梅毒螺旋体优势表位抗原嵌合表达构建双抗原夹心法的研究

中国皮肤性病学杂志２００６年７月第２０卷第７期ＣｈｉｎＪＤｅｒｍＶｅｎｅｒｅｏｌ，Ｊｕｌｙ．２００６，Ｖ０１．２０，Ｎｏ．７

梅毒螺旋体优势表位抗原嵌合表达构建

双抗原夹心法的研究

陆原１，陈达灿２，孙鹏１，祸国维２

［摘要］目的用基因工程方法表达嵌合的梅毒螺旋体优势表位抗原，建立检测血清梅毒抗体的双抗原夹心酶联免疫方法。方法通过计算机软件分析选择梅毒螺旋体优势抗原表位，用聚合酶链反应（ＰｅＲ）扩增优势表位基因，构建了梅毒螺旋体多优势表位嵌合抗原（ｒＴｐＮｌ５－ＴｐＮｌ７－ＴｐＮ４７）表达载体，转化宿主茵ＢＬ２１（ＤＥ３）进行表达，亲和层析柱法纯化获得高纯度融合抗原，并用其建立检测梅毒抗体的ＤＡＳ－ＥＩＡ。结果表达的优势表位嵌合抗原具有很好的抗原性。

用其建立的嵌合抗原ＤＡＳ．ＥＩＡ检测确诊的５０份阳性和３０份阴性血清，阳性检出率和阴性检出率都是１００％。结论嵌合抗原ＤＡＳ．ＥＩＡ法具有比间接ＥＩＡ和重组单抗原ＤＡＳ．ＥＩＡ更高的灵敏度和检出正确率，其检测水平已经达到国外ＴＰＨＡ的水平，该方法的建立为临床检测梅毒开辟了新的领域。

［关键词］梅毒；嵌合优势表位抗原；双抗原夹心法

［中图分类号］Ｒ３９２．１１；Ｒ３７７．１［文献标识码］Ａ［文章编号］１００１—７０８９（２００６）０７—０４０３一０３

ＳｔｕｄｙｏｆｔｈｅＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＴｒｅｐｏｎｅｍａＰａｌｌｉｄｕｍＭｕｌｔｉ－ｅｐｉｔｏｐｅＣｈｉｍｅｄｅＡｎｔｉｇｅｎ－ｂａｓｅｄＤｏｕｂｌｅＡｎｔｉｇｅｎＳａｎｄｗｉｃｈｅｄＥｎ－ｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄｌｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ

ＬＵＹｕａｎ，ＣＨＥＮＤａ－Ｃａｌｌ，ＳＵＮＰｅｎｇ，ｅｔａｌ

（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，ＳｈｅｎｚｈｅｎＳｉｘｔｈＰｅｏｐｌｅ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ５１８０５２，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＵｓｉｎｇｔｈｅｇｅｎｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｎｅｗｍｅｔｈｏｄｗｈｉｃｈｎａｍｅｄｄｏｕｂｌｅａｎｔｉｇｅｎｓａｎｄｗｉｃｈｅｄｅｎ?ｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ（ＤＡＳ－ＥＩＡ）ｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｓｅｒｕｍＳｙｐｈｉｌｉｓａｎｔｉｂｏｄｙ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅｄｏｍｉｎａｎｔｅｐｉｔｏｐｅｓｏｆＴｒｅｐｏｎｅ－

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ＥＬＩＳＡ技术应用于梅毒检测最早出现于１９７５年，该方法具有特异性强、重复性好、操作简便、结果易于判断、便于自动化检测等优点，质量远远优于甲苯胺红不加热血清试验（ＴＲＵＳＴ）、快速血浆反应素试验法（ＲＰＲ），接近螺旋体血球凝集试验（ＴＰＨＡ）、梅毒微粒凝集试验法（ＴＰＰＡ），故得到了越来越广泛的应用。近年来伴随着基因工程技术的不断发展，通过重组手段，国内外已经开发出含有梅毒各种膜蛋白主要活性区域的重组蛋白，本试验通过基因工程重组技术获得包含梅毒螺旋体膜蛋白ＴｐＮｌ５，ＴｐＮｌ７，ＴｐＮ４７等主要免疫活性区域的重组蛋白嵌合抗原，结果报告如下。

