丝氨酸蛋白酶的相关研究

丝氨酸蛋白酶的相关研究

摘要：本文概述了丝氨酸蛋白酶的酶学基础，反应机制，该酶抑制剂的设计及其应用。丝氨酸蛋白酶是一个蛋白酶家族，它们的作用是断裂大分子蛋白质中的肽键，使之成为小分子蛋白质。其激活是通过活性中心一组氨基酸残基变化实现的，它们之中一定有一个是丝氨酸（其名字的由来）。在哺乳类动物里面，丝氨酸蛋白酶扮演着很重要的角色，特别是在消化，凝血和补体系统方面。正是由于该酶的特殊性质，使其在众多领域都有所应用。

关键字：丝氨酸蛋白酶；酶学基础；反应机制；应用

Abstract：This article provides an overview of the serine protease enzyme, reaction mechanism, the design and application of enzyme inhibitors. Serine protease is a protease family, their roles are to break large protein molecules in the peptide bond, to become small molecular protein. Its activation is through the active center of a group of amino acid residues change, they must have a serine (the origin of the name). In mammal animal, serine proteases play a very important role, especially in the digestion, Coagulation and complement systems. Because of the special nature of the enzyme, and it has been applied in many fields.

Keywords: Serine protease; fundamentals of enzymology; reaction mechanism; application

绪论

丝氨酸蛋白酶是一类以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶，在生物有机体中起着重要的广泛的生理作用[1]。它们的作用是断裂大分子蛋白质中的肽键，使之成为小分子蛋白质。通过对蛋白酶原的激活或抑制而起调节因子作用，丝氨酸蛋白酶还在胚胎发育、组织重建，细胞分化，血管形成和病原侵入等过程中都发挥着重要的作用，特别是在消化，凝血和补体系统方面[2-3]。此类蛋白酶的催化基团包括1个不可缺少的Ser残基，DIFP是它们的不可逆抑制剂。 1 丝氨酸蛋白酶学基础

1.1 丝氨酸蛋白酶的分类及作用原理 1.1.1 消化酶

由胰脏分泌的，其中里面有三种是丝氨酸蛋白酶。 ⑴ 糜蛋白酶

又称为胰凝乳蛋白酶，水解酶类的一种肽链内切酶，主要促使疏水性氨基酸尤其是酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸及亮氨酸的羧基端多肽裂解。 ⑵ 胰蛋白酶

属水解酶类，促使肽链分裂，作用部位为精氨酸或赖氨酸羧基；此酶以酶原形式由胰释出，在小肠中转化为活性形式。 ⑶ 弹性蛋白酶

弹性蛋白酶（EC 3.4.21.36.），水解酶类的一种，对丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸等含羧基的多肽键起催化水解的作用，因曾认为此酶主要作用于弹性蛋白而有此命名。它是胰以酶原(弹性蛋白酶原)形式分泌的一种丝氨酸蛋白酶，参与肠内蛋白消化。

这三种酶的一级结构（氨基酸序列）和三级序列（所有原子的空间排布）相似。它们的活性丝氨酸残基都是在同一位置(Ser-195)。 1.1.2 凝血因子

几种激活的凝血因子都是丝氨酸蛋白酶。 ⑴ 凝血第十因子(X)

也称Stuart-Power因子，参于内源性和外源性凝血途径的一种耐贮存因子。缺乏可致系统性凝血障碍(第十因子缺乏症)。 ⑵ 凝血第十一因子(XI)

即是血浆凝血酶活酶前质：作用于内源性凝血途径的一种稳定因子。缺乏这种因子会引起系统性血凝缺陷，即C型血友病或Rosenthal综合征，与典型血友病相似。 ⑶ 凝血酶

来自凝血酶原，可促使纤维蛋白原变为纤维蛋白的酶；纤维蛋白溶酶是溶解纤维蛋白或血凝块系统的有效部分，是对纤维蛋白有高度特异性的蛋白分解酶，对已经形成的纤维蛋白凝块有特别的溶解力，对其他血浆蛋白、凝固因子和一般蛋白质也有类似作用。 1.1.3 补体系统

