核酸提取对临床荧光PCR检测质量的影响
更新时间:2024-01-15 07:50:01 阅读量: 教育文库 文档下载
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核酸提取对临床荧光PCR检测质量的影响因素
中国人民解放军第302医院 王海滨
一、临床分子生物学检验面临的问题与挑战
(一)国家药监局审评中心新行规:核酸提取是关键! 1. HBV DNA 敏感性报告 <30IU/ML ,防止实验室污染问题! 2. 标本加样量不少于 200 微升;干扰与敏感性的矛盾! 3. 核酸加样量不少于 20 微升、反应体积不少于 40 微升! 4. 磁珠法应用的挑战!血站核酸筛查? 5. 定量内标漂移对结果的影响
6. 试剂盒考核:增加抗污染和敏感性能评价指标! (二)不同核酸提取方法对检测质量的影响
影响核酸提取的因素有很多,以磁珠法、层析柱法、碱性裂解法及生物合成材料进行比较。 标本: 200 微升血清
方法:磁珠法:市场销售试剂盒,介质为胍盐、乙醇; 层析柱法:市场销售试剂盒,介质为胍盐、乙醇; 碱性裂解法: PEG 介导; 生物合成材料:无胍、无醇。
PCR 扩增:取等体积提取核酸或磁珠悬液( 10 微升),同一 PCR 扩增液。
我们采用四种方法材料进行同一样本核酸提取,然后采用统一试剂对相同提取核酸进行 PCR 扩增,结果差别非常大,磁珠法和层析柱法基本差不多,层析柱法稍微滞后于磁珠法,碱性裂解法最差,而且 100IU 无结果。复合材料的敏感性,是磁珠法或层析柱法的 30 倍左右。
过去,我们对荧光 PCR 试剂或分子生物学试剂,往往关注扩增部分,而把提取部分忽视了,现在来看,提取部分也非常重要。 二、临床实验室核酸制备方法分类 (一)临床实验室核酸制备基本方法 基本的方法有四种: 1. 煮沸法
最常用的是 PEG 聚乙二醇 6000 ,血清和提取液混匀,之后使病毒沉淀,离心,然后对沉淀物进行高热电解试验。 有文章提出,弃掉的上清含有的病毒更多。 2. 一管法
血清加到微量的裂解液里面混匀,试液配好以后,加进去就可以了。目前市场上有几家公司都用该检测方法。从临床检验的角度来说,一管法略微简略。但是敏感性,已经达到了 100IU ,而且其稳定性非常好。不用煮沸,或者经过简单的煮沸。虽然目前药监局审评中心,不提倡用一管法,但是一管法的稳定性,抗污染性,简易程度,实际上优于磁珠的方法。因为磁珠非常小,而且在乙醇下,非常容易挥发,易导致实验室的污染,
3. 层析柱法
层析柱法优于磁珠法,没有发生漂浮的情况,虽然也可以导致污染,但污染源限于液体,即使用试剂中的污染物 。比如普通的筛查,建议大家用一管法来做,毕竟经济、简便、快速等,敏感性达到 100IU ,也能满足临床的需要。
(二)磁珠或层析柱胍盐提取核酸多步骤的弊端
乙醇在核酸提取中的利与弊的关系,由于乙醇容易蒸发,在磁珠里面的乙醇容易挥发造成污染。大家不妨做一个试验,在乙醇里面加上磁珠,放在玻片上,在显微镜下看一看,可以看到在乙醇里面的磁珠就像巨峰一样,波涛汹涌。在玻片边缘的磁珠,随着乙醇蒸发而迸溅。所以,很容易发生交叉污染,而且非常严重。磁珠和层析柱方法关联的次序,有病毒裂解,然后核酸吸附,还有漂洗,最后是洗脱。目前诊断试剂 HBVDNA , HCVRNA , HIVRNA 等,第一个过程是病毒裂解以后,把磁珠收集了,然后漂洗、洗脱。
(三)层析柱法核酸丢失 1. 过滤核酸丢失