［作者单位］１深圳市第六人民医院皮肤性病科，广东深圳５１８０５２；２广州中医药大学第二临床医学院（广东省中医院）皮肤科，广东广州５１０１２０

［作者简介］陆原（１９７１一），男，上海市人，医学博士，副主任医师，主要从事中西医结合临床与实验研究。１材料和方法

１．１材料

１．１．１菌株、表达质粒及基因模板菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）购自深圳源动力科技有限公司，表达质粒ＰＦＰＢ为本实验室自己构建。感染ＴＰ（Ｎｉｃｈｏｌｓ）的家兔睾丸组织为深圳市第六人民医院提供的梅毒患者的样品，由深圳市菲鹏科技有限公司制得。梅毒螺旋体ＤＮＡ参照文献¨１。

１．１．２工具酶和试剂ＤＮＡ限制性内切酶，Ｔ４ＤＮＡ连接酶及ＤＮＡ聚合酶均购自ＴＡＫＡＲＡ公司；抗生素氨苄西林、卡那霉素购自华北制药公司；胰化蛋白胨（ｔｒｙｐｔｏｎｅ）及酵母提取物（ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ）购自Ｏｘｏｉｄ公司；ＰＣＲ产物回收试剂盒由华舜生物工程有限公司生产，确诊梅毒患者血清和正常人血清均来自深圳市第六人民医院（南山医院）中心实验室。

　万方数据

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１．２方法

１．２．１克隆、表达、纯化根据参考文献，辅以生物软件分析梅毒螺旋体膜蛋白ＴｐＮｌ５，ＴｐＮｌ７，ＴｐＮ４７的优势表位基因，并以各膜蛋白编码免疫优势表位的ＤＮＡ为模板设计引物，由上海华舜生物技术有限公司合成。ＴｐＮｌ５一Ｆ：５’一ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＣＡＡＧＡＴＧＧＴＧＣ一３’；ＴｐＮｌ５一Ｒ：５’－ＧＧＧＧＡＡＴＣＣ７ｒｒＡＡＧＡＴＣＴＣＣ７Ｉ’ＡＣＴＡＡＴＡ—ＡＴｒＧＣＴＩ？ＣＣｑ３７Ｃ一３７；ＴｐＮｌ７一Ｆ：５’一ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧ７Ｉ℃Ｔ?

ＣＴＴＧＴＡＣＡＡＣＡＧＴＧＴＧＴＣＣ．３’：ＴｐＮｌ７一Ｒ：５７一ＧＧＧ—ＧＡＡ’兀１ＣⅡ’ＡＡＧＡＴＣＴｒＧＧＣＴ兀＇ＣＣ’ｒＧＣＴＣＣＴＧＧ一３’：

ＴｐＮ４７一Ｆ：５

７一ＧＧＧＧＧ√盯ＣＣＧＧＡＧＣＡＣＴＧＣＡＧｒＩ．Ｉ＇ＡＴＩ℃Ｇ一３’：ＴｐＮ４７一Ｒ：５’一ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴｒＡＡＧＡＴＣＴＴＧＣＡＡ’ｒ－ｃＡＡＡＧｒＩＴｒＡＧｃｃｒＩ＇Ｇ玎Ａ一３’。参照文献旧１有关章节进行ＰＣＲ扩增、酶切、连接、转化及诱导表达。从表达菌体中提取包涵体，并用溶解液［２５ｍｍｏｌ／ＬＴＥ，１％（ｖ／ｖ）Ｂ一巯基乙醇，８ｍｏｌ／Ｌ脲，ｐＨ８．０］将其溶解，然后进行Ｑ—ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ离子交换层析，上样后以平衡缓冲液［２５ｍｍｏｌ／ＬＴＥ，６ｍｏｌ／Ｌ脲，０．１％（ｖ／ｖ）Ｂ一巯基乙醇，ｐＨ８．０］洗至基线，再用不同浓度的ＮａＣｌ（用平衡缓冲液配制）洗脱。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ鉴定各抗原蛋白所在的洗脱峰。将收集的洗脱峰用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５０凝胶过滤（缓冲液：２５ｍｍｏｌ／ＬＴＥ，６ｍｏｌ／Ｌ脲，ｐＨ８．０），收集第１峰。

