液氮研磨提取组织RNA步骤

液氮研磨组织提取RNA步骤

一、试剂与耗材（RNA提取专用，无RNase）

75%的酒精（用无酶水配制），RNase Zap， Trizol(Invitrogen)，氯仿，异丙醇，无RNA酶水（Ambion）；研钵，研杵，1.5ml EP管，2.0ml EP管，15ml 管，50ml 管，棉纱布。 二、操作步骤

1) 用75%酒精对实验操作台、移液枪、枪头盒、管架进行消毒，然后再用RNase Zap擦拭上述材料。

2) 取出-80℃冰箱保存的组织块，放于用液氮预冷过的研钵中，敲碎一小块组织，其余放回冻存管。

3) 加入液氮，先轻轻敲碎组织到最小块，再研磨成粉末，直到看不到组织块。

4) 加入液氮使粉末凝聚成团，马上用药勺把粉末转移到2.0ml EP管中。

5) 待液氮挥发干后，加入1ml Trizol裂解液，用1ml移液器将细胞吹散开，保证细胞裂解充分，必要时可借助水平振荡器混匀。 6) 4℃离心机12000rpm离心5分钟,弃沉淀。注：此时可放入-80℃低温冰箱长期保存。

7) 加入氯仿，比例200ul氯仿/ml Trizol，颠倒混匀，室温放置15分钟。

8) 于4℃离心机12000g离心15分钟。取上清液（上层为水相，中间层为蛋白，下层为有机相，核酸分子主要集中在上层），注意吸取上清是无触碰到中间层或下层。

9) 取上清液（上层为水相，中间层为蛋白，下层为有机相，核酸分子主要集中在上层），注意吸取上清是无触碰到中间层或下层。 10) 加入等体积异丙醇，-20℃沉淀1小时。 11) 于4℃离心机12000g离心10分钟。

12) 弃上清，加入1ml 75%酒精漂洗沉淀，于4℃离心机800g离心5分钟。必要时可重复酒精洗涤

13) 弃上清，可选择再次离心去除残留的乙醇，沉淀在安全柜内晾干，切忌过干，只需目测乙醇挥发干即可。

14) 根据沉淀的大小，使用无RNA酶的水将RNA沉淀充分溶解。选择溶解沉淀的体积，一般为30-100ul。测RNA浓度，此方法RNA A260/A280值在1.6-1.8之间。

15) 电泳检测RNA完整性，0.5XTBE Buffer,110V 电泳30分钟。 16) 最后将沉淀保存在-80℃低温冰箱。

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