肌肉、肾脏、肝脏)的预处理相对复杂些,一般采取均质、液-液萃取或固相萃取净化等步骤。 溶剂提取时,应尽可能使组织中结合态的残留物溶解,并且除去大部分的蛋白质。

一般可采用酸性水溶液、乙腈、氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮或混合溶剂等极性溶剂进行提取。

二氯甲烷中加入离子对试剂四丁基铵(pH10),对鱼肉和动物组织的提取,发现磺胺二甲氧嘧啶和奥美普林的提取率很高。

另外,提取过程中加入无水硫酸钠可脱去组织样品中的水分,有助于样品的充分提取。 2、净化

净化方法有液-液萃取、固相萃取、基质固相分散、在线痕量富集、液相色谱、在线透析和超临界流体萃取等。 有时为了获得高的净化效果,几种方法相结合应用。

液-液萃取尽管操作烦琐、耗费溶剂,但在所有净化方法中应用最广。

通过调节样液的pH值,使磺胺类药物有选择性地在有机相与水相之间进行分配。 用正己烷或乙醚进行液-液萃取,可以脱脂肪。 固相萃取

由于甲氧苄啶常和其他磺胺药物同时使用,而它们具有不同的pKa和溶剂亲和力,难以在给定的pH值和溶剂系统中同时提取,宜采用固相萃取法(SPE)。

该法操作较为简便、并对生物样品具有较高的“净化”能力,可提高方法的提取回收率和精密度。亦可将几种小柱串联应用,可获得更高的净化效果。

超临界流体萃取法被用于猪肾脏样品中甲氧苄啶和3种类固醇激素的提取分离。 三、分析方法

生物样品中磺胺类药物的分析,光谱法(分光光度法、荧光光谱法)和色谱法（薄层色谱、气相色谱、液相色谱、超临界流体色谱）具有灵敏、快速、方便等优点。 1、光谱法

光谱法主要用于样品中个别磺胺类药物的分析,最常用的方法为重氮化-偶合反应分光光度法。 光谱法选择性差,但可作为一种筛选法应用,如牛奶中磺胺醋酰和磺胺脒啶的筛选测定。 2、薄层色谱法

薄层色谱(TLC)经常作为样品筛选方法。

经薄层色谱分离后的磺胺类药物,可按两种方法进行定量分析：洗脱定量法和薄层扫描定量法。

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3、气相色谱法

气相色谱法(GC)具有高的灵敏度和选择性,但由于磺胺类药物难挥发, 测定时需要衍生化。

一般用重氮甲烷甲基化,或甲基化后再用N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)进行硅烷化或N-甲基双(三氟乙酰胺)(MBTFA)乙酰化,以增加挥发性,改善色谱特性(热稳定性、降低极性),氢火焰离子化检测器测定。 除了甲基化外,也可利用水解法将磺胺类药物水解成相应的挥发性胺类,继之以GC法测定,

也可与适宜的卤化试剂反应,生成相应的衍生物,如三氟乙酰化或七氟丁酰化衍生物等,以电子捕获检测器测定。

4、高效液相色谱法

流动相中加入适量戊磺酸、己磺酸和辛磺酸离子对试剂,可以改变磺胺类药物的保留时间和改善峰形。

HPLC的洗脱方式,一般采用等度洗脱,若需同时检测数种磺胺类药物或多种代谢物,可采用梯度洗脱,通过改变流动相流速或配比,实现在较短的时间内对生物样品中混合组分或代谢物的分离。

本法选择的流动相为磷酸盐缓冲液(pH7.0)-甲醇(85+15),可分离7种磺胺类药物的混合物。 5、紫外检测器

磺胺类药物在250~290nm波长区间有强的紫外吸收,因此HPLC的在线检测,一般采用紫外检测。

为提高检测灵敏度,可使用对二甲氨基苯甲醛(DMAB) 柱后衍生化,于450nm处紫外-可见光检测,已应用于蛋、奶和肌肉组织中13种磺胺类药物的测定,以及动物组织中6种磺胺类药物的测定。 6、荧光检测器

