6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用

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第 6章

蛋白质的通性、 纯化和表征

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教学内容一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 三、蛋白质分离纯化的一般原则 四、蛋白质的分离纯化方法

五、蛋白质相对分子质量的测定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定

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一、蛋白质的酸碱性质

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蛋白质的等电点对某种蛋白质来说，在某一pH,它所带的正电荷与负电荷恰 好相等，也即净电荷为零，这一pH,蛋白质的等电点。 有中性盐时，蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离 子的组成。如Ca2+、Mg2+、Cl-、等可与蛋白质某些可解离 基团结合，影响等电点。 无盐类干扰时，蛋白质分子本身的质子供体基团解离出来 的质子数与它的质子受体基团结合的质子数相等时的溶液 pH称为等离子点(isoionic point,或称等离点)。等离子点是 每种蛋白质的一个特征常数。

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教学内容一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 三、蛋白质分离纯化的一般原则 四、蛋白质的分离纯化方法

五、蛋白质相对分子质量的测定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定

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二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀(一) 蛋白质胶体性质 (二) 蛋白质沉淀

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(一)蛋白质胶体性质分散相质点在胶体系统中保持稳定的3个条件: 分散相质点在1~l00 nm范围内, 在动力学上是稳定的, 介质分 子对这种质点碰撞的合力不等于零, 使它能在介质中作不断的 布朗运动; 分散相质点带有同种符号的净电荷,互相排斥,不易聚集成大颗 粒而沉淀; 分散相质点能与溶剂形成溶剂化层,例如与水形成水化层,质点 有了水化层,相互间不易靠拢而聚集.

蛋白质溶液,稳定的亲水胶体: 亲水基团与水发生水化作用； 某一pH下相同电荷。也有丁大尔现象、布朗运动以及不能透 过半透膜性质

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(二)蛋白质沉淀蛋白质溶液的稳定性与质点大小、电荷和水化作用有关, 影

响这些条件的因素都会影响蛋白质溶液的稳定性：加人脱水剂以除去它的水化层；改变溶液的pH达到蛋白质等电点使 质点的净电荷为零，蛋白质分子则聚集成大的颗粒而沉淀。

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沉淀蛋白质的方法有以下几种: 盐析法：中性盐(硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等),脱去水化层 而聚集沉淀，蛋白质不变性。 有机溶剂沉淀法：脱去水化层、降低介电常数增加异性电荷 间的相互作用，蛋白质变性。低温操作，且尽量缩短处理时 间则可使变性速度减慢。 重金属盐沉淀法：带负电荷时易与重金属离子结合成不溶性 盐而沉淀。可口服大量牛奶或豆浆等可解重金属盐中毒。 生物碱试剂和某些酸沉淀法：蛋白质带正电合适与之结合沉 淀。 加热变性沉淀法：加

热变性而凝固。少量盐类促进蛋白质加 热凝固

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教学内容一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 三、蛋白质分离纯化的一般原则 四、蛋白质的分离纯化方法

五、蛋白质相对分子质量的测定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定

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三、蛋白质分离纯化的一般原则蛋白质纯化测总目标：增加纯度或比活力 (1)前处理:

(2)粗分级分离:(3)细分级分离:

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(1)前处理: 动物材料剔除结缔组织、脂肪组织; 种子材料应先去壳 和种皮以免受单宁等物质的污染, 油料种子脱脂. 选择适当方法,破碎组织或细胞：动物组织(电动捣碎机 或匀浆器或超声); 植物组织(英砂或玻璃粉和适当的缓冲液研磨或用纤维素 酶); 细菌细胞(超声,与砂研磨或溶菌酶). 选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来. 如果蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合的, 用超声波 或去污剂使膜结构解聚, 用适当的介质提取。

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(2)粗分级分离: 常用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法，有时 可用超过滤或凝胶过滤等方法。 (3)细分级分离:

各种层析、电泳巧妙配合, 后期可 用结晶法。

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教学内容一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 三、蛋白质分离纯化的一般原则 四、蛋白质的分离纯化方法

五、蛋白质相对分子质量的测定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定

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四、蛋白质的分离纯化方法① ② ③ ④ ⑤ 根据分子大小不同 利用溶解度差别 根据电荷不同 利用选择性吸附 利用对配体的特异生物 学亲和力的纯化方法 (一) (二) (三) (四) (五) (六) (七) (八) 透析和超过滤 凝胶过滤 盐溶和盐析 有机溶剂分级分离法 凝胶电泳和等电聚焦 离子交换层析 亲和层析 高效液相层析

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(二)凝胶过滤凝胶过滤层析、大小排阻层析或凝胶渗透层析 常用凝胶：交联葡聚糖、聚丙烯酰 胺凝胶，琼脂糖(sepharose 或 Bio-Gel A); 凝胶网孔大小一定，只允许相应大 小的分子进入凝胶颗粒内部，大分 子则被排阻在外，即分级分离范围 或排阻极限; 大分子从颗粒间隙流下来，洗脱液 体积小。小分子在颗粒网状结构洗 脱历程长，后洗脱下来，洗脱体积 大； 用洗脱体积同标准分子量的蛋白质 的比例关系测定蛋白质分子量；

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几个要说明的问题 Vt: 柱床总体积，常称柱床体积； V0 :为孔隙体积或外水体积，测出不 被凝胶滞留的蓝色葡聚糖-2000的洗脱 体积即为V0; Vi :内水体积，凝胶珠内部的水相体积； Vm :为凝胶基质体积； Vt=V0+Vi+Vm Ve某一待分离物质组分的洗脱体积,自 加样品开始到该组分的洗脱峰(峰顶)出 现时所流出的体积；

V0

V t- V 0

Vt

各组分的流出顺序，可用分配系数Kd 来量度： Kd=(Ve-Vo)/Vi。

Kd:组分分子大小的函数； 完全排阻的大分子：Ve=V0,Kd=0; 完全进入凝胶珠的小分子： Ve=V0+Vi,Kd=1; 其他的：Kd在0和1之间; Kd大于1:凝胶对组分有吸附

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几个要说明的问题测得几种标准蛋白质的洗脱 体积 Ve 以相对分子质量对数 (logM) 对 Ve 作图，得标准 曲线，再测出未知样品洗脱 体积[Ve],从标准曲线上可 查出样品蛋白质的相对分子 质量.

V0

V t- V 0

Vt

Kd:组分分子大小的函数； 完全排阻的大分子：Ve=V0,Kd=0; 完全进入凝胶珠的小分子： Ve=V0+Vi,Kd=1; 其他的：Kd在0和1之间; Kd大于1:凝胶对组分有吸附

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(三)盐溶和盐析 盐溶：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐 浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶； 盐析:当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随 着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种 现象称为盐析; 同一浓度盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可 达到彼此分离的目的。 盐溶原理:蛋白质吸附某种盐离子后彼此排斥。 盐析原理：盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，水 化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚积并从 溶液中析出

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