Western blot步骤与经验总结

Western bloting经验总结

1.试剂准备 详细参考试剂配方 2.制胶

2.1 准备好制胶器，玻璃板务必要干净，否则容易产生气泡或使胶不平；玻璃板需卡紧，先用1ml H2O试探，以防漏胶。将水倒去后用滤纸把残留在玻璃板上的水吸去（轻轻的，不要使卡紧的玻璃板松动）。

2.2 配胶：按需要配制适当浓度的胶，如上表及SDS-PAGE分离胶配方表。充分混匀，尽量不要弄出气泡（可以轻轻快速旋转配胶用的烧杯30 s到1min，切莫太快以免液体溅出，如图所示[不是自转]；若用枪反复吹打，不要太快以免产生大量气泡）

2.3 将胶慢慢加入到玻璃空隙中。枪头可残留部分液体，以免把气泡打进玻璃板间，胶约7 ml（1.5mm厚，六一24D型）。

2.4 压胶：用无水乙醇或水轻轻地沿板加入，每块胶上加600 ul-1000 ul。放于室温或37℃，务必放平，不平则胶歪，导致显出的蛋白条带歪曲。

2.4 20 min后倒去无水乙醇或水，用滤纸吸干。（若胶不凝，可放30 min，再不

凝的话就要考虑，10%AP溶液是否过期（有效一周）或浓度是否配错，是

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否忘记加促凝剂TEMED）。

2.5 配制浓缩胶(5%)并混匀，插好梳子，轻轻从梳子两端缝隙加入浓缩胶，直到

胶快溢出梳子（溢出也无妨），检查是否有气泡，若有，将梳子轻轻拔出，重新插好。放于室温或37℃，30分钟（浓缩胶较稀，时间要长些） 3.冲洗加样孔：小心拔出梳子，若加样孔扭曲变形，可用针头将其扶正（勿将针头插到胶中）,先加部分1×SDS-PAGE 电泳缓冲液到内槽,用枪头吸电泳液轻轻冲洗加样孔，以排除气泡。

4.排除槽底的气泡：将内置电泳槽放在外槽中，加入1×SDS-PAGE 电泳缓冲液（外槽液，可以是内槽回收液）溢过底部胶（液面离底部3-4cm即可），倾斜整个电泳槽，反复提起放下内电泳槽，直至完全排除内槽底的气泡。 5.上样：蛋白样本与一定比例的上样buffer（5×）4:1混匀，沸煮3-5分钟。

按的等质量上样，一般30-100ug，磷酸化200ug总蛋白。另外留一孔加蛋白maker(预染)。 6.电泳：

6.1把电泳槽放在底部较平的脸盆里（一些底部不平，中央突起或凹下，可放在偏侧，若不平，电泳后整个条带会倾斜）；

6.2在脸盆上加一些冰（电泳会产热，热这电阻增大，功率降低；温度增高也会促进磷酸化蛋白降解）；

6.3将内槽加满电泳液，至少要把内玻璃板溢过，使电泳液接触到SDS-PAGE胶，这样才能通电（内槽为负极，外槽为正极）。 6.4设置电流电压，一般两步法：

(1) 80 V,30 min ,电流不恒定，可设置额定电流50mA.

(2)100-120V ,分子量小的话就用120V，分子量大的蛋白可用100V,时间为1 h-2 h，分子量越大时间越长。电流可设为100mA.若两个电泳槽一起跑电泳，电压不变，电流增加一倍（并联）。

6.5电泳至MAKER分开，染料跑到胶的最底部边缘即可停止。 7.转膜：

7.1倒去外槽液，回收内槽液。

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7.2切胶，按所需分子量大小，在相应的位置切下宽为1cm /1.2cm或更宽，长度按上样孔多少计算。将胶放在负极转膜液中浸泡20 min（分子量越大泡的时间越长可以~40min，不宜过分浸泡，因胶泡时间长后会变长变宽）。 7.3同时剪切相应大小的厚滤纸（不宜比胶过大，以免短路），浸泡在负极转膜液≥20分钟。

7.4 PVDF膜：大小与胶相同;

平衡PVDF膜：甲醇，30 s → ddH2O，2 min → 正极液≥15 min。（甲醇激活PVDF膜正极基团，从而使蛋白容易结合），同时剪切相应大小的厚滤纸，放在正极液中浸泡。 7.5转膜（半干转） (1) 三明治结构：

底下（正极）正极滤纸—PVDF膜—胶—负极滤（负极盖子）。

-负极滤纸胶PVDF膜正极滤纸

注意：层层之间不能有气泡（用镊子或玻璃棒赶出气泡），特别是膜与胶之间不能用气泡。 (2) 转膜条件:（恒流）

一般用0.1mA每张膜（1cm×5～8cm）,时间约为分子量的1/3.如内参43kD,为15 min；21 kD为7 min；75 kD，25 min；38 kD,13 min；90 kD,30min。 注意：

a) 电压会随时间而改变，绝不能超过25V（会把膜烧干及损坏机器）；如果

电压高，可以适当降低电流，但电流不宜低于0.5mA. b) 最适电压在14-18V.

