利用CTAB - 酸酚法提取棉花组织总RNA - 蒋建雄

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??棉花学报??CottonScience????2003,15(3):166~167

利用CTAB??酸酚法提取棉花组织总RNA

蒋建雄,张天真

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(南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室南京农业大学棉花研究所,南京210095)摘要:通过借鉴植物DNA的CTAB提取方法,结合总RNA的LiCl沉淀法,摸索出一套适合于棉

花组织总RNA提取和纯化的技术??CTAB??酸酚法。该方法与异硫氰酸胍法或冷酚法等相比具有更简便、得到的棉花组织总RNA完整性好和纯度高等优点。

关键词:棉花;RNA提取;CTAB??酸酚法中图分类号:S562.035.3??????文献标识码:A文章编号:1002??7807(2003)03??0166??02

性,且多酚、色素等物质在提取过程中很容易被氧化导致RNA变褐,影响RNA用于进一步的分子操作,因此能否在提取过程中尽量去除这些干扰物质是获得高质量棉花总RNA的关键。目前应用于棉

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花总RNA提取的方法主要有异硫氰酸胍法、冷酚法、SDS??酸酚法等,但在实际操作中这些方法用于棉花花药、胚珠、纤维细胞总RNA提取的效果并不十分理想,其原因主要是它们不能有效地消除多糖、脂类等的影响,抽提时界面上常残留有杂质,需要进行反复抽提才能达到要求,不仅所需时间长,而且也影响总RNA的完整性和得率。最近还出现了一种高盐高pH值提取法,比较适合于含酚类、糖类物质丰富的棉花胚珠总RNA提取。Paterson等发展的CTAB法是一种目前广泛用于棉花总DNA提取的方法,其步骤简单、提取的DNA含杂质少。本文通过借鉴棉花总DNA的CTAB提取法,提出了一种可快速获得高质量棉花总RNA的新方法。

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ExtractionofTotalRNAinCottonTissueswithCTAB??acidicPhenolicMethod

JIANGJian??xiong,ZHANGTian??zhen

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(NationalKeyLaboratoryofCropGeneticsandGermplasmEnhancement,CottonResearchInsti??tute,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China)

Abstract:BasedontheCTABextractionmethodforcottontotalDNAandtheLiClprecipitationmethodofRNA,anewmethodsuitableforcottontotalRNAextraction,namedCTAB??acidicpheon??licmethod,wascomeintobeing.ThemethodcouldproducecottontotalRNAwithhigherpurityandintegralityinashortertimefromdifferenttis??suesofcottonthanotherconventionalmethods.Keywords:cotton;RNAextraction;CTAB??acidicpheonlicmethod

完整性好和纯度高的总RNA是进行分子生物学研究的前提和基础。棉花各种组织特别是花药、胚珠、纤维细胞内常含有丰富的多糖、脂类以及多酚、色素等次生物质,而这些物质在RNA提取过程中很难去除干净。但多糖、脂类的存在不仅会使RNA的溶解度降低,还可以抑制许多工具酶的活

收稿日期:2002-10-24;联系人cotton@mail.njau.edu.cn基金项目:国家重大基础研究发展规划项目(2002CB111301)作者简介:蒋建雄(1972??),男,博士后.

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1??材料和方法

1.1??材料

叶片、花药、纤维细胞等材料均采自南京农业大学网室种植的棉花植株,下胚轴、根来源于室内培养的高度约10cm的幼苗。将这些材料贮存于??80??超低温冰箱中备用。

所用试剂和塑料耗材均需预先用0.1TPC处理24h以上,然后高温灭菌;研钵等物品则经240??高温烘烤12h左右,避免RNase的污染。1.2??方法

1)取1g左右的棉花新鲜幼嫩组织,加液氮充分研磨呈粉末状,及时转移到10ml离心管中;2)加5ml的提取缓冲液(1.4mol??LNaCl,0.1

??1??1

mol??LTrisHCl,pH8.0,20mmol??LEDTA,2%CTAB,2%PVP,1%????巯基乙醇),振荡混匀,65??水浴约20min,中途混和2~3次,使RNA充分析出;3)加0.6倍体积的氯仿,充分混匀,然后冰浴静置10min;4)4??,8000rpm离心20min,将上清液转移到另一新10ml离心管中;