补体系统里面有几种蛋白质属于丝氨酸蛋白酶。包括：C1r 和 C1s。C3转化酶裂解补体成分C3为C3a和C3b的酶；经典途径C3转化酶是C4b，2b；旁路C3转化酶是C3b，Bb和C3b，Bb。

1.1.4 作用原理

通过邻近的氨基酸残基链，丝氨酸残基在活性中心被激活。被激活的羟基与肽键的碳原子发生亲核反应，肽键断裂后，酰基上的碳被酯化，肽键的氮端会被释放游离。水解反应，与酶相连的碳端产物被释放。 1.2 丝氨酸蛋白酶的结构与功能

1.2.1 丝氨酸蛋白质的结构

这类蛋白酶以一个特定的Ser残基作为必需的催化基团，属于该家族成员的有胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、激肽释放酶原、凝血酶、纤溶酶和组织型纤溶酶原激活剂。

丝氨酸蛋白酶的催化机制属于共价催化和广义酸碱催化的混合体，由三个不变的氨基酸残基构成的催化三原体（Ser、His和Asp）起主导作用，这三个氨基酸残基任何一种突变或修饰（例如，Ser被DIPF修饰）均可导致酶活性的丧失。 1.2.2 丝氨酸蛋白酶的功能

虽然各种丝氨酸蛋白酶具有高度的同源性，但构成催化三元体的三个氨基酸残基在肽链中的位置并不完全相同。然而，酶学家已达成共识，将这三个氨基酸残基总是进行一样的编号，即His57、Asp102和Ser195.它们的催化中的具体功能是： ① Ser195充当进攻底物的亲核基团； ② His57作为广义的酸碱催化剂；

③ Asp102的功能仅仅是定向His57，影响His的pKa，改变其酸碱性质。 ⑴ 胰蛋白酶

胰蛋白酶具有很深的底物结合口袋，而口袋的底部又是Asp。特别适合长的碱性氨基酸侧链（Lys和Arg）的结合。

⑵ 糜蛋白酶

糜蛋白酶的底物结合口袋没有胰蛋白酶深，但比它宽，而且口袋壁分布的是疏水氨基酸，所以特别适合芳香族氨基酸的结合。

⑶ 弹性蛋白酶

弹性蛋白酶的底物结合口袋非常浅，最适合结合侧链较小的氨基酸残基。

2 丝氨酸酶反应机制实例[4]

2.1 动力学研究（以胰凝乳蛋白酶为例）

凝乳蛋白酶在体外可以水解具有酯键和酰胺键的小分子化合物，但专一性较低。这一特点在生理条件下是不重要的，但在体外动力学机制研究时很有意义。Brian以对硝基苯乙酯作为胰凝乳蛋白酶的底物，反应呈两相进行。

（1）“快速释放”相（Burst Phase）是在很短的时间内，每摩尔酶释放出等摩尔的对硝基酚。 （2）稳定相（Steady State Phase）是反应速度降低，进入线性阶段。

这种现象解释为整个反应分两个过程：①迅速释放对硝基酚，酶本身被乙酰化；②乙酰化酶缓慢水解，释放乙酸。 2.2 中间物检测

胰凝乳蛋白酶催化酯的水解分酰化和脱酰两个过程。脱酰反应与溶液的pH值密切相关。当pH值足够低时，脱酰反应十分缓慢，甚至可分离到酰化酶中间物。实验结果显示酰化反应发生在Ser195侧链上。

当酶水解酰胺底物时，脱酰反应速度远高于乙酰化过程，故酰化酶中间物不会“堆积”，即不可能直接收集，只能由实验间接地“捕捉”（Trapping）。如，酶促水解过程中加入高浓度的丙氨酰胺或羟胺类亲核剂与水分子竞争酰化酶。

以酯为底物时，可直接得到乙酰酶中间物，并可测出两种产物的比值。当以酰胺为底物时，加入相同浓度的亲核试剂，可观察到同样产物的比值，因此推测酰胺水解过程中也存在酰化酶中间物。 2.3 鉴定必需基团