磺胺类药物本身具有弱的荧光特性,但荧光检测时还需要荧光衍生化。 常用的荧光衍生剂有邻苯二甲醛(OPA)、荧胺和巯基乙醇等。

磺胺类药物与OPA或其衍生物(如4-羟基-邻苯二甲醛)在酸性介质中反应呈现蓝色荧光,检出量可达1× 10-9~8×10-8mol/mL的浓度范围。

荧胺作为荧光衍生剂,可选择性地用于具有脂肪族伯胺基团药物共存时芳伯胺药物的微量测定,其检测限量可达0.8×10-9mol/mL。

衍生化方式有柱前衍生化和柱后衍生化。

第七节 苯并咪唑类药物残留的危害分析与检测方法

本类药物的特点是驱虫谱广,驱虫效果好,毒性低,甚至还有一定的杀灭幼虫和虫卵作用。

苯并咪唑类中的帕苯达唑、坎苯达唑、阿苯达唑和奥芬达唑对妊娠早期(约妊娠三周)绵羊的胎儿有致畸作用,因此用于孕畜时应特别慎重。 样品处理 1、水解

肝和奶样中苯并咪唑类药物与蛋白结合率较高,不易被有机溶剂提取,可先将样品水解后再提取游离的药物。 常用的水解方法有酸水解和酶水解两种。

酸水解通常使用无机酸,例如用4moL/L盐酸于80~110℃ ,在1~4h即可完成水解。

酶水解通常使用β-葡糖苷酸酶或芳基硫酸酯酶,前者可专一地水解葡萄糖醛酸苷结合物,后者可水解硫酸酯结合物。

2、提取及净化

液-液萃取(LLP)是提取苯并咪唑类药物的最常用方法,通常将水性溶液调节至适当的pH值,用水不相溶的有机溶剂提取。

用酸溶液提取时,即包括了样品的水解过程。

由于苯并咪唑类药物的极性和pKa差异很大,因此多残留提取相当困难,即使对单一药物,母药及其代谢产物的同时提取亦难。

(1)血浆、血清或其他生物液体

生物体液样品中的苯并咪唑类可用有机溶剂提取,直接进样分析。自动萃取仪具有省时、省力、重复性高的优点,应用日趋广泛。

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(2)组织

动物组织中的苯并咪唑类提取一般用有机溶剂,并经LLP和SPE净化。 (3)牛奶和奶制品

奶制品相对于组织样品要容易处理些,而且牛奶含更少的色素和内源性干扰物。

牛奶样品一般要脱蛋白和脂肪预处理,再调节溶液pH值,用水不相溶的有机溶剂(如:乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷)来提取,pH值的选择与被测物的种类和数量有关。 三、分析方法

苯并咪唑类药物残留的测定方法主要有生物检测法、分光光度法、薄层色谱法、免疫分析法、气相色谱法和液相色谱法，采用紫外、荧光和质谱检测。 1、生物检测法

生物检测法曾被用来检测食品中苯并咪唑类残留,但现在大部分用来评价驱虫剂的效能。

生物检测法首先用TLC板将残留物分离出来,然后用含培养剂和生物指示剂的溶液喷雾TLC板,TLC板上抑制生物繁殖的区域表明药物残留的存在,抑制区域的大小与残留物的浓度有关。 2、分光光度法

采用分光光度法测定农作物中的BEN残留。 3、薄层色谱法

TLC作为半定量分析方法,适合于食品中苯并咪唑类残留检测的筛选。 4、免疫分析法

免疫分析法是一种简便、灵敏、选择性高的检测方法。

一般情况下,生物样品如血浆、血清、牛奶能够直接测定或者稀释后测定。 早期,放射免疫法被应用于测定动物组织和农作物中的苯并咪唑类残留。 ELISA检测

基于辣根过氧化物酶结合(HRP)的竞争性ELISA法已被用于肝组织提取液以及水果、蔬菜和果汁中TBZ的检测,果汁样品稀释后可直接检测。 5、气相色谱法

只有少数苯并咪唑类药物(如:TBZ、5-OH-TBZ)可直接用GC法分析。

大部分苯并咪唑类药物极性较高,难以气化,热稳定性差,故GC法分析需要衍生化。 6、液相色谱法

HPLC法被广泛应用于动物组织中苯并咪唑类残留的分析,通常采用反相柱如C18、C8柱分离,也有采用正相柱如uBondapak NH2柱分离。

第八节 激素类药物残留的危害分析与检测方法 兽用激素包括皮质激素、同化激素

第七章 其他化学性污染的危害与检测

食品加工过程产生：二噁英、多氯联苯、亚硝胺、多环芳烃、杂环胺、食品添加剂

1、二噁英类化合物：一类氯代含氧三环芳烃类化合物，强致癌、免疫毒性、生殖毒性。 2、多氯联苯类化合物：含氯的联苯化合物，致癌、生殖毒性、神经毒 3、亚硝胺类化合物：亚硝酸盐转化，致癌。