c) 分子量大,如200 kD,转膜时间很长，“三明治”发热（通电产热），电

压可能会不断升高，甚至超过25V，滤纸应多加转膜液，不要挤去，尽量使用旧的滤纸（吸收的液体较多）。

d) 转膜条件可适当调整（丽春红染膜，可判定转膜是否成功）。 8.封闭：

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+8.1转膜完成后，将膜置于TBS/TBST中清洗1-2min（可用摇床）以洗去转膜液。 8.2置于5%脱脂奶粉溶液（1g奶粉+20 mlTBST）中封闭,盖上保鲜膜，室温3-6 h/4℃ 过夜（12 h），若用摇床则更佳。磷酸化蛋白宜在4℃。 注意：膜不能重叠于一起，如果膜多且长，最好分开封闭（多个器皿）。 9．一抗：

9.1根据抗体说明书稀释抗体，可以用5%封闭用蛋白奶粉溶液或5% BSA溶液作稀释液，一般中杉金桥的β-actin一抗1：500,CST公司1:1000-2000； 9.2将膜放在平的蜡板上，用滤纸吸干多余液体（从膜边上吸，切莫按压到膜中间）；

9.3 将稀释的抗体加到膜上，需完全覆盖每个角落。

注意：1：抗体稀释要混匀；2：抗体保存注意事项 3：抗体加在转膜的正面。

10.洗膜：TBS-T 2×10 min+ TBS 1×10 min 最好一张膜一个容器（平皿）,不要重叠。

11.二抗：膜放在平的蜡板上，用滤纸吸干多余液体（从膜边上吸，切莫按压到

膜中间），根据抗体说明书稀释抗体，用TBST稀释，如中杉金桥二抗1:1000，务必混匀。室温夏天1h-1.5h，冬天2h-2.5h。抗体加在转膜的正面。 12.洗膜：同上 13.化学发光:

13.1在暗室操作（关灯），CCD化学发光系统，先用白光（A+B）对焦，可以将

有字的纸放在蜡板上，做对焦直至字清晰(一般调FAR/NEAR或ZOOM IN/OUT)。

13.2再将膜放在蜡板，用滤纸将液体吸干，加上ECL混匀的试剂。

13.3迅速放到仪器的暗室中，曝光:special → start picture后special→

average frames→□integrate one-chip ，同时，number of frames空格上输入帧数 如100――→0K,等光标变成虚十字，曝光完成。 13.4若条带不亮继续加大帧数直至亮为止，记得保存（文件→保存为?）。 注意：

a) 务必保证膜上都铺上试剂，否则部分区域不能曝光；

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b) 随时间ECL试剂会淬灭， ECL试剂（常用millipore公司、天根）等体积

试剂A和B混匀，在暗室操作（关灯），以免试剂淬灭。 c) 曝光应先从小的帧数开始，逐渐加大。

d) 原始照片为黑底白条带，发表文章时应将其反色，即白底黑条带。TIFF图

片可以用Quantity one软件对条带进行相对定量分析。

注意事项

一、抗体保存：

不能冻融，按标签上写的保存温度，绝不能把4℃的抗体冻存到-20℃，否则影响抗体活性。需-20℃的抗体含有甘油，、可以抗冻，当稀释后，则不能再冻回-20℃。每次使用应尽快放回冰箱。使用时间较长后，若发光条带不亮，可以减少抗体稀释倍数。 二、电泳槽保养： 1.玻璃板清洗

先将适量洗衣粉溶于自来水中（不宜太浓，高浓度减会损害玻璃），将玻璃板

浸泡在其中，约15-30分钟，用海绵擦拭，自来水冲洗，蒸馏水再冲洗，烤干即可。收起放好，最好是放在有缓冲能力的物品上，如泡沫板，海绵块等，务必轻拿轻放！ 2.内槽和外槽：

自来水冲洗即可，然后蒸馏水冲洗。特备注意的地方： 2.1 内槽有导电丝的地方容易残留胶，可以用牙刷将其轻轻刷去。

2.2 两个电极插头周围容易残留电泳液物质的结晶（干燥后为白色粉末状），可以用试管刷轻轻擦拭。

2.3 自然晾干，不要烤干，以延长寿命。晾干时不宜将其挂于高处，以免打破。 3.梳子：容易折断宜，轻轻清洗，注意洗刷去梳子各个齿之间残留的胶。

三、其他注意：

1.Westernbloting几乎所有试剂为有毒有害物质，整个过程务必戴上口罩，穿手套，

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工作环境尽量通风。

2.配胶过程在吸取高挥发性的TEMED时，应屏住呼吸，远距离吸取（伸直手臂）。 3.制作蜡板：

a) 将蜡烛放在平皿或塑料枪头盖子中，放在75℃烤箱,待融化后，抽去线条，

放在平的桌子上，等其冷却凝固。

b) 蜡板使用多次后，不平或其聚集液体的能力降低，则再次融化，但融化前

注意蜡板面和底部绝不能有液体，否则再融化凝固则会有空泡，导致不平。

四、声明：个人经验，仅供参考,不当之处，请自行改正。

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