DNA分子标记技术及其应用

DNA分子标记技术

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安徽农业科学。 u aoAhi g. c2O, ( ) 42 72 J r lf nuA, Si 073 2: 2— 44 on i . 547

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孙红忠

责任校对

李洪

D NA分子标记技术及其应用白玉 (都范学命科学院北 o3首师大生学，京l0) 07摘要对R L、A D A L、S、 S FP R P、FP SR I R等常用的D A分子标记技术以及其他几种新兴的标记技术( N、S等) S N S PE F的原理、特点进行了综

述，认为利用 D A分子标记技术来鉴定品种具有客观、 N准确、快速的特点，可鉴定形态上很难或者根本无法鉴别的品种。分子标记技且术已成为品种鉴定技术领域的主流和发展趋势。

关键词 D A分子标记；n R P; PSR I R品种鉴定 N R;A D;; S; 6 L S S中图分类号 Q 0文献标识码 A 5 3 文章编号 01— 6120)4 042 0 57 61(072— 72— 3

遗传标记 ( eec a e是指可追踪染色体、 G n im r r t k )染色体某一

的遗传信息。⑥D A分子标记技术简单、 N快速、易于自动化。⑦提取的 D A样品， N在适宜条件下可长期保存，这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。

节段或者某一个基因座在家系中传递的任何一种遗传特

性。它具有 2个基本特征，即可遗传性和可识别性。因此， 生物中任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。 随着遗传学的不断发展，遗传标记的种类和数量也不断增加。目前，应用较为广泛的遗传标记有形态标记 ( o hl i M r o g p o.cl ae)细胞标记 ( y l i l ae)生化标记 ( i hmcl a m kr、 C to c kr、 o g am Bo e i c a

因此，N D A分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同 工酶、白电泳鉴定中的许多缺陷和难题，蛋因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。 11第 1 .代分子标记

mkr和分子标记 ( l cl ae _。 ae ) M lu r kr l 0 am )_ e形态标记指植物的外部形态特征 (矮秆、紫鞘、叶等)卷； 细胞标记主要是染色体的核型 (色体数目、染结构、随体有无、着丝粒位置等 )带型 (带、、等 )生化标记主和 C N带 G带；要包

括同工酶和等位酶标记。这 3标记都是基因表达的种 结果，是对基因的间接反映，记数目有限，标多态性较差，易受环境条件的影响。而分子标记是直接在 D A分子上检测 N生物间的差异，在 D A水平上遗传变异的直接反映。分是 N子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一

1I1 FP .. R L标记技术。18年 Bti提出的限制性片段 90 os en长度多态性 (e rtn r ete【pl o h m,F P可 Rsii a nl g y r i sR L ) tco f￣ n h om p s

以作为遗传标记，开创了直接应用 D A多态性的新阶段， N是最早应用的分子标记技术【。R L是检测 D A在限制性内 4 FP j N切酶酶切后形成的特定 D A片段的大小，映 D A分子上 N反 N

不同酶切位点的分布情况，因此 D A序列上的微小变化， N甚至1个核苷酸的变化，能引起限制性内切酶切点的丢失或也产生，导致酶切片段长度的变化。R L标记的等位基因具 FP有共显性的特点，结果稳定可靠，重复性好，别适应于构建特遗传连锁图。但是，在进行 R L分析时， FP需要该位点的 D A N片段做探针，放射性同位素及核酸杂交技术，用既不安全又不易自动化。另外，FP D A多态性检出的灵敏度不高， RL对 N RL F P连锁图上还有很多大的空间区E。 2 j 112 R P .. A D标记技术。为了克服 m 1【术上的缺点， P技 W l m等于 19年建立了随机扩增多态 D A(adm i as l i 90 N Rno apfd o m r i D A,A D技术， m le l o h N R P ) i py pe i由于其独特的检测 D A多态性的方式使得 R P N A D技术很快渗透于基因研究的各个领域。R P A D是建立于 PR基础之上的分子标记技术， E基本原理是利用一个随机引物 (~1个碱基 )过 P R反应 8 0通 E非定点地扩增 D A片段，后用凝胶电泳分离扩增片段来 N然进行 D A多态性研究 j N 6。对任一特定引物而言，在基因它

种较为理想的遗传标记形式，以蛋白质、酸分子的突它核

变为基础，检测生物遗传结构与其变异。分子标记技术从 2本质上讲，是以检测生物个体在基因或

基因型上所产生的都 变异来反映生物个体之间的差异。D A分子标记能对不同 N

发育时期的个体、任何组织器官甚至细胞作检测，数量极多，遍及整个基因组，多态性高，遗传稳定，不受环境及基因表达与否的限制。1分子标记及其特点

分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展

起来的一种较为理想的遗传标记形式，以蛋白质、它核酸分子的突变为基础，检测生物遗传结构与其变异。分子标记技术从本质上讲，以检测生物个体在基因或基因型上所产都是生的变异来反映生物个体之间的差异。每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围，就一般意义而言，但 D A分子标记与形态标记和生化标记等相比，有许多独特 N具的优点：受组织类别、育阶段等影响。植株的任何 3①不 j发