１．２．２双抗原夹心法采用过碘酸钠法将梅毒多表位嵌合抗原标记上辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）。抗原经碳酸缓冲液适度稀释后包被，３７℃温育２ｈ，４℃过夜；甩去孔内液体，ＰＢＳ洗涤３次；然后每孑Ｌ加２００斗ｌ封闭液，３７℃温育２ｈ；甩去孔内液体；再每孑Ｌ按顺序加５０¨ｌ样品稀释液、５０斗ｌ待测血清、５０一酶标抗原，３７℃温育１ｈ；甩去孑Ｌ内液体，ＰＢＳ洗涤６次。加入含０．５％０过氧化氢尿素（生工，货号ＵＢｌ７５３）、４。７６％ｏ三水合乙酸钠、０．９％。冰醋酸的显色剂Ａ及含０．３２％。ＴＭＢ（生工，货号ＴＢ０５１４）、５ｍｍｏｌ／Ｌ柠檬酸、ｏ．５ｍｍｏｌ／ＬＥＤ—ＴＡ－２Ｎａ、５％甲醇、２‰二甲基甲酰氨的显色剂Ｂ各５０山，３７０Ｃ避光显色１０ｍｉｎ。每孑Ｌ加５０山，含２ｍｏｌ／Ｌ硫酸的终止液终止反应，酶标仪４５０ｎｍ波长（参考波长６３０ｎｍ）空白孔校零后读取ＤＤ值。临用前取１００ｍｍｏｌ／ＬＰＢ（ｐＨ６．０），ＴＭＢ贮液１００斗ｌ，３０％Ｈ２０２混匀，每孔加１００山，避光显色１０ｒａｉｎ，最后酶标仪读数（测定波长４５０ｎｍ，参考波长６５０ｒｉｍ）。

１．２．３嵌合表位抗原活性鉴定用纯化的梅毒多表位嵌合抗原分别包被酶联测定板，同时以ＨＲＰ标记此抗原，采用双抗原夹心法对经过ＴＰＨＡ确诊的梅毒阳性和阴性血清样品进行测定，评价嵌合表达抗原的反应活性。１．２．４ｃｕｔｏｆｆ值的计算双抗原夹心法ｃｕｔｏｆｆ＝阴性标本值ｘ２．１（阴性标本对照值＜０．５的以０．５计算，＞０．５的按实际值计算）；间接法ｃｕｔｏｆｆ＝０．１３＋阴性标本对照值（阴性标本对照值＜０．５的以０．５计算，＞０．５的按实际值计算）。

２结果

２．１表位抗原表达质粒的构建以梅毒螺旋体全序列为模板，通过ＰＣＲ扩增，获得梅毒螺旋体膜蛋白ＴｐＮ４７，ＴｐＮｌ７，ＴｐＮｌ５基因片段（图１）。所有片段的５７端均带有ＢａｍＨＩ酶切位点，３’端均带有ＢｇｌＩＩ和ＥｃｏＲＩ两个酶切位点。ＴｐＮｌ５片段用ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ双酶切连接法插入表达载体ＰＦＰＢ，即获得了表达质粒ＰＦＰＢ—ＴｐＮｌ５，多表位嵌合抗原表达质粒的构建就可以按图２的方法进行，即把其中一个质粒作为载体，如ＰＦＰＢ－Ｔｐｌ５，用ＢｇｌｌＩ和ＥｃｏＲＩ双切；另一经过ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切的基因Ｔｐｌ７作为插入片段，获得含有Ｔｐｌ５和Ｔｐｌ７两个基因的表达质粒ＰＦＰＢ—Ｔｐｌ５．１７。由于新质粒中，ＰＦＰＢ－Ｔｐｌ５和Ｔｐｌ７基因间的连接是由互补酶ＢｇｌＩＩ和ＢａｍＨＩ之间的相连，连接后酶切位点消失，因此，新质粒又可成为新的载体。按同样的方法连接在双酶切片段１Ｍ７新质粒的后面，获得质粒ＰＦＰＢ．ＴｐＮｌ５—１７－４７。构建的表达质粒经ＰＣＲ鉴定，各表达质粒均可扩增出相应的基因片段，证明各表达质粒均已构建成功。

