流式细胞仪常用的几种检测方法

1) 4) 2 1) 流式细胞仪常用的几种检测方法（转载）

一、测定用乙醇固定的DNA的含量 1、培养细胞的DNA含量的测定 制备单细胞悬液于200μl的PBS缓冲液中；

加入2ml预冷的70%乙醇，4℃保存；

附:细胞固定的一般步骤

取单细胞悬液1～2×106个细胞于PBS（PH=7.2）缓冲液中；

2) 300g离心5分钟，弃上清，反复两次； 3) 重悬细胞于0.5ml PBS缓冲液中；

将细胞悬液放置于2～3ml冷70%乙醇中，混匀，保存于4℃，至少30分

钟。在4℃条件下可保存2~3周。

注意：

2 根据实验的要求，固定剂也可选用1～3%多聚甲醛； 2 将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至0～4℃；

细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓度缓慢增加，

并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）。 2 300g离心5分钟，去上清，再重悬于400μl PBS中； 2 显微镜下观察，若有明显的黏附，须再用筛网过滤；

2 加入PI（含Rnase），避光孵育30分钟；

2 上机检测。 2、新鲜组织的DNA含量的测定

1) 用200mg湿重组织用机械法制成单细胞悬液；

2) 500g离心5分钟；

3) 弃上清，重悬于10ml染色-去污剂中； 4) 再过滤，用200目的筛网或70~80μm的筛网过滤；

5) 上机检测。 3、石蜡包埋组织切片的DNA含量的测定

从石蜡包埋切取切片50 μm厚，2~3片，制成单细胞悬液；

2) 用PBS缓冲液洗涤，500g离心5分钟，弃上清；

3) 加入PI液1ml室温避光30分钟； 4) 调整细胞浓度为1×106/ml；

5) 上机检测。 二、细胞凋亡检测及相关分子检测

1、细胞DNA含量分布（由细胞DNA降解方式检测细胞凋亡）

2 收集已固定的单细胞悬液约5×105~1×106/ml；

2 离心除去固定液，3ml PBS重悬细胞; 2 1500rpm离心，5分钟 ，弃去PBS； 2 加PI染液1ml，室温避光20分钟；

2 调整细胞浓度5×105/ml；

2 上机检测。

2、磷脂酰丝氨酸外翻分析检测细胞凋亡

1) 常规制备单细胞悬液,用PBS洗两次.(若为全血要先

溶 血),取约5×106个细胞，1500rpm

离心,弃上清,用400μl 1×Binding Buffer重悬；

2) 分成a、b、c、d、e五管，每管约1×106个细胞

a) 阴性对照，不加任何试剂；

b) 阳性对照,加2%多聚甲醛固定30分钟,加AnnexinV 5μl,室温10min,用1×Binding Buffer洗一次,弃上清再加190μl 缓冲液、10μl PI避光15分钟

c) 加10μl PI，避光孵育15分钟； d) 加5μl AnnexinV液，室温避光孵育15min； e) 加10μl PI和5μl AnnexinV液，室温避光孵育5min；

3) 每管各加400μl 1×Binding Buffer。

4) 上机检测。

注意 a. 操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞；

b. 操作时注意避光；

c. 反应完毕后尽快检测，最好在一小时内检测。

3、用单克隆抗体APO2.7检测细胞凋亡

1) 放置0.5~1×106个细胞到试管中；

2) 室温离心200g，6min；

3) 弃上清，加入100μl冷的（4℃）在PBSF溶液中含100μg/ml的digitonnin，

轻轻地重悬细胞，在冰上孵育20min；

4) 加入2ml冷的（4℃）PBSF液，室温离心200g，6min；

5) 弃上清，加入20μl PE标记的Apo2.7 单克隆抗体和80μl PBSF液，用

vortex轻轻震荡，室温避光孵育15分钟；

6) 加入2ml PBSF液，室温离心200g，6min； 7) 弃上清，加入1ml PBSF液重悬细胞； 8) 避光保存，直到流式细胞仪检测。

PBSF：含2.5% FCS（v/v）和0.01%NaN3（w/v）的PBS。

三、用流式细胞术进行DNA周期分析 1、方法：同DNA含量检测

2、注意：

单细胞浓度应约106/ml，以免影响检测的CV值和检测结果；

制备完成后的标本应用光学显微镜检查其质量（如细胞是否聚集或过多碎片），以保证得

到足够的细胞含量；

醛类固定会影响PI与核酸的结合。

四、免疫荧光标记法 1、细胞膜上的免疫荧光检测法

间接标记法

1) 制备单细胞悬液；

2) 细胞计数，取出1×106个细胞于试管中； 3) 用台盼蓝染色计活细胞数，要求活细胞数 >90～95%；

4) 在试管中加入一抗，（剂量按照说明书的要求），孵育30～60分钟；

5) PBS洗涤1～2次，1500rpm，离心3分钟，弃上清；

6) 加入二抗，孵育20～30分钟；

7) PBS洗一次，1500rpm，离心3分钟，弃上清;