组 D A序列上有其特定的结合位点，旦基因组在这些区 N一域发生 D A片段插入、 N缺失或碱基突变，可能导致这些特就

定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物的数量和大小发生改变，出多态性。与 R L相比， AD技术简单，表现 FP RP 检测速度快，N D A用量少，实验设备简单，不需 D A探针， N设

组织在任何发育时期均可用于分析。②不受环境影响。因 为环境只影响基因表达 (转录与翻译),而不改变基因结构即 D A的核苷酸序列。③标记数量多，及整个基因组。 N遍

计引物也不需要预先克隆标记或进行序列分析，不依赖于种属特异性和基因组的结构，合成一套引物可以用于不同生物基因组分析，用一个引物就可扩增出许多片段，而且不需要

④多态性高，自然存在许多等位变异。⑤有许多标记表现为共显性，够鉴别纯合基因型和杂合基因型，供完整能提作者简介收稿日期白￣ (93 )女，北邢台人，士研究生，究方向：能 18一，河硕研功基因组。

同位素，安全性好。当然，A D技术受许多因素影响， RP实验的稳定性和重复性差_, 7首先是显性遗传，能识别杂合子 J不位点，这使得遗传分析相对复杂， 8在基因定位、锁遗传 j作连图时，因显性遮盖作用而使计算位点问遗传距离的准确性会

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3 5卷 2 4期

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下降；次，A D对反应条件相当敏感，其 RP包括模板浓度、 g M浓度，以实验的重复性差 l。所 9 j 113 F P标记技术。扩增片段长度多态技术 (兀P)又 . . A L A,

域l。此外，S l引 SR标记不仅能够鉴定纯合体和杂合体，而且结果更加可靠，方法简单，省时省力。 1 . I R标记技术。I R即内部简单重复序列，一种 .2 S 2 S S S是

名限制片段选择扩增技术 (ecv sii a etm l— Sl te ertnfg n a pf e i r tco r m i ictn S F, 19 ao,R A)于 93年由荷兰 K Y E E公司的 Zba i EGN aen和 Vs o等发明u并已申请专利。A L, F P是近年来迅速发展起来的一种分子标记技术，它将基因组 D A用成对的限制性 N内切酶双酶切后产生的片段用接头 (酶切位点互补 )接与连起来，并通过 5端与接头互补的半特异性引物扩增得到大量

新兴的分子标记技术。1 4 Z tei等对 SR技术进行 9年 ik we 9 ei z S了发展，立了加锚微卫星寡核苷酸 ( n o dmc sei建 A c r io tle he r alt

0gnc 0ds lDu e【e) i l i技术【 l。他们用加锚定的微卫星寡核苷酸作引物，即在 SR的 5端或 3端加上 2 4个随机选择的核苷 S

酸，可引起特定位点退火，这从而导致与锚定引物互补的间 隔不太大的重复序列问的基因组节段进行 P R扩增。这类 C标记又被称为 IS SR(It -m l eune r a )l A S ne s pe s ec e tl ri q w、 S R ( nhr ipesqec pas[J A P P R J A coe s l euner et)1或 M -C[。在所用 d m e 7

D A片段，而形成指纹图谱的分子标记技术。A L N从 F P指纹呈孟德尔式共显性和显隐性遗传。它兼具 R P A D与 R L的 FP优点，较高的稳定性，有用少量的选择性引物能在较短时间内检测到大量位点，每对引物所检测到的多个位点都或并且

的两翼引物中，可以一个是 AS SR引物，另一个是随机引物。 如果一个是 5 端加锚的 A S SR引物，一个是随机引物，

被另则称为 RA P技术【』 M 1。 9

多或少地随机分布在多条染色体上，各染色体上 A L F P标记的数目与染色体长度呈正相关 (= . 1,一对引物获得 r 0 5 )而 0的标记涉及的染色体数与标记数呈正相关 (= . 6。因 r 08 ) 2此，少量效率高的引物组合，获得覆盖整个基因组的通过可 1标记【 J P l。目前， 1P J作为一种高效的指纹技术，已在遗传育种研究中发挥它的优势【 l。不过也有研究认为，