２．２转化及诱导将以上所构建的含有目的基因的表达质粒转化到ＢＬ２１（ＤＥ３）受体菌中，经ＩＰＴＧ诱导后，进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ鉴定，嵌合抗原获得了高效的表达，表达量在２０％以上。

２．３抗原纯化嵌合抗原用离子交换及凝胶过滤等方法进行纯化后，经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ鉴定，均可达到电泳纯化（图３）。

２．４双抗原夹心法测定将嵌合抗原包被抗原测定板，并以同样的嵌合抗原标记ＨＲＰ，然后测定了经过ＴＰＨＡ确诊的梅毒阳性和阴性血清，其中包括５０份阳性和３０份阴性血清。结果见表１。

表１双抗原夹心法与间接法的性能比较

双抗原夹心法间接法组别ＰＢ－ＴｐＮｌ５一ＰＢ—ＰＢ－ＴｐＮｌ５－

ＴｐＮＩＴ－ＴｐＮ４７。ＴｐＮ４７ＴｐＮｌ７－ＴｐＮ４７

阳性血清５０．００４８．ｏｏ４８．００

阴性血清３０．００３０．００２８．００

敏感性１００．００９６．００９６．００

特异性１００．００１００．００９３．００

准确性１００．００９７．５０９６．００从表１可以看出，双抗原夹心法ｃｕｔｏｆｆ值为０．１０５，间接法ｃｕｔｏｆｆ值为０．１８。三种方法的检测结果

　万方数据

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存在一定的差异：采用三种膜蛋白（ＴｐＮｌ５，ＴｐＮｌ７，ＴｐＮ４７）优势表位嵌合抗原所构建的双抗原夹心法测定上述血清样品，阳性率为１００．００％，阴性率为１００．００％，准确率为１００．００％（８０／８０）；而采用单一膜

泳道１为ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００，２为ＴｐＮｌ５基因片段，３为ＴＯＮｌ７基因片段，４为ＴｐＮ４７基因片段

图１ＰＣＲ扩增的三个基因片段

ＴｐＮｌ５优势表位片段

ＴｐＮｌ７优势表位片段

图２表达质粒的构建流程

图３

１．Ｍａｒｋｅｒ；２．ＢＬ２１（ＤＥ３）－ＰＦＰＢ空载体诱导对照；３．ＢＬ２１

（ＤＥ３）一ＰＦＰＢ－Ｔｐｌ５—１７－４７的小量表达样品；４．ＢＬ２１（ＤＥ３）－ＰＦ－ＰＢ—Ｔｐｌ５－１７－４７大量表达纯化前样品；５．ＢＬ２１（ＤＥ３）－ＰＦＰＢ—Ｔｐｌ５－１７－４７大量表达纯化后样品

蛋白（ＴｐＳ４７）优势表位嵌合抗原所构建的双抗原夹心法测定上述血清样品，阳性率为９６．００％（４８／５０），阴性率１００．００％，准确率为９７．５０％（７８／８０）；采用三种膜蛋白（ＴｐＮｌ５，ＴｐＮｌ７，ＴｐＮ４７）优势表位嵌合抗原包