4、多环芳烃类化合物：代表物为苯并芘，熏烤食物中。致癌。

5、杂环胺类化合物：含蛋白质较丰富的食物高温烹调时易产生，尤其是与明火直接接触或与灼热金属表面接触会提高环胺类的生成量。致癌。

6、食品添加剂引起的毒害：代谢转化产物的毒性（糖精在体内转化成环己胺）、杂质的毒性（森永砷乳）、营养性添加剂过量的毒性（维生素A、D）、添加剂引起的过敏反应（柠檬黄引起哮喘）。

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第一节 二噁英类化合物的危害分析与检测方法 一、定义

二噁英类化合物是指那些能与芳香烃受体结合,并且导致产生各种生物化学变化的一大类物质的总称。包括：多氯代二苯并-对-二噁英(PCDDs)和多氯代二苯并呋喃(PCDFs)。其中研究最多也是最典型和毒性最强的物质是2,3,7,8-四氯代二苯并-对-二噁英 存在形式：主要以混合物形式存在。 二、理化性质

所有二噁英化合物皆为固体,均具有很高的熔点和沸点,蒸气压很小,大多不溶于水和有机溶剂,但易溶于油脂,易被吸附于土壤、沉积物和空气

中的飞尘上,具有较高的热稳定性、化学稳定性 结构 和生物化学稳定性,一般加热到800℃才能分解。在环境中的自然降解很慢,半衰期约为9年。 *三、危害：

二噁英 (Dioxin),又音译为戴奥辛 ,是多氯甲苯和多氯乙苯类有机化学品的俗称 ,因其毒性是氰化钠的 130倍、砒霜的 900倍 ,故被称为“毒中之毒”。损害免疫系统、生殖系统及强致癌性。自然界中不存在天然的二噁英。二噁英完全是由于人为污染造成的。 1、致死作用与废物综合征 二噁英可以使动物中毒死亡。

*中毒特点为染毒几天内出现肌肉和脂肪组织总量急剧减少,体重严重下降,这些反应称为废物综合征

2、致癌性（Ⅰ类致癌物） 3、氯痤疮

二噁英毒性的一个特征标志是氯痤疮,主要表现为皮肤发生增生或过度角化、色素沉积,出现痤疮,并伴有胸腺萎缩及废物综合征。仅在高剂量时发生。 4、肝脏毒性

二噁英肝中毒者以肝脏肿大、实质细胞增生与肥大为共同特征。 5、胸腺萎缩及免疫毒性

二噁英可引起实验动物胸腺萎缩,主要以胸腺皮质中淋巴细胞减少为主。人类胸腺也是二噁英敏感器官

6、生殖毒性和致畸性

卵巢功能障碍、抑制雌性激素、睾丸形态改变，精子退化,数量减少、致畸性 三、污染来源

1、环境中的二噁英：①含氯化合物的生产和使用②垃圾、污泥的焚烧③煤、石油、汽油、沥青等的燃烧④含除草剂的枯草残叶的燃烧及森林大火也会产生二噁英。⑤意外事故和战争（变压器的泄露和意外爆炸）

一旦摄入二噁英就很难排出体外，积累到一定程度，它就引起一系列严重疾病。

2、食品中的二噁英：环境中二噁英进入食物链，造成食品原料污染；食品中的二噁英也可能来源于食品加工、包装、储存等过程以及意外事故。①生物富集（食物链）②食品加工与包装③意外事故

评价PCDD/Fs对人体危害的指标

? 需要根据PCDD/Fs的大量生化和毒理学数据,计算出各个同分异构体与

2,3,7,8-TCDD的毒性剂量的比值,此比值即为毒性当量因子(TEF)。 ? TEQ指的是毒性当量(值),是衡量多种化合物的综合毒性的一个指标,利用TEF可以

计箅出样品中PCDD/Fs所有异构体的综合毒性,即毒性当量(TEQ)。 9

四、二噁英类化合物检测的定量方法及特点 定量方法:

总含量=毒性当量(TEQ)

∑(二噁英类化合物各种同系物在样品中的含量x其相应的毒性当量因子TEF) 五、二噁英的分析检测

? 二噁英的分析方法很多,其定性定量最常使用的方法是高分辨率气相色谱-质谱法。 色谱法:提取→净化→测定→定性→定量 免疫法:二噁英可被受体特异性识别并结合

生物法:二噁英能在体外细胞培养中转化为特殊生物信号。这种方法是根据二噁英类化学物质的毒性机理。二噁英类化学物质的毒性作用主要通过与体细胞内芳香烃受体相结合，然后结合物转移细胞核,再通过蛋白质表达出来。 饲料中二噁英类化合物的检测

气相色谱-质谱法、免疫学和生物学检测法 、酶免疫分析(EIA)法、时间分辨荧光免疫分析(DEIFIA)法、化学激活荧光表达(CALUX)法 、化学激活荧光基因表达(CAFLUX)法 、7-乙氧基异吩恶唑酮-脱乙基酶(EROD)法 、PCR技术 、蛋白标记分析 第二节 多氯联苯的危害分析与检测方法

一、结构C(12) H(10 – X) Cl (X)，X 为H或Cl 二、污染来源

PCBs的主要污染来源是生产和使用多氯联苯的工厂向环境中排放含PCBs的废水和倾倒含PCBs的废物。 三、危害

PCBs对环境的危害

最容易富集在海洋鱼类和贝类食品中。

三大類世紀之毒：多氯聯苯、含氯氧化聯苯（如戴奧辛/二噁英 ）、有機氯殺蟲劑（如DDT）

对人体：致癌性、生殖毒性、神经毒性、干扰内分泌系统 四、多氯联苯的检测方法

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 颁布：GB/T 24165-2009 采用气相色谱-质谱法(GC-MS)或气相色谱法-电子捕获检测器(GC-ECD)对商品染料、染料制品、染料中间体和纺织印染助剂中多氯联苯的测定。

国家环境保护局 颁布： GB 13015-91废物中多氯联苯（PCB）的测定：多氯联苯的物理化学性质与有机氯农药相似，在气相色谱测定时互相干扰，因此，采用气相色谱法定量，薄层色谱法进行确证试验。 原理

多氯联苯具有高度的脂溶性,用有机溶剂萃取时,同时提取多氯联苯和有机氯农药,经色谱分离之后,可用带电子捕获检测器的气相色谱仪分析。 第三节 多环芳烃化合物的危害分析与检测方法

1、多环芳烃(PAHs)是指由两个以上苯环连在一起组成的一类化合物。 苯并（a）芘

2、性质：常见的多环芳烃类大多由4~7个苯环组成。三环以上的多环芳烃一般为无色或淡黄色结晶,个别颜色较深;熔点和沸点较高,蒸气压很小;多环芳烃溶液具有一定荧光;在光和氧的作用下可很快分解变质,理化性质随之发生改变,致癌力也明显下降。 3、由于脂溶性，容易快速进入体内。含脂肪的组织器官都有分布。在肾脏、肝脏、脂肪组织分布较多，脾脏、肾上腺和卵巢有少量

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分布。通过尿和粪便排出。 4、主要来源

多环芳烃化合物主要由各种有机物，如煤，汽油，香烟等不完全燃烧而来。 5、危害

① 急性毒性：中等或低毒性

② 遗传毒性：PAH大多数具有遗传毒性或可疑遗传毒性（通过胎盘屏障使子代出现癌症） ③ 致癌性：其中26个PAH具有致癌或可疑致癌性——最确定的苯并（a）芘可致胃癌

可能与人的肺癌、胃癌、肠癌、膀胱癌、皮肤癌关系较为密切。 ④ 致畸作用：胚胎畸形、死胎、流产

⑤ 致突变作用：间接致突变物，需经肝脏微粒体混合功能氧化酶S9活化后，才具有致突变作用。

二、多环芳烃的测定

GB 18054-2000 居住区大气中苯并[a]芘卫生标准 （一）空气中苯并[a]芘的测定(高效液相色谱法)

原理：空气中颗粒物中的多环芳烃被采集在玻璃纤维滤纸上,经索氏提取或真空升华后,用高效液相色谱分离测定,以保留时间定性,峰高或峰面积定量。 GB/T 5009.27-2003 食品中苯并(a)芘的测定