用于 I RP R扩增的引物通常为 1—1个碱基序列， S—C S 6 8

由14—个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成，从而保证了引物与基因组 D A中 SR的 5或 3 N S 末端结合，过 PR反应扩增 SR之间的 D A片段。SR在真核生通 C S N s物中的分布是非常普遍的，且进化变异速度非常快，而并因锚定引物的 I RP R可以检测基因组许多位点的差异。与 S—C SS RP R相比，于 1S—C S -C用 SR P R的引物不需要预先的 D A测 N序，也正因如此，有些 I R引物可能在特定基因组 D A中没 S S N

1对基因组纯度和反应条件要求较高l另外用于遗传 J P l,作图时，数的标记与图谱紧密度有出入。此外，少在RP A D和 R P技术基础上建立了 S A ( qec hr t i d n C R S uneca c re e a ez

a pfdei s序列特异性扩增区域 )C P ( lvda p— m l e gn, i r o i、A S C a l ee m i l l o h q ne酶切 fd om r ls ec,扩增多态序列 ) D FD Aa— e p y p ce u和 A ( N n/ pfd n r n,N l e g p t D A扩增指纹 )标记技术 _。这些技术 i f er s i i i等 l 的出现，步丰富、进一完善了第 1代分子标记技术，加了人增们对 D A多态性的研究手段。 N1 2第 2代分子标记 .

有配对区域而无扩增产物，常为显性标记，通呈孟德尔式遗传，且具有很好的稳定性和多态性。13第 3代分子标记 .

13 1 S P标记技术。单核苷酸多态性 (i enc od .. N s u ete l i pl o hm, P被称为第 3 D A分子标记，

指同一 omr i S ) y p s N代 N是位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异，种差异包括这

12 1 S .. S R标记技术。在真核生物基因组中存在许多非编

单个碱基的缺失或插入[J更常见的是单个核苷酸的替换， 2. 0且常发生在嘌呤碱基 (与 G和嘧啶碱基 ( A ) C与 T之间。 ) SP记可帮助区分两个个体遗传物质的差异， N标被认为是应

码的重复序列，如重复单位长度在 1 5 5 6个核苷酸的小卫星 D A Mn a l e N )重复单位长度在 2 6核苷酸的微 N ( isei A, i tl D t 个卫星 D A M e st leD A l。小卫星和微卫星 D A分布 N ( ir aei N )3 o lt J N

用前景最好的遗传标记。目前，已有 2 1 3 00多个标记定位于人类染色体上，在拟南芥上也已发展出 26 S P 3个 N标记。在这些 S P N标记中大约有 3%包含限制性位点的多态性。检 0测 SP N的最佳方法是 D A芯片技术，新报道的微芯片电 N最泳 ( ioh etpo s )可以高速度地检测临床样品的 Me ci e r hri, r pl o e s c SP它比毛细管电泳和板电泳的速度可分别提高 1 5 N, 0和 0

于整个基因组的不同位点。由于重复单位的大小和序列不同以及拷贝数不同，而构成丰富的长度多态性。M o等从 or e

于11 9年结合 P R技术创立了 SR S p qec r e。 9 C S (i ls nee a简 m e u e p t单重复序列 )标记技术。SR也称微卫星 D A是一类由几 S N,个(多为 1 5 )基组成的基序串联重复而成的 D A序 个碱 N

列，其中最常见的是双核苷酸重复， C )和(G每个微即(A T ),卫星 D A的核心序列结构相同， N重复单位数目 1— o, 0 6个其高度多态性主要来源于串联数目的不同。不同遗传材料重复次数不同，致了 SR长度的高度变异性，导 S这一变异性正是 SR标记产生的基础。SR标记的基本原理： S S根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物，通过 P R反应扩增微 C

倍_。S P 2 N与第 1 代的 R L及第 2 FP代的 SR标记的不同有 S2个方面：,N其一 S P不再以 D A片段的长度变化作为

检测 N手段，而直接以序列变异作为标记；二，N标记分析完全其 SP摒弃了经典的凝胶电泳，代之以最新的 D A芯片技术。 N1 3 2 E I标记技术。表达序列标签 ( xrs d s une . . S" E p s e ec e e q Tg S ) a,E T是美国国立卫生研究院( aoa I tue f el, N t nl n i t o ah i t s H t s

