双抗体夹心ELISA法测定残余汉逊酵母菌体蛋白含量的研究

双抗体夹心ELISA法测定残余汉逊酵母菌体蛋白含量的研究

四川动物２００８年第２７卷第５期

Ｓｉｃｈｕａｎ

ＪｏｕｒｎａｌｏｆＺｏｏｌｏｇｙ

ＶｏＬ２７Ｎｏ．５２００８

双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法测定残余汉逊酵母茵体蛋白含量的研究

邵强，王俊华

（河南师范大学生命科学学院，河南新乡４５３００７）

摘要：目的通过免疫白兔和小鼠获得抗汉逊酵母菌体全蛋白血清，建立测定残余宿主汉逊酵母菌体蛋白含量

的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ的方法。方法由免疫动物得到抗血清，分别作为包被抗体和检测抗体，通过方阵滴定实验确定双抗体夹心ＥＬＩＳＡ最佳条件。结果获得的兔、小鼠抗血清经问接ＥＬＩＳＡ检测效价均达到１：１００００。作为包被抗体小鼠抗血清的最佳包被浓度为１０¨ｇ／ｍｌ，在３０～５００ｎｇ／ｍｌ范围内测定呈直线关系，相关系数为０．９９８５。可用于测定基因工程产品中汉逊酵母菌体蛋白的残余链。

关键词：酶联免疫吸附测定；菌体蛋白；汉逊酵母中图分类号：Ｑ９５－３３；Ｑ９３９．９１

文献标识码：Ａ

文章编号：１０００—７０８３（２００８）０５—０９４５—０２

ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＨａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａＰｒｏｔｅｉｎＲｅｍｎａｎｔｓｂｙＤｏｕｂｌｅＡｎｔｉｂｏｄｙ

ＳａｎｄｗｉｃｈＥＬＩＳＡ

ＳＨＡＯ

Ｑｉａｎｇ，ＷＡＮＧＪｕｎ—ｈｕａ

（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＨｅｎａｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ，ＨｅｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ

４５３００７，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ

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Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＥＬＩＳＡ；ｃｅｌｌｐｒｏｔｅｉｎ；Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ

随着现代生物技术的发展，越来越多的重组产品投放市场。等体积弗氏不完伞佐剂乳化含１ｍｇ蛋白），皮下多点注射，残余宿主菌体蛋白是影响制品安全性的主要因素之一，反复使加强２次。４周后每只按０．８ｍｌ（含０．５ｍｇ蛋白）菌体蛋白用含一定昔菌体蛋白的重组产品有可能引发机体过敏反应（冯原液耳缘静脉注射，再次加强免疫７ｄ后颈动脉放血，收集血彦玲，２００７）。目前，阁内以酵母为表达宿主重组产品中，大多采清，分装，于一２０℃保存（范薇等，２００５）。

用酿酒酵母作为宿主进行表达，对此的榆测，市场上已有检测试１．２．２酵母菌体全蛋白免疫小鼠取纯化的汉逊酵母全菌

剂盒。但对于用汉逊酵母作为宿主菌进行表达的重组产品中菌菌体蛋白溶液与氢氧化铝佐剂充分混合，免疫１００只ＮＩＨ小

体蛋白的检测目前还是宅白。为此，有必要通过免疫动物获得

鼠，每只腹腔注射０．５ｍｌ（含０．１ｍｇ蛋白），以后每隔１５、１０、

抗血清，建上．灵敏度高、重复性好的舣抗体夹心ＥＵＳＡ检测重组

１０

ｄ分别加强１次。７ｄ后鼠眼球放血，收集血清，混合后再

疫苗中汉逊酵母残余菌体蛋白含量。

分装，于一２０。Ｃ保存（范薇等，２００５）。

１材料与方法

１．２．３抗体效价测定按张飚（２００６）的方法，间接ＥＬＩＳＡ法，菌体蛋白抗原包被浓度为１０“ｇ／ｍｌ，根据说明书，ＨＲＰ－羊抗兔ｌｇＧ和ＨＲＰ一羊抗鼠ＩｇＧ的使用浓度均为３０００倍稀释。新西兰大耳白兔，体重２．５ｋｇ左右；清洁级ＮＩＨ小鼠，６—８每一稀释倍数阳性的判定，根据该稀释倍数的阳性ＯＤ／阴性周龄，体重２０—２２ｇ；汉逊酵母芮体全蛋白，以卜．均由华兰生物股ＯＤ＞，２．１即判为刚性，该稀释倍数即为该ｆｆ【Ｌ清的效价。份有限公司提供。ＨＲＰ 羊抗兔ＩｇＧ、ＨＲＰ一羊抗鼠ＩｇＧ均购白晶１．２．４双抗体夹心ＥＬＩＳＡ最佳反应条件的确定按饶春明等