为了鉴别胰凝乳蛋白酶分子上的必需基团，曾做过大量的研究工作。这儿介绍一些经X射线研究证实有功能的侧链修饰实验。 2.3.1 Ser195

用二异丙基磷酸（DFP或DIPE）进行修饰，酶被不可逆失活，除了Ser195外，酶分子上其余的Ser侧链都未参与修饰反应。

DIPE修饰酶起源于人们发现有机磷化合物为强的神经毒剂。DIPE可使乙酰胆碱酯酶失活，乙酰胆碱酯酶为催化胆碱水解的丝氨酸酯酶，该酶失活将阻碍神经冲动。Ser还可以用苯甲烷碘酰氟进行修饰。 2.3.2 His57

一些成功的亲核标记实验，证明了His57与酶催化活性有关。对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）和底物对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰甲酯（TPME）结构相似。TPCK可使酶失活，并存在着化学计量关系，修饰部位为His57。但TPCK不能使胰蛋白酶失活，这说明两种酶底物结合口袋不同。相反，对甲苯磺酰-L-赖氨酰甲酮（TLCK）可使胰蛋白酶失活，但不作用于胰凝乳蛋白酶。TLCK与胰蛋白酶的底物对甲苯磺酰-L-赖氨酰甲酯（TLME）结构非常相似，这两种试剂在蛋白质顺序研究中应用较多，如制备胰凝乳蛋白酶时用TLCK处理酶以防有胰蛋白酶污染，反之亦然。 2.3.3 Ile16

化学修饰实验还证明看胰凝乳蛋白酶上Ile16的а-氨基具有重要的功能。在通常情况下，要选择性地修饰这一氨基十分困难，双标记（Double Labelling）实验可以解决这一问题。胰凝乳蛋白酶原首先与酸酐（Ac2O）反应，使分子上所有的а-和ε-氨基乙酰化，然后用胰蛋白酶作用产生完全有活性的δ-胰凝乳蛋白酶，其中Ile16具有自由的氨基，再与14C标记的酸酐作用，发现酶失活与掺入Ile16的а-氨基的同位素量成正比，证明了酶活性中这一集团的总要性。 2.3.4 Asp102

专一性化学修饰Asp较为困难，因而采用了定点突变技术直接验证该侧链的功能，将

Asp102换成Asn，胰蛋白酶突变体D102N

动力学分析表明Km不变，但Kcat为天然酶的0.05%，中子扩散技术和X射线衍射法研究都认为Asp102以离子化形式存在，而不是从咪唑环上吸取一个质子成为质子化的形式。 2.4 X射线结构研究

牛胰凝乳蛋白酶、牛胰蛋白酶、猪弹性蛋白酶之间氨基酸序列表现出严格的同源性，大约40%的一级结构为保守结构，与催化功能有关的基团非常详实，X射线研究表现三者之间的三维结构也高度相似，胰凝乳蛋白酶的立体结构。分子形状呈椭圆形，最长处距离5.1nm。三条肽链由5个二硫键维系，α-螺旋结构很少，只有两部分，分别位于163-173及235-245残基之间，大部分为反平行的β-折叠片，主要集中在27-112及133-230残基之间。X射线研究发现在猪胰腺凝乳蛋白酶的空间结构中，主要也是由反平行的β-折叠片和少量的螺旋结构组成。尤其需要注意的是牛胰腺凝乳蛋白酶中一些荷电氨基酸，如Asp102、Ile16、Asp194深埋在分子内部，一般非极性氨基酸侧链往往位于分子内部，远离水分子，而极性氨基酸多处于分子表面。如果有例外，这一氨基酸必有特殊作用，说明这些氨基酸侧链对酶的活性有重要贡献。

虽然这三种酶严格同源，但它们作用底物的专一性不同，这与它们底物结合部位的差异有关。

胰凝乳蛋白酶的结合部位为一非极性的口袋，因而喜欢作用具有芳香性或体积较大的疏水性侧链；胰蛋白酶结合部位中Asp189替代Ser189，所以它偏爱带正电荷侧链的底物；弹性蛋白酶结合口袋中Val和Thr分别代替了2个Gly，其他部分与胰凝乳蛋白酶相同，故大体积的底物分子难以进入口袋，偏爱作用于体积较小的疏水侧链，其专一性较宽，可作用Ala、Gly、Val等，并由此而得名。相反，胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶因结合部位不能很好地固定这些小的氨基酸侧链，因而水解具有这些氨基酸残基的肽链速度很慢。

胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶。弹性蛋白酶氨基酸顺序和空间结构的相关性，说明它们在进化上有密切关系，推测可能来自共同的祖先。通过基因突变，出现性能上某些差异而发生趋异进化。另两个来自细菌的丝氨酸酶可以进一步说明丝氨酸蛋白酶家族进化上的关系。Stroptomyces griseus 蛋白酶A（SGPA）是具有胰凝乳蛋白酶专一性的（Chymotryptic Specibicity）丝氨酸蛋白酶。X射线研究表明，该酶与胰脏的丝氨酸蛋白酶比较，保守顺序小于20%，但空间结构极其相似。枯草杆菌蛋白酶（最初从Bacillus subtilus 分离得到）与胰凝乳蛋白酶相比，它们的一级结构和空间结构似乎没有区别，但活性部位的基团基本相同，相应的三级结构的位置也几乎没有区别，但活性部位的氨基酸残基的顺序则大不相同，这是一个趋同进化的典型实例。

此外，学液凝固中的凝血酶也是丝氨酸蛋白酶，其以及结构和三级结构与哺乳动物胰脏来源的酶区别较大，但其活性部位的结构及作用机制却非常相似。上述的实例表明，丝氨酸蛋白酶家族在进化上密切相关。 2.5 作用机制及其验证

2.5.1 丝氨酸蛋白酶的作用机制

丝氨酸蛋白酶的同源性表明它们具有相同的催化机制。基于大量的化学和架构资料的分析，人们描绘了丝氨酸蛋白酶的催化机制，现以胰凝乳蛋白酶为例介绍如下。 A.四面体中间物形成

在胰凝乳蛋白酶活性中心的氨基酸侧链中，当酶与底物结合时，形成米氏复合物，Ser195亲核攻击羟基形成四面体中间物（共价催化）。

X射线分析认为Ser195处于不利的位置（邻近和定向效应），是一个有效的亲核攻击基团。His57吸收释放的质子，起广义碱的作用，这一过程为Asp102加强。极化的Asp102与His57的氢发生静电相互作用（静电催化），酶的催化即从形成短暂的四面体结构开始。

B.形成乙酰化酶中间物

四面体结构在His57N（3）质子供体作用下（酸碱催化）分解，形成酰化酶中间物，R′NH2从酶分子上释放并由溶剂H2O替代。这一过程极不稳定，但人们还是分离得到了弹性蛋白酶的酰化酶中间物（-55℃条件下），并进行了X射线结构的研究。 C.脱酰过程

脱酰反应是酰化反应的逆过程，释放生产物羧酸，酶得以再生。在这一过程中，H2O为亲核试剂。

2.5.2 丝氨酸蛋白酶作用机制验证

上述胰凝乳蛋白酶作用模型经很多实验证明是合理的。下面列举一些成功的实验证据。 A.四面体中间物存在的实验依据

Robert Huber 对胰酶和牛胰蛋白酶抑制剂（BPTI）复合物的X射线研究结果是四面体中间物存在的有力证明。BPTI是具有58个氨基酸残基的蛋白质，与胰蛋白酶结合时，因形成复杂的氢键网络而使酶失活。这个复合物的结合常数高达1013（mol/L）-1，是已知的蛋白质之间最强的相互作用。

