严格厌氧菌菌种保藏方法
更新时间:2024-02-27 17:01:01 阅读量: 综合文库 文档下载
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严格厌氧菌菌种保藏方法
发表人:吴小月,发布时间:10-01-11 以下为本实验严格厌氧细菌的保藏方法,如果是兼性厌氧菌可参照好氧菌保藏方法保藏。 一、厌氧细菌的甘油保藏方法:
1、 厌氧甘油的制备: 厌氧瓶或厌氧管中放置一定量的甘油,甘油的量根据需要加入,不
要多加,因为厌氧甘油制备好以后不能反复灭菌,反复灭菌甘油会变性而呈黄色,且有一股芳香味道。加入终浓度为0.04 %的 L-cysteine和 1 %的5 %的 N2S母液。往厌氧瓶中通N2,通气时间和配制培养基时时间相同。盖上塞子和盖子。121 ℃, 20 min 灭菌后备用。
2、 取新鲜菌液(对数期),在通N2 的情况下,用针筒和针头往有菌液的厌氧管中加入终
浓度为15-20 %的厌氧甘油,再通一会N2,目的是赶走在转移甘油过程中带进去的O2。盖上塞子和盖子,混匀,冻于-80 ℃。
3、 活化:用针头和针头吸取一定甘油保藏的菌液,加到培养基当中,加的量一般要多于1 %,
因为厌氧菌的生物量比较小,一般2到5 %左右。目测加完甘油菌液的培养基是否浑浊,并作记录。如果加入的菌液太多,造成一开始培养基就比较浑浊,会干扰我们对菌是否生长的判断,而且甘油太多也会抑制菌的生长。
二、厌氧细菌的冷冻干燥保藏方法:
1、厌氧牛奶的制备:先配置 10 % Difco Skim Milk(BD)的母液。和厌氧甘油配制方法一样,转移到厌氧瓶中,加入加入终浓度为0.04 %的 L-cysteine和 1 %的5 %的 N2S母液。通N2,盖上塞子和盖子。113 ℃, 15 min 灭菌后放置过夜,于4℃ 放置备用。放置过夜后牛奶不结块,溶液均匀,不沉淀才可以用,否则牛奶变性,需要重新配制。同样,厌氧牛
奶只能灭菌一次,反复灭菌牛奶会变性。
2、准备冷冻干燥用的安瓿管,管口要用棉花封住,棉花缠在牙签上,这样拔出比较方便,灭菌并烘干后备用。
3、新鲜菌液离心,尽量除去上清,根据菌量加入10 % 的厌氧牛奶,一般大拇指盖大小的菌体能做15-20支安瓿管左右。将菌体打散后,迅速分装到安瓿管中,每支安瓿管 0.2 ml,并用棉花封住管口,防止杂菌污染。
4、将分装好菌液的安瓿管竖直放置,可以用橡皮筋扎成捆,4℃ 冰箱预冷 30 min;然后-20 ℃ 预冷1 hour; -80 ℃ 预冷2 hours;最后放入真空干燥机,-80 ℃ 冷冻干燥过夜。冻干后菌体和牛奶混在一起,呈粉末状。
5、抽真空,封口,标记。封口后的安瓿管内呈真空状态,可在4 ℃保存。
6、活化:用镊子夹住安瓿管底部,另一端用酒精灯外焰灼烧30 Sec,在灼烧部位滴几滴水,玻璃会因突然受冷而出现裂痕。用另一支镊子敲打裂痕部位至玻璃破裂。迅速向安瓿管中通入N2,吸取0.5ml的培养基注入管中,轻轻搅动几下并放置1-2 min,待粉末溶解后,2-5% 接种量接入到培养基中。注意:培养基可能会因为牛奶变浑浊,要做好观察和记录,以判断菌株是否长出。
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