美生物ｌ：程有限公司。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹试剂盒购自Ｓｉｇｍａ公司。（２０００）的方法方阵滴定，将小鼠抗菌体蛋白抗体从２０峙／ＩＩｄ起，用包被液倍比稀释成１０峙／“、５峙／ＩＩｄ，取１００一加入９１５孔酶标

板，每饷笥度从Ｂ至Ｇ各加２排，４。Ｃ包被过夜，洗涤液洗板３次；

体蛋白溶液与等体积弗氏完全佐剂乳化后，据Ｌｏｗｒｙ法测定每孔加１００山封闭液，ＴＩ。Ｃ封闭ｌｈ，洗涤液洗板３次；每个滴度其蛋白质含量，每只按３．４ｍｌ（含１ｍｇ蛋白）免疫两只大耳白中—弓｛｝力ｎ１００山浓度为０．１ｔ．ｃ，／ｍｌ的菌体僵白作为雠ｊ性彳Ｌ，另－４ｔ｝．兔，皮下多点注射，以后每隔１周每只按３．４ｍｌ（菌体蛋白与

加１０９，山稀释液作为阴性对照孔，３ｒ７℃保温１ｈ，洗板３次；将兔抗

９４５

１．１材料

１．２方法

１．２．１酵母茵体全蛋白免疫白兔取纯化的汉逊酵母全菌收稿日期：２００８一０４一ｌｏ基金项目：｝町南省动物学首点学科资助—婴‘

作者简介：邵强（１９７１一），男，博士，副教授，主要从事分子生物学及蛋白质方面的研究，Ｅ－ｍａｉｌ：Ｂｈａｏｑ９９＠ｓｉｎａ．ＣＯｒｎ

双抗体夹心ELISA法测定残余汉逊酵母菌体蛋白含量的研究

四川动物２００８年第２７卷第５期

菌体蛋白抗体从５００倍起，用稀释液倍比稀释３个滴度，取１００山加入９６孔酶标板，每个滴度从１至６各加２排，３７‘Ｃ保温１ｈ，洗涤液洗板３次；按说明书，用稀释液将ＨＲＰ标记的羊抗兔抗体稀释成ｌ：３０００，取１００ｕＪ加入包被各孔内，３７℃保温１ｈ，洗涤液洗板３次；加ＯＰＤ底物液１００一，３７℃３０嘶ｎ；加２ｍｏｌ／Ｌ心ｓｏ，１００山终止反应。在多功能酶标仪上测Ａ。值。以阳性孑Ｌ和阴性对照孔Ａ值的最大比ｆＡ来确定包被抗体及榆测抗体的最适使用浓度。

１．２．５标准曲线及线性范围的确定将鼠抗菌体蛋白抗体按摸索的最佳包被浓度包被酶标板Ｂ１～Ｄ５各孔，用稀释液将汉逊酵母菌体蛋白稀释成５００

ｎｇ／ｍｌ、２５０

ｎｇ／ｍｔ、１２５ｎｇ／

ｍｌ、６２．５．ｇ／ｍｌ、３０．ｇ／ｍｌ的溶液，分别加入１—５列，按１．２．４步骤进行ＥＬｌＳＡ实验，根据光吸收值确定标准曲线及线性范围（王键，沈茜，２００５）。

２结果与分析

２．１兔抗菌体蛋白血清效价测定

免疫前每只白兔耳缘静脉取血２ｍｌ作为阴性对照，结果见表Ｉ。从表ｌ可见，当抗血清浓度稀释至１：１００００，阿ｐ眭ＯＤ值／阴性ＯＤ值仍大于２．１，说明免疫后两只自兔的抗血清效价都较高，呵供后面的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ使用。