B.丝氨酸蛋白酶优先于过渡态底物结合

一些丝氨酸蛋白酶与抑制剂结合的复合物，它们的结构经X射线仔细研究、比较，使人们搞清了这些酶作用的结构基础。

(1) 随着四面体中间物形成而产生的构象变化导致了被水解肽键的羰基氧更加靠近活性中心部位，以利于占据称为氧阴离子洞的（Oxyaninon Hole）空穴。

(2) 在此空穴中，酶与羰基氧形成两个氢键，而在正常的结构中不存在这种氢键。

(3) 四面体形变结果，使在水解肽键前，酶与胎骨架上—NH—形成近似氢键，因而酶容易同四面体中间物结合。

这些现象解释了丝氨酸蛋白酶的高催化效率。事实上，由于DIPF四面体结构是过渡态类似物，因而是丝氨酸蛋白酶有效的抑制剂。 C.催化三元组的功能

早期的文献认为Asp102极化了His57，使其直接从Ser195吸取质子，而使Ser195成为有效的亲核攻击试剂（羟基）。事实上，用对硝基苯磺酸甲酯处理胰凝乳蛋白酶，使His57专一性地甲基化，以阻断催化三元组的作用。

然而，产生的酶仍有较好的催化活性，比非酶催化的反应加速2×106倍（天然酶约1010倍）。很明显，催化三元组的功能很大程度上是作为质子供体和质子吸收器（酸碱催化），胰凝乳蛋白酶速度增加的主要因素恐怕主要来源于与反应的过渡态优先结合。 3 酶工程(酶的抑制剂设计)

丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serpin）是一类拥有超过500个成员的蛋白酶超家族，其三级结构高度保守，在食物消化、补体激活、血液凝固等生理过程中起重要作用。 3.1 体内凝血过程中丝氨酸蛋白酶抑制剂的作用

以凝血过程为例，正常生理条件下，由于存在体内凝血系统，伤口处血液流失可以很快被形成的血纤维蛋白凝块中止。但凝血系统异常会导致一系列疾病，如冠状动脉血栓的形成会导致心肌梗塞等。由于血液凝固的级联放大过程中凝血酶位于中心地位，其抑制剂的研究时早起抗血栓药研制的重点。肝素是常用的抗凝血药物，但有时会引起血小板减少和出血症。因此，人们把注意力转向研制凝血酶的抑制剂，但直接抑制凝血酶能再临床上导致出血并发症，尤其与抗血栓药物TPA等合用时后果更严重。此外，凝血酶的抑制剂并不能阻止循环系统中大量的凝血酶原转化为凝血酶。与传统药物肝素等相比，催化凝血酶原转化为凝血酶的活性Xa因子的抑制剂专一性高，副作用小，更为安全有效。

3.2 Xa因子的抑制剂

Xa因子是一种类似于胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶（a表示活化的意思，activatied），在钙离子和V因子存在下，Xa因子和凝血酶原复合物粘附到血小板的带负电荷的磷脂表面，随后凝血酶原被活化。Xa因子切割底物凝血酶原各种底物和抑制剂。天然存在的Xa因子抑制剂有墨西哥水蛭中提取的119个氨基酸组成的多肽ATS（Antistasin），60个氨基酸组成的壁蚤抗凝固胎TAP（Tick Anticoagulant Peptide）和水蛭唾液中提取的由133个氨基酸组成的多肽Yagin。这些抗血栓药物都已实现了DNA重组表达。 3.3 组合胎库法

人工设计的小分子抑制剂至少有几十多种，都死基于敏感键两端Gly-Arg（P2-P1）氨基酸的结构特征进行构建并加以优化合成了各种系列抑制剂。这种基于酶作用机理研究的药物设计是一种非常有效的方法，为了快速寻找和高通量的筛选新的小分子抑制剂，组合肽库是一种很好的方法。该方法的原理基于20世纪60年代提出的多肽固相合成法，以三个配体合成为例，用仅仅三个配体和三部反应就可产生27种化合物，每一种不需分离就可进行检测，一旦检测到有药物活性的“起始化合物”，就可用化学方法优化这种物质的结构，使其性质适合于药物。