PPT6 显示的是过滤液再过柱 5 次取得核酸,第一次过滤的液体,为 1 虑,再过滤一次,为 2 虑,然后反复一直到 5 虑。图中是高含量、中含量与低含量,低含量是 100IU 左右,也就是说,滤下来的东西再过滤,还有核酸被收集到的,这就是核酸的丢失。
PPT7 显示的滤过液再进行核酸提取 5 次数据,通过计算发现,丢失率为 60% 以上。
PPT8 显示的是 5 次过滤丢失的曲线图,过滤液中存在核酸的丢失,不同浓度标本的核酸的丢失差异较大。 2. 洗脱核酸丢失
PPT9 显示的是层析柱反复洗脱核酸的丢失,进行了七次洗涤。结果发现第一次洗脱核酸量较高, 2 洗到 7 洗,核酸含量基本上差不多,这也是丢失的环节。
PPT10 显示的是层析柱反复洗脱核酸数据。
PPT11 显示的是 7 次洗脱核酸丢失率的图,不同浓度标本中层析柱上的残留核酸,差异也较大。
PPT12 显示的是高浓度标本反复洗脱得到的 PCR 曲线和 Ct 值,进行了 17 次洗脱,可以看到,从第九次或者第八次以后,基本上在 18 、 19 左右徘徊,即最后会达到一个平台,说明层析柱粘附的核酸量非常多。
PPT13 显示的是 洗脱液加热对照得到的 Ct 值, 可以看到,加热洗脱,核酸洗脱下来的量明显升高。 (四) PEG 提取法核酸丢失情况
PPT14 显示的是 PEG 提取法核酸的丢失, PEG 和血清或血浆混匀以后,沉淀的上层还含有大量的病毒。 PEG 存在很多的问题,沉淀很难再混匀,故每次检测结果可能明显的不同,这也是 PEG 的方法最后被取消的原因之一。
(五)血清标本 干扰物质 对荧光 PCR 检测的影响
PPT15 显示了干扰物质的罗列,分为溶血组、脂血组、黄疸组,及对照组。可以看到,这三种方法是可比的。干扰最大的是黄疸组,但是这几个方法的比较呢,实际上没有质的差异。
PPT16 显示的是两个一管法的比较,可以看到,一管法 1 有一个特点:干扰物质的影响不大。但是一管法 2 干扰物引起波动。
由于一管法 1 中的蛋白做了消融,一管法 2 在室温混匀以后,直接加反应液,故有差异。因此在临床上,更为主张采用一管法 1 ,也就是做温处理,使里面的干扰物质清除。
(六)不同核酸吸附材料(磁珠)
PPT17 显示的是不同核酸吸附材料的影响,实验中用了两种不同的裂解液与两种不同的磁珠: 1. 磁珠 1
不同裂解液比较发现,高中低拷贝的标本都一样。 2. 磁珠 2
不同裂解液比较发现,高中低拷贝的标本明显不同。 说明磁珠的材料对检测结果的影响很大。 (七)同一试剂,不同核酸提取方法
不同的提取方法,核酸的丢失也不一样。提取样本量与核酸得率的关系,是 1 + 1 ≠ 2 现象,即加入的血清量,并不是越多越好,比如加 100 微升或 50 微升的血清,并不是加 100 微升血清核酸提取得率,一定是加 50 微升血清的一倍。实际上有时血清加的越多可能干扰物质越多,这要通过不同的实验进行验证。 对 100 μ l 高中低含量 HBV DNA 血清采用 COBAS TaqMan 、罗氏 Meg 2.0 核酸提取仪和本实验室建立的磁珠法进行核酸提取,同时采用同一试剂进行定量。 试验发现有的核酸提取方法,核酸丢失率非常大。
三、核酸提取的交叉污染 (一)仪器核酸提取的交叉污染
PPT19 显示的是核酸提取仪,这种仪器有很多种,国产的、台湾的、进口的。它们几乎都有一个共同的特点:交叉污染。虽然好多厂家都做了相应的调整,但到目前为止,没有完全不污染的。