表１

兔抗汉逊酵母菌体蛋白抗血清效价

２．２小鼠抗菌体蛋白血清效价测定（方法同上）

具体结果见表２。采血分离疵清混合后，血清效价也达到１０４。

表２小鼠抗汉逊酵母菌体蛋白抗血清效价

ＥＬＩＳＡ最佳反应条件具体结果见表３。

从表３可看出，当包被鼠抗菌体蛋白抗ＩＩｌＬ清浓度从１０

¨ｇ／ｍＩ稀释到５斗ｇ／ｒｎｌ时，阳性ＯＤ明显下降，而阴性ＯＤ值下降幅度很小；阳性ＯＤ值与阴性ＯＤ值比值最大时，包被抗体的浓度为１０斗∥ｍｌ，兔抗菌体蛋白血清的稀释倍数为１：１０００，因此，包被抗体和检测抗体的最佳反应浓度分别为１０

彬ＩＩｌｌ和１：１０００。

表３包被抗体与检测抗体最佳浓度的确定

Ｓｉｃｈｕａｎ

ＪｏｕｒｎａｌｏｆＺｏｏｌｏｇｙ

Ｖ０１．２７Ｎｏ．５２００８

２．４反应的线性范围

结果见表４。

从表４可以看出，标准菌体蛋白每一稀释浓度的３次重复的吸光度值基本接近。选取酶标板Ｃ排的吸光度值用计算机软件做标准曲线，标准曲线见图１。从标准曲线可见，标准菌体蛋白浓度在３０．ｇ／ｍｌ到５００ｒｉｇ／ｍｌ之间时，标准曲线的线性良好，相关系数为０．９９８５。此方法可检测重组产品中菌体蛋白的残余量。

表４线性范围确定的实验结果

２１．５

靼

ｏｏ

Ｊ

Ｏ．５

Ｏ

Ｏ０．２０．４０．６

菌体蛋白浓度（ｔｔｇ／ｍ１）

图１双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法标准曲线图

在基因工程霞组产品中，以汉逊酵母作为表达宿主的越

来越多，特别足汉逊酵母重组乙肝疫苗，菌体蛋白的残余最白的含量，对产品质量的控制具有重要的意义，其检测方法尚在不断的改进和完善巾。目前常用的斑点杂交法，其灵敏通过ＥＬＩＳＡ检测方法检测汉逊酵母残余菌体蛋白含量，具有准确，快速、灵敏。本文通过汉逊酵母荫体伞菌体蛋白免疫小鼠和白兔，得到两种抗汉逊酵母荫体蛋白抗体，建立的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法经摸索，标准曲线范廿；ｌ在３０～５００

ｎｇ／

了基础。

范薇．于长明，杨敬，等．２００５．重组钩端螺旋体外膜蛋白酶联免疫吸附（ＥＬＩＳＡ）检测方法的建直［Ｊ］．中国实验动物学报。１３（４）：

２４９—２５２．

［Ｄ］．占林大学：ｌ～６．

菌菌体蛋口含餐［Ｊ］．中国乍物制晶学杂志．１３（１）：４２—４５．’建立和应用［Ｊ］．细胞与分子免疫杂志，２ｌ（５）：６４６－６４９．流感病毒抗体方法的建立［Ｄ］．河北农业大学．

３讨论

直接关系到产品的质量。快速准确的测定残余汉逊菌体蛋度很高，但对实验人员的操作技能要求高，耗时较长。

２．３

ｍＩ，直线回归系数为０．９９８５。重复性、稳定性都较好，也方便、快速。弥补了目Ｉｊ｛『检测以汉逊酵母为宿主的蘑组产品中残余菌体蛋白含量的空白，为成功研制检测试剂盒的建立打４参考文献

冯彦玲．２００７．重组人生长激素宿主蛋白检测方法的变更及其验证饶春明，王军志．２０００．应用ＥＬＩＳＡ测定重组细胞因子中残余大肠杆王键，沈茜．２００５．分泌型ＩＣＯＳ２ｍｌｇ重组融合蛋白定昔检测方法的张飚．２００６．ＧＳＴ单克隆抗体的制备及舣夹心ＥＩ．ＩＳＡ检测Ｈ５亚型禽

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/s521.html