(二)食品中苯并 [a] 芘的测定——纸层析、荧光分光光度法

原理：样品先用有机溶剂提取,或经皂化后提取,再将提取液经液-液萃取或色谱柱净化,然后在乙酰化滤纸上分离苯并[a]芘,因苯并[a]芘在紫外光照射下呈蓝紫色荧光斑点,将分离后有苯并[a]芘的滤纸部分剪下,用溶剂浸出后,用荧光分光光度计测荧光强度与标准比较定量。 第四节 β-兴奋剂的危害分析与检测方法

β-兴奋剂是一组选择性β2-肾上腺素受体激动剂,因能与动物机体内绝大多数组织细胞膜上的β受体结合而得名。其化学成分为苯乙醇胺类衍生物 β-兴奋剂中最常用为克仑特罗(俗称“瘦肉精”)和沙丁胺醇。

1、由于克仑特罗具有蛋白同化作用,且与合成代谢类固醇激素不同之处在于其具有更高的选择性,可以减少脂肪的

形成,提高瘦肉/脂肪的比率,因而被滥用于肉禽饲养业,造成该药在肉禽体内蓄积,尤其是肝脏组织中的浓度较高。 2、危害

食用后会引起人体心血管和中枢神经系统的毒副作用。

动物一旦饲用含β-兴奋剂的饲料,便会大量蓄积体内,滞留时间较长,而且一般烹饪过程很难使其失活、清除,给消费者带来了残留的危害。

人类食用含有克仑特罗的肉后会出现头晕、心悸、手指震颤等中毒症状,还可引起糖尿病人发生酮中毒或酸中毒

? 毛发中黑色素能和克仑特罗牢固结合,残留量高、持续时间长,因此动物的毛发作为

样本比较理想。克仑特罗在鱼中消除期要比陆栖动物来得长。

二、样品处理 1、样品预处理——β-兴奋剂残留分析中,样品前处理(采集和制备)过程占据整个分析时间的80%,是决定其分析效率的关键因素。

β-兴奋剂残留检测的生物样品主要是动物的尿、血液、毛发、视网膜和组织(肌肉、肺脏、肝脏等)。

动物的毛发和尿液作为样本比较理想:①采集方便;② 药物浓度高,如毛发中黑色素能和β-

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兴奋剂牢固结合,残留量高、持续时间长。

样品匀浆过程欲考虑是否会引起被测物含量的变化。

对于像克仑特罗等一些兴奋剂,由于它们在苯环上不含羟基或烷羟基,不会出现磺基化和葡糖苷酸化的结合物,因此可省去酶解过程。

样品去蛋白一般采用酶法和酸沉淀法,或两者结合。 三、国标

? GB/T 5009.192-2003 动物性食品中克伦特罗残留量的测定 （国家标准，3种方法：

气相-质谱、液相、ELISA）

? SN/T 1116-2002 进出口饲料中克伦特罗、沙丁胺醇残留量的检验方法 液相色谱法

（出入境检验检疫行业标准）

? SN/T 1924-2007 进出口动物源性食品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他

林残留量的检测 液相色谱-质谱/质谱法 （出入境检验检疫行业标准）

? NY/T 468-2006 动物组织中盐酸克伦特罗的测定 气相色谱-质谱法 （农业行业标

准）

? 农业部1025号公告-16-2008 动物尿液中盐酸克仑特罗残留检测 气相色谱-质谱法 第五节 亚硝酸盐、N-亚硝基化合物的危害分析与残留量的检测方法 1、污染来源

蔬菜种植时施用氮肥、作为食品防腐剂,一些不法商贩恶意将富含硝酸盐和亚硝酸盐的劣质盐、工业盐充作食用盐销售 2、毒性与危害

（1）亚硝酸盐属中等毒性物质。人中毒剂量为0.3~0.5g,致死量为3g。亚硝酸盐可干扰碘的代谢,造成甲状腺肿大,可影响血液中氧的运输而发生肠原性青紫症,长时间摄入也可破坏体内的维生素A,并可影响胡萝卜素转化为维生素A。亞硝酸胺正是一種強烈且普遍存在的致癌物質