PPT20 显示的仪器是 MegNA Pure 2.0(Roche) 。 PPT21 是全自动的核酸提取和扩增系统。
PPT22 显示的是核酸提取仪核酸污染情况,这是最早的数据,交叉污染的实验设计:某核酸提取仪 10 9 与阴性对照间隔进行核酸提取并检测。连续做了八个阳性和八个阴性对照,发现有四个对照发生了交叉污染,污染率很高。
(二)实验室污染的监控
实验室污染的监控,是荧光实验室或分子生物学实验室的重中之重,分为试剂污染、环境污染、核酸提取污染,而且污染曲线有一定的特征。 (三)几种防污染措施的效果评价
污染是目前临床分子生物学实验室比较头疼的问题,也是实验室真正的水平的体现。防污染的措施有很多,最有效的是实验室的通风。 抗污染有效性实验: 1. 紫外线照射
对扩增产物有一定的效果。 2. 有效氯处理
效果肯定!但要注意对荧光探针的淬灭! 3. 酒精擦拭
无效且容易导致污染物迁移。 4. 高压处理
容易导致交叉污染,并可引起器具变形(吸头、离心管)。
(四)污染的预防 1. 预防污染的常规工作
1 )严格的实验室分区与管理:物品单独使用的好处
2 )经常性实验室通风:能对流通风的重要性,封闭实验室的弊端。 3 )每周有效氯消毒液擦拭 :(84 消毒液,健之素等 ), 桌面、地面清洗
4 )每日清水擦拭实验用品:流水清洁的重要性,对实验用品如试管架、吸头盒、离心机内面等。 5 )移液器的处理:即时进行流水清洗,除非细菌培养实验无需高压和消毒。 2. 人员培训与管理
污染环节的认知 ( 按来源分类 ), 有效预防污染操作的实现,实验室新进人员的培训、考核与上岗。 3. 实验室生物废物的管理:
标本接触废物、试剂废物、扩增产物等。
核酸提取对临床荧光PCR检测质量的影响因素 试题及答案
--中国人民解放军第302医院 王海滨
1、层析柱法提取核酸的污染源来自(a )
A、试剂中的污染物
B、乙醇
C、空气中的污染物
D、仪器中的污染物
2、防核酸提取交叉污染的措施中,最有效的是(A )
A、实验室的通风
B、酒精擦拭
C、高压处理
D、清水擦拭
3、磁珠法提取核酸容易发生交叉污染的原因是( D)
A、核酸不容易洗脱
B、核酸易于挥发
C、核酸易于沉积至实验器具
D、磁珠里面的乙醇容易挥发造成污染
4、一管法的敏感性可以达到(C )
A、1000IU
B、10000IU
C、100IU
D、10IU
5、防核酸污染的措施中,有效的包括哪些(D )
A、实验室的通风
B、紫外线照射
C、有效氯处理
D、以上都是
6、防核酸污染的措施中,无效的是(D )
A、紫外线照射
B、有效氯处理
C、实验室的通风
D、酒精擦拭
7、不同核酸提取方法磁珠法、层析柱法、碱性裂解法及生物合成材料比较发现,敏感性最高的是( A)
A、复合材料
B、磁珠法
C、层析柱法
D、碱性裂解法
8、不同核酸提取方法磁珠法、层析柱法、碱性裂解法及生物合成材料比较发现,结果最差的是(A )
A、碱性裂解法
B、磁珠法
C、层析柱法
D、生物合成材料
9、一管法与磁珠法比较,稳定性、抗污染性、简易程度哪个较好( B)
A、磁珠法
B、一管法
C、两者合用
D、以上都不是
10、PEG提取核酸法被取消的原因是(D )
A、沉淀的上层还含有大量的病毒
B、沉淀很难再混匀
C、每次检测结果不同
D、以上都是
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