8) 加300μl PBS，上机检测(若不能及时上机检测，可加1ml 1%多聚甲醛

固定，可放置1周)。

直接标记法 ①～③同间接标记法

④在试管中加入荧光标记的抗体，混匀，孵育30分钟； ⑤用PBS洗2次，1500rpm，离心3分钟，弃上清;

⑥加300μl PBS(PH=7.4)，上机检测。

2、细胞膜内的免疫荧光标记法

间接免疫荧光标记法

1) 取已制备好的单细胞悬液，用1～3%的多聚甲醛固定30分钟（也可4℃

保存过夜）；

2) 用PBS洗两次，弃上清；

3) 细胞膜打孔，加入0.1%皂素 200μl，室温10分钟；

4) 用PBS洗涤两次；

5) 加入第一抗体，室温30～60分钟，或4℃过夜，同时须设阴性对照或同

型对照管；

6) 用PBS洗涤两次；

7) 加入二抗（荧光标记的抗体）室温20分钟，避光；

8) 用PBS洗涤1～2次，弃上清； 9) 重悬细胞于500μlPBS中，上机检测。

直接荧光标记法

①～⑤同间接荧光标记法；

加入荧光素标记好的抗体，避光30分钟（同时做同型对照管）；

用PBS洗涤１～２次，弃上清； 加300μl PBS上机检测。 细胞膜上及细胞内双标记法（直标法）

1) 取出已制备好的未固定的单细胞悬液1×10 6个细胞于试管中；

2) 用PBS洗涤两次；

3) 加入用荧光素标记的抗体来标记细胞膜上的抗原，同时加上阴性对照管，

室温孵育20分钟；

4) 在试管中加入1％～3％多聚甲醛1ml，固定30分钟；

5) PBS洗涤两次1500rpm 3分钟，弃上清; 6) 打孔，加入0.1％皂素200μl室温10分钟;

7) 用PBS洗涤两次，弃上清;

8) 加入用荧光素标记的抗体，标记膜内的抗原（标记膜内的抗体的荧光素

的颜色与膜上标记的荧光素的颜色务必不相同）室温20分钟孵育;

9) 用PBS洗一遍弃上清； 10) 用300μlPBS重悬细胞，上机检测

五、流式细胞术中的几点注意事项：

1、对照组的设置：

在流式细胞术中所测得的量都是相对值，不是绝对值。如需知道绝对值时必须

设置对照组样品。对照组样品包括有阴性对照和阳性对照。

（1）、阴性对照的设置

2 在实验过程中，如做间接标记法，可设置与一抗无关的实验，即在实验中不

加一抗而只加上带有荧光标记的第二抗体作为阴性对照管，作为阴性对照。 2 在实验过程中，假设做直接标记法，可设置理论上的阴性细胞作为阴性对照管，实验过程及步骤与实验组务必相同。（做间接标记法时，同样也可同时设置“阴性细

胞”的阴性对照管作为阴性对照。

2 在实验过程中，假设做直接标记法，可将实验组细胞，取一管，加上与实验

抗体所标记的荧光颜色相同的同型对照来作为阴性对照。

（2）、阳性对照的设置：

在实验过程中如涉及到表达缺失或减少的实验，应设置阳性对照组，其设置方法与阴性对

照设置相同。 2、几点建议：

1) 在实验过程中，在保证实验的科学性和准确性的基础上，应尽量减少实验工序和过程。由于间接标记法的工序多，实验过程长，如再加之操作的不熟练，细胞更容易丢失和受损，而造成实验结果的误差。因此，在条件允许的范围内，建议尽量做直接标记

法而不去做间接标记法，以保证实验的真实性和准确性。

2) 建议送检细胞一定要足够量，一般要求1×106个细胞。不要过少。因为，如细胞太少检测时样本流量相对会增大从而影响变异系数，结果也不可信。细胞量也不宜

过多，因细胞量太多加入的抗体或染料相对不足，结果也由此受影响。

3) 同一种细胞需同时做双标记时，须做双标记的同型对照，且两种抗体所标记

的荧光颜色务必不同。

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