（2）硝酸盐的危害：硝酸盐对人体健康的损害不亚于农药。因为硝酸盐不仅容易诱发糖尿病，对肾脏造成的损害也十分严重（溶血性贫血）。硝酸盐在酶和细菌的作用下，被还原成亚硝酸盐，进而与人体内的蛋白质类物质结合，生成致癌性极强的亚硝酸胺类物质。 3、GB 5009.33-2010 食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定 第一法 离子色谱法

试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，采用相应的方法提取和净化，以氢氧化钾溶液为淋洗液，阴离子交换柱分离，电导检测器检测。以保留时间定性，外标法定量。 第二法 分光光度法

亚硝酸盐采用盐酸萘乙二胺法测定，硝酸盐采用镉柱还原法测定。试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，外标法测得亚硝酸盐含量。采用镉柱将硝酸盐还原成亚硝酸盐，测得亚硝酸盐总量，由此总量减去亚硝酸盐含量，即得试样中硝酸盐含量。 第三法 乳及乳制品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定

试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，用镀铜镉粒使部分滤液中的硝酸盐还原为亚硝酸盐。在滤液和已还原的滤液中，加入磺胺和N-1-萘基-乙二胺二盐酸盐，使其显粉红色，然后用分光光度计在538 nm 波长下测其吸光度。 亚硝酸盐的检测

离子色谱法；分光光度法；格里斯试剂比色法（盐酸萘乙二胺法 ）；示波极谱法（已淘汰）

N-亚硝基化合物

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? N-亚硝酰胺是终末致癌物。

? 亚硝胺对人和动物的急性毒作用主要在肝脏,可引起肝小叶中心性出血坏死; ? 此外,还可引起肺出血,N-亚硝基化合物是一类很强的致癌物质 GBT5009.26-2003 食品中N-亚硝胺类的测定 第一法：气相色谱-热能分析仪法 第二法：气相色谱-质谱仪法

第六节 杂环胺的危害分析与检测方法（了解） 一、毒性与危害 (一)毒性

杂环胺属于前致突变物(或致癌物)。杂环胺只有被机体吸收,经过一系列代谢活化后,才具有致癌和致突变作用。通过消化道进入机体的杂环胺能很快被吸收,并随血液分布到身体的大部分组织。主要在肝脏代谢。

1. 遗传毒性：表现为诱发基因突变、染色体畸变、姐妹染色单体交换、DNA链断裂和程序外DNA合成等。

2. 致癌性：其致癌的主要靶器官也是肝脏,同时还可诱发其他组织器官的肿瘤。 3. 心肌毒性

(二)对人体健康的危害——结肠癌和直肠癌 二、食品中杂环胺的检测

? 食品中杂环胺结构鉴定主要依靠质谱和核磁共振法。

定量分析方法：液相色谱-质谱法、气相色谱-质谱法、固相萃取-HPLC方法、单克隆抗体免疫测定法

第七节 食品添加剂的危害分析与检测方法——三聚氰胺

食品添加剂是指为了改善食品品质和色、香、味,以及为防腐和加工工艺的需要而加入食品的化学合成或天然物质。食品添加剂只有达到一定浓度或剂量水平，才显示出毒害作用。 一、危害

①急性和慢性中毒②引起变态反应③致癌作用 三聚氰胺

? GB/T 22388-2008 原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法

? 本标准规定了原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的三种测定方法，即高效液

相色谱法（HPLC)、液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）和气相色谱-质谱联用法（GC-MS）

? GB/T 22400-2008 原料乳中三聚氰胺快速检测 液相色谱法 ? 本标准适用于原料乳，也适用于不含添加物的液态乳制品。

? GB/T 22288-2008 植物源产品中三聚氰胺、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸的测定 气相色谱-质谱法

? 本标准适用于小麦粉、玉米粉、大米粉中三聚氰胺、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二

酰胺和三聚氰酸含量的测定

第一法 高效液相色谱法（HPLC）

原理：试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱测定，外标法定量。

第二法 液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）

原理：试样用三氯乙酸溶液提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用液相色谱-质谱/质谱法测定和确证，外标法定量。

第三法 气相色谱-质谱联用法（GC-MS和GC-MS/MS）

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原理：试样经超声提取、固相萃取净化后，进行硅烷化衍生，衍生产物采用选择离子监测质谱扫描模式（SIM）或多反应监测质谱扫描模式（MRM），用化合物的保留时间和质谱碎片的丰度比定性，外标法定量。

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