卫星片段。由于核心序列重复数目不同，因而扩增出不同长度的 P R产物，是检测 D A多态性的一种有效方法。微 C这 N

NH的生物学家 Vn r 1 1 I) et于 9年提出的 J e 9。随着人类基因组计划的开展，S术首先被广泛应用于寻找人类新基 ET技

卫星序列在群体中通常具有很高的多态性，且一般为共显而性，因此是一类很好的分子标记。目前已利用微卫星标记构

因，绘制人类基因组图谱，识别基因组序列编码区等研究领域，之后又被广泛应用于植物基因组研究 j S。E T是指在来

建了人类、鼠、鼠、小大水稻、小麦、等物种的染色体遗传玉米图谱。这些微卫星标记已被广泛应用于基因定位及克隆、疾

源于不同组织的 eN D A文库中随机挑选克隆、,测序得到部分eN D A序列，一个 E Y对应于某一种 r dA的 e N S n￣ P D A克隆的一

病诊断、缘分析或品种鉴定、作物育种、化研究等领亲农进

段序列，长度一般为 1— 0, 5 50 o只含有基因编码区域。ET 0 b S

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可代表生物体某种组织某一时间的一个表达基因，以被称所

之为“表达序列标鉴”而 E F; S的数目则显示出其代表的基因表达的拷贝数，一个基因的表达次数越多，其相应的 c N D A克隆越多，以通过对 cN所 D A克隆的测序分析可以了解基因的表达丰度 J目前构建 cN。 D A文库一般都使用试剂盒，法方成熟。而且飞速发展的 D A测序技术，使得进一步降低大 N也

[] 4朱玉贤， .李毅现代分子生物学[]版. M .北京： 2高等教育出版社， t . 3 1 02 1JW HJ M C K B LK A LV K K JD A pl斑 ln a pfdb 5 l A SJK,U E I

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规模 D A序列测定成本成为可能 J N。 2分子标记在品种鉴定中的应用 D A分子标记从它诞生之日起，引起了生物科学家极 N就大的兴趣，经历了短短几十年的迅猛发展后，子标记技在分术日趋成熟【 J 2。早期， 6人们采用形态学方法对品种进行识

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别，方法简便、济，是由于许多形态学性状鉴定周期其经但长，受环境影响大，并且随着育种亲本的利用集中化，得所使选育的新品种在许多性状上更加相似，难以区分，而品种鉴定愈来愈困难。2世纪后期，子生物学技术得到迅猛发 0分展，而使从 D A分子的角度准确可靠地对品种进行基因鉴 N定和纯度分析成为可能。与传统的田间形态鉴定相比较，D A分子标记的应用为品种鉴定和纯度分析提供了客观、 N准

aas[]Da oi itioy n netn i a,013:/ 3 nli J .inscMe￣og dIf i s s s 20, T一8 . ys g t r l a co D e e 9[] 1熊立仲， 1王石平，刘克德， .等微卫星和 AI

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2t Ie - 4 n ma h t

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确、的渠道，快速是一项革命性的技术进步。 分子标记广泛存在于基因组 D A的各个区域，量巨 N数 大，通过对随机分布于整个基因组的分子标记的多态性进行

69 . 1

比较，就能够全面评估研究对象的多样性，并揭示其遗传本质。利用遗传多样性的结果可以对物种进行聚类分析，进而了解其系统发育与亲缘关系。分子标记的发展为研究物 J种亲缘关系和系统分类提供了有力的手段。3展望

[6 ZE IW C, A AS I,A U AD.日 ￡ 1] 1 E/ZE R F LK L B D GⅫ TK A 6 b ipe。 ys l培 m sqee pa SR nhr 0丑e hi r co piao[] euler e S )aco dpl s ca atna lcf J . l e t( e r n e i m l i l n G nnc, 9,02:7—13 eo/s1 42()16 8. 9 {7 N , H HN& R,N PH T(, )ad(-￣ o ds pe 1j WA G G￣A A G M K A .CA n GA) - r m t e￣ s u l￣e￣ s( SR )gnre o￣, i oba,j e oo r) q t A S s eeadpl wh m i s e ( t y s n y n b ( . e[JTer pl - e, 9,618—19 . L )M

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D A分子标记技术的开发是近年来分子生物学领域研 N

究的热点。随着分子生物学理论与技术的迅猛发展，必将不断地开发出分析速度更快、成本更低、信息量更大的分子标记。而分子标记技术与 D A提取程序化、 N电泳胶片分析自

[1 C- AZIG D, E E K , O O N M A e a. c d p d c 2]SkM I N B L N Y A N V T Y , t 1M/o f e. I ritpo s: eh f】 s e N eco l .u e d e, r hr i ar t o i rd S Pdt t J N c i A d Rs￣ e s r￣ r} -￣ ei n J l c s 2O,89: . OO2()4 3 1 J D MSM K HE G C Y EJD e a.o p￣etyD As. 2 A D,E .Y JM, O A N ,t 1Cm l'na N A n r e qe n: pes ell t sadhn ngnm ecJ .cne uui e r e sqe￣ a n ta eo e g x sd lq g r cl]Si c, e 1 1225 1)15—1 6 9, (03:61 6 . 9 5 5

动化、信息(数据)处理计算机化的结合，必将加速遗传图谱的构建、因的定位及克隆、基物种亲缘关系

鉴别及与人类相

[骆蒙，]贾继增 .国际麦类基因组 E S T计划研究进展[ . J中国农业科学，]20, ()10 1 . O03 6:1—12 3

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