被酶联板，间接法测定上述血清样品，阳性率为

９８．００％（４９／５０），阴性率为９３．３４％（２８／３０），准确率为９６．２５％（７７／８０）。就灵敏度来说，采用三种膜蛋白（ＴｐＮｌ５，ＴｐＮｌ７，ＴｐＮ４７）优势表位嵌合抗原所构建的双抗原夹心法也比采用单一膜蛋白（ＴｐＮ４７）优势表位嵌合抗原所构建的双抗原夹心法和间接法要高。说明采用三种膜蛋白（ＴｐＮｌ５，ＴｐＮｌ７，ＴｐＮ４７）优势表位嵌合抗原所构建的双抗原夹心法是一个与ＴＰＨＡ具有同等效果的检测方法，为梅毒螺旋体血清抗体的检测开辟了新的方法和途径。

３讨论

本研究有２个技术特点：第一，嵌合抗原作为包被

和酶标二抗原。目前国内市场上以用梅毒螺旋体重组蛋白质作抗原来检测梅毒已有不少产品，但是绝大部分都是以单一梅毒重组抗原的，这种单一梅毒基因重组抗原对潜伏晚期、合并ＨＩＶ感染或经过治疗的梅毒病人反应性差，常出现假阴性结果∞Ｊ。国内外文献也有报道用多种梅毒抗原组合可以获得比单一重组蛋白质更好的结果ＨＪ，本试验就是在上述基础上，并根据文献得知膜蛋白ＴｐＮｌ５，ＴｐＮｌ７，ＴｏＮ４７具有很好的抗原原性Ｈ１，计算机分析出ＴｐＮｌ５，ＴｐＮｌ７，ＴｐＮ４７中的优势抗原表位，通过基因工程技术，表达和纯化得到多种优势表位的嵌合抗原，并以此抗原作为包被抗原来验证重组嵌合抗原具有比单一抗原更好的免疫反应性。结果也表明，用单一Ｔｐ基因重组抗原双抗原夹心法检测为阴性，或Ｐ／Ｎ比值偏低的血清标本，用联合

３种基因重组抗原（Ｔｐｌ５，ＴｐＮｌ７和（下转第４０８页）

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是一种发生在多基因遗传基础上的炎症增生性皮肤病。最新研究结果表明真皮血管系统尤其是真皮乳头微血管的异常增生是银屑病最早发生的病理过程旧Ｊ。ＶＥＧＦ是一种糖蛋白，对于血管的生成是一个重要的因素。有研究指出银屑病患者皮损中存在ＶＥＧＦ的高表达，由角质形成细胞分泌的ＶＥＧＦ对于银屑病皮损中真皮乳头部血管新生起着决定性的作用旧Ｊ。在银屑病中表皮角质形成细胞加强了ＶＥＧＦ的自我表达，并通过一系列信号传导促进血管通透性增加及血管内皮细胞增生、迁移，最终导致新血管形成。有研究证实ＶＥＧＦ具有以下生物作用：增加血管通透性；促进内皮细胞增殖和血管形成；抑制内皮细胞凋亡Ｈｊ。ＶＥＧＦ是目前所发现的生物体内最强、最特异的促血管生成因子之一。有研究表明ＶＥＧＦ蛋白及ＶＥＧＦｍＲＮＡ表达在银屑病患者皮损和非皮损中增加∞Ｊ，银屑病患者血清中ＶＥＧＦ水平也较正常人增加ＭＪ。本研究结果显示，虽然在寻常型银屑病皮损中ＶＥＧＦ蛋白表达增强，但是，阳性表达程度在中医辨证各证型皮损处有差异，表现为血热型组＞血燥型组及血瘀型组。同时，ＥＬＩＳＡ法检测结果也证实在寻常型银屑病中医辨证各证型血清中ＶＥＧＦ水平有差异，表现为血热型组＞血燥型组＞血瘀型组。