??1

5)加入1??3倍体积的8mol??LLiCl溶液,混匀,??1

3期??????????????????????????蒋建雄等:利用CTAB??酸酚法提取棉花组织总RNA

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冰浴静置6~8h;6)4??,8000rpm离心20min,弃去上部溶液,沉淀用70%乙醇洗涤1次,并转移到2ml离心管中;7)5000rpm离心5min,吸去乙醇溶液,将沉淀真空抽干;8)加2ml的H2ODEPC溶解沉淀,并将溶液分装入两个2ml离心管中;9)每管中加0.8ml的酸酚??氯仿(1??1),混和均匀,然后室温静置5min;10)4??,12000rpm离心20min,将上清液转移到另一新的2ml离心管中,再重复步骤(9)~(10)1~2次;11)上清液加0.8ml氯仿抽提1次;12)上清液加入1??10倍体积3mol??LNaAc(pH5.2)溶液和1倍体积预冷的异丙醇,??20??放置过夜;13)4??,12000rpm离心20min,收集RNA沉淀;14)沉淀用70%乙醇洗涤2次,真空抽干后加入50??l的H2ODEPC,充分溶解,取1??l电泳检测RNA质量,其余RNA于??80??保存。

??1

图2棉花????mannosidase基因的RT??PCR图谱Fig.2TheRT??PCRpatternofcotton????mannosidasegene

2.2步骤简单快速,提取的总RNA纯度和得率高

提取缓冲液中的CTAB是一种较强的去污剂,对蛋白的变性效果明显强于SDS。同时,先用LiCl选择性沉淀总RNA,然后再用酸酚??氯仿抽提使水相中残留的少量DNA溶于有机相,从而可以最大限度地消除总RNA中的DNA。提取缓

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冲液中高浓度的NaCl有利于去除多糖污染,LiCl也可以使部分多糖留在溶液中而不随RNA

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沉淀下来,这样极大地降低了沉淀中多糖的含量。我们测定了不同样品的A260??A280,其数值均在1.90~2.0左右,基本上没有蛋白和DNA等杂质的污染。但当采用较大的纤维细胞作提取材料时,其总RNA中仍有少量多糖物质存在。与其它现有的棉花总RNA提取法相比,本方法所需用酚??氯仿抽提的次数明显减少,一般情况下抽提2次后分界面即很干净,不需反复纯化,这样保证了RNA的完整性和得率,整个提取工作也可在1天内完成。本方法中的第一步抽提只使用氯仿,可以避免总RNA因多酚、单宁等次生物质被氧化而变褐。此外,提取缓冲液中省去了异硫氰酸胍、盐酸胍等昂贵试剂,在步骤(6)中的上部溶液若直接加入0.6倍体积异丙醇还可同时得到高质量的基因组DNA,降低了试验成本。

参考文献:

[1]侯??磊,肖月华,李先碧,等.棉花洞A雄性不育系

花药发育的mRNA差别显示[J].遗传学报,2002,29:359??363.

[2]刘长军,孟玉玲,侯嵩生,等.棉花法呢基焦磷酸合酶cDNA克隆、序列分析及其在种子发育过程中的表达特征[J].植物学报,1998,40:703??710.

[3]夏兰芹,郭三堆.棉花RNA的快速提取方法[J].棉花学报,2000,12:205??207.

[4]徐亚浓,王学德,蒋淑丽,等.排除棉酚等干扰提取棉纤维细胞RNA方法的研究[J].棉花学报,2002,14:143??146.

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[6]FANGG,HammarS,GrumetR.AquickandinexpensivemethodforremovingpolysaccharidesfromplantgenomicDNA[J].Biotechniques,1992,13:52??56.[7]SUX,GiborA.AmethodforRNAisolationfrommarine

macro??algae[J].AnalBiochem,1988,174:650??657.????

2??结果与讨论

2.1??总RNA的完整性好

利用此方法分别提取了棉花根、下胚轴、幼叶、花药和纤维细胞中的总RNA,取1??lRNA溶液与10??l的变性加样Buffer混和,在1.2%非变性琼脂糖凝胶上电泳分析,RNA一般呈现2条或4条rRNA带,其中18S和28S两条rRNA带清晰,且28S亮度比18S大,这表明该方法提取的RNA完整性很好(图1)。

图1棉花组织中的总RNA图谱Fig.1ThepatternofcottontotalRNAr:根h:下胚轴l:叶a:花药f:纤维细胞r:rooth:ypocotyll:leafa:anther;f:fibriccells

取1??g经DNaseI消化处理后的总RNA逆转录合成cDNA第一链,然后取0.5??l用作RT??PCR的模板。PCR所用引物为一对扩增由本实验室克隆的棉花组成型表达基因??????mannosidase基因(GenBankaccessionnumber:AY039663)的特异引物ManF和ManR,扩增结果如图2所示。该cDNA基因全长约2.7kb,而ManF和ManR的PCR产物位于基因上游5??端100bp至485bp之间,这也说明所提取的总RNA很完整,完全可用于进一步的分子生物学研究。

本文来源:https://www.bwwdw.com/article/rx02.html

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