通过筛选D-氨基酸、L-氨基酸、环状的D-氨基酸、L-氨基酸肽库，最后在L-氨基酸肽库中找到了Xa因子的多肽抑制剂，其N端的序列特征为L-Tyr/Phe-Ile-Arg，并对Xa因子的底物表现出竞争性抑制。对Xa因子具有抑制性的戊肽，简称SEL1691进行缺失研究发现，C末端去除1-3个残基对SEL1691抑制活性影响较小，但N末端去除Ala会灭火戊肽的抑制活性。一些非天然的氨基酸如吡啶丙氨酸，甲基苯磺酰甘氨酸等可以替代Tyr，Ile基本不可置换，但环己基甘氨酸替换Ile得到的SEL2316却使抑制活性提高了60倍。N末端分别对氨基苯丙氨酸和环己基甘氨酸形成的SEL2489活性不变，但半衰期较长，进一步用Arg的类似物甲基-吡啶-丙氨酸代替Arg得到的SEL2711稳定性更好。

化学和生物科学的迅速发展使传统的寻找药物的方法发生了根本性的变革，对于天然产物的筛选曾经是药物化学家关注的焦点。传统的样品筛选首先需分离纯化，测试所需的量也较大，而现在筛选多用生物学检测方法，不需要对混合物进行分离，只有测得有生物活性时才需要进行药物提取，且微量样品足以进行活性测定。传统的药物化学家一年可合成数百个样品供药物筛选，这些样品如今通过自动分析仪一天就可完成活性检测，这种快速筛选法反过来对于样品的提供带来了极大的压力。因此，类似于肽库合成的化学组合合成法可提供为数众多的样品供药物筛选，

由此可见，传统的药物设计方法与组合库的方法互为补充，将筛选到的新的化合物进行结构修饰、优化，现已成为药物研究的新的方向。 4 酶应用

随着酶的制备、酶和细胞固定化、酶分子改造、酶反应器等酶技术的不断发展，酶应用的范围亦在不断地扩大，主要是在医药、食品、纺织以及日用化学工业方面，另外在环境保护以及能源开发及生物工程、化学分析以及生物传感器等方面也有重要应用[5]。酶的应用是酶工程的重要内容之一。

丝氨酸蛋白酶在心血管疾病医治方面有广泛的应用。由纳豆芽孢杆菌产生的具有纤溶性的丝氨酸蛋白酶-纳豆激酶，可经口服直接作用于交联纤维蛋白，同时增加内源性纤溶酶的活性。从蚯蚓身上提取的蚯蚓纤溶酶具有直接溶解纤维蛋白的纤溶酶活性，又具有类尿激酶的纤溶酶原激活活性，因此既能溶解陈旧血栓又能抑制新血栓形成。蛇毒丝氨酸蛋白酶属于糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，大多数 能对凝血/纤溶系统起作用。TSV-PV是非常专一的蛇毒纤溶酶原激活剂，对生理性丝氨酸蛋白酶抑制剂有很强的耐受性。

丝氨酸蛋白酶在真菌基础性研究中也有应用。致病性真菌在体外或感染宿主过程中能够分泌内源性和外源性胞外蛋白酶，已引起广泛关注。利用菌株细胞芯片技术结合免疫组化方法可以检测各型新生隐球菌菌株细胞中丝氨酸蛋白酶的表达分布情况，横向对比丝氨酸蛋白酶在新生隐球菌致病过程中的作用。

丝氨酸蛋白酶作为一类重要的水解酶，人们对其结构、功能及重组表达的研究已经很深入，并且已经有不少种类的丝氨酸蛋白酶被应用到医药等领域。在这些研究成果的基础上，人们可以通过丝氨酸蛋白酶基因的克隆、重组、表达以及蛋白互作等方面的研究为丝氨酸蛋白酶的应用提供新的思路。

参考文献：

[1] 汪世华,王文勇,黄益洲,林琳,沙莉.丝氨酸蛋白酶研究进展[J].福建农业学报.2007,229(4):453-456. [2] 何智,陈政良.补体系统丝氨酸蛋白酶的结构与功能[J].国外医学免疫学分册,2004,27(6):316-319.

[3] MAXWELL.M.K. ENRICO. D C. Molecular Markers of serine Protease evolution [J].Embo Journal. 2001,20(12), 3036-3045.

[4] 袁勤生,赵健.酶与酶工程[M].华东理工大学出版社,2005:91-102. [5] 肖连东,张彩莹.酶工程[M].化学工业出版社,2008,191-192.

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