由于本研究所观察到ＶＥＧＦ蛋白在寻常型银屑病中医辨证各证型皮损和血清中有不同程度的变化，以血热型银屑病变化显著高于正常人和血燥型银屑病及血瘀型银屑病，从而提示对寻常型银屑病患者皮损处ＶＥＧＦ蛋白的表达及血清中ＶＥＧＦ水平的检测有可能成为本病中医辨证分型中血热型银屑病与非血热型银屑病的客观辨证指标之一。笔者认为本研究不仅为银屑病中医辨证分型提供了一定客观依据，同时也为中西医结合诊治寻常型银屑病提出了在微观层次上的结合点。

志谢本研究得到本科实验室王兢、冯灵娟和张镜的大力协助，特此致谢。

［参考文献］

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［收稿日期】２００５—１１－２２［修回日期］２００６－０３－１５

（上接第４０５页）

Ｔｐ４７）双抗原夹心法检测，其Ｐ／Ｎ比值明显升高。首次证实了优势表位嵌合抗原的双抗原夹心法的灵敏度较单一Ｔｐ基因重组抗原双抗原夹心法高。而且联合应用３种基因重组抗原未出现假阳性反应，并不降低ＥＩＡ法的特异度。

第二，本试验采用了双抗原夹心的方法，包被抗原和酶标二抗都是嵌合抗原。现在市场上用间接ＥＬＩＳＡ法检测血液梅毒抗体的方法比较多。但是间接ＥＬＩＳＡ法具有一些无法回避的缺陷：①采用了非特异性识别的第二抗体标记，这种非特异性的识别导致其较高的本底和较低的特异性；②由于特异性差且本底高致使包被抗原、标记二抗的使用浓度被迫降低，待测样品量减少，稀释倍数增加又进一步导致了灵敏度的降低；③只能检测抗体中的ＩｇＧ组分，对其他抗体类型尤其是ＩｇＭ无法检出，延长了窗口期∞Ｊ。夹心法利用标记的抗原代替标记二抗，由于使用了两步特异性识别，所以从方法学上解决了间接法的上述缺陷。本试验的夹心抗原采用的都是嵌合的多优势表位抗原，基本上杜绝了漏检和假阳性现象。初步验证该法具有跟ＴＰＨＡ相同的效价，为梅毒诊断发展提供了一个很好思路。

［参考文献］

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［４］ＹｏｎｇＨ，ＭｏｙｅｓＡ，ＳｅａｇｅｒＬ，ｅｔａ１．Ｎｏｖｅｌｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｎｔｉｇｅｎｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏ—ａｓｓａｙｆｏｒｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｓｙｐｈｉｌｉｓ［Ｊ］．ＪＣｌｉｎＭｉｃｍｂｉｏｌ，１９９８，３６（５）：９１３—９１７．

［５］ＦｕｊｉｍｕｒａＫ，ＩｓｅＮ，ＵｅｎｏＥ，ｅｔａ１．Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆ

ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ

ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉｄｕｍａｎｔｉｇｅｎｓｗｉｔｈａｎｔｉ—Ｔｐａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎｈｕｍａｎｓｙｐｈｙｌｉｔｉｃｓｅｒａｅｖａｌ—ｕａｔｅｄｂｙＥＬＩＳＡ［Ｊ］．ＪＣｌｉｎＬａｂＡｎａｌ，１９９７，１１（７）：３１５—３２３．

［６］ＬｅｆｅｖｅｒＪＣ，ＢｅｒｔｒａｎｄＭＡ，ＢａａｒｉａｕｄＲ，ｅｔａ１．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅａｐｔｉａｅｎ—ｚｙｍｅｉｎｎｎｕｎｏａｓｓａｙｓｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓＧａｎｄＭｔｏｔｒｅｐｏ—ｎｅｍａｐａｌｌｉｄｕｍｉｎｓｙｐｈｉｌｉｓ［Ｊ］．ＪＣｌｉｎＭｉｃｍｈｉｏｌ，１９９０，２８（８）：１７０４—１７０７．

［收稿日期］２００５－０９－１９［修回日期］２００６－０１－２４

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