斑马贻贝

生物11101班 1105151014 张佳会 1105151015 李彬煜 翻译

斑马贻贝(Dreissena polymorpha)生物体内积累人类的水源性原生动物:对水中生物监测

M. Palos Ladeiro, D. Aubert, I. Villena, A. Geffard, A. Bigot

关键词：隐孢子虫 肠梨形鞭毛虫 刚地弓形虫 生物体内积累 亲器官性 斑马贻贝

摘要：隐孢子虫，肠梨形鞭毛虫和刚地弓形虫是普遍存在的病原菌，它们的水传播方式已经在

很大程度上证明了。因为它们在不同的河道中被发现，它们和水中生物的相互作用就成为可能。河道生物监测中的原生动物监测目前是建立在大型水过滤基础上的。斑马贻贝Dreissena polymorpha是生态毒理学研究中精选的生物模型，它已经被用来检测河道中的化学污染了。在目前的研究中，斑马贻贝是一种新的用于检测水中原生动物污染的工具。在活的有机体内暴露是在实验室中进行实验的。斑马贻贝被暴露在不同原生动物浓度中一个星期。原生动物检测是通过Taqman实时qPCR实现的。我们的实验证实了贻贝中的隐孢子虫、肠梨形鞭毛虫和刚地弓形虫的卵囊的积累与周围环境的污染是成比例的，在肌肉组织中观察到刚地弓形虫普遍存在的重要意义。就我们所知，这是第一个通过斑马贻贝证明刚地弓形虫卵囊在生物体内积累的研究。通过这个研究得出的结论是斑马贻贝在揭露周围环境中的生物污染的地位更加显著，这样也可以被用来作为一种新的有效的水体卫生生物监测手段。

1. 介绍

隐孢子虫的某些种和肠梨形鞭毛虫的某些种是主要的与水性爆发有关的原生动物，其90%都与水有关。在欧洲，一项由欧洲疾病预防与防控中心发布的流行病学研究显示从2006~2009年隐孢子虫病例是持续增长的，在2009年，此数据为8016例。这项数据在0~4岁的婴儿中有较高的比率，5~14岁儿童的比率紧跟其后。在过去的四年中，梨形鞭毛虫病（贾第虫病）病例是稳定的，在2009年其总数为93375例。但是作者同样也强调了在一些国家是没有通报病例的，这导致结果不是那么可靠。在美国，每年有超过2700例和3500例以隐孢子虫病和贾第虫病为原因在医院挂号，并分别花费了4500万美元和3500万美元。虽然有效的免疫系统阻止了寄生虫引起疾病，刚地弓形虫感染仍是一种常见的人类寄生虫感染病。弓形体病有两种传播方式：一种水平传播渠道，人畜共患病，即通过食源性寄生虫感染，这可以代表50%的传播；另一种垂直传播方式是从母亲传播给胎儿。感染可能是由环境的原生动物形式如卵囊或由组织形态如囊引起的。一项最近的研究显示卵囊感染是一种重要的未被认可的先天的弓形虫病来源。它导致了弓形虫病的发病率和严重程度更高，而不是囊组织感染。各种有意义的全球性爆发都与水中的刚地弓形虫有关。在美国，像弓形虫这样的水传播的原生动物病例每年有将近9000例，并且总的直接医疗花费达3.98亿美元。

水生动物检测目前是以过滤大量水为基础的。Karanis等人报道了最新一项针对弓形虫的水质分析的综述。他们列举了几种方法，从样本筛选到分子工具和生物测定。这些方法对水监测进行了优化，得到相对比较纯净的基质。这样，结果就不仅是基于采样中原生动物的发病率，也与选择检测原生动物的方法有关。然而，在结果中原生动物缺乏并不意味着它在河道中也是缺乏的。无论选择的分析方法是什么，水质分析都是以大量水为基础的，是昂贵的，是不精确的，是耗费时间的。在河道中，原生动物是受制于水的特性的，水的特性可以影响卵囊（囊肿）运输的动力学特性。事实上，稀释条件和物化参数可以影响病原菌的时空分布。Shapiro等人最近强调刚地弓形虫的卵囊和替代的附件在海洋和河口水域中更大，这主要是

盐度的改变引起了刚地弓形虫卵囊表面电荷的变化。更大粒子集合的结果可能对滤食性动物如水生无脊椎动物更有利。

根据化学污染物，各种生物检测程序都是利用水生无脊椎动物来揭露水质污染的。像滤食性动物这样的生物直接在它们的组织中富集大量的污染物。生态毒理学研究中已经使用水生无脊椎动物如斑马贻贝作为淡水生态系统的哨兵物种。事实上，斑马贻贝是很容易收集并在实验室中供养的。他们是定栖的，并且有一个高的过滤率使有机和无机的污染物有明确的分界点。为了证明新的污染物类型，一种新的方法比如用无脊椎动物的生物体内积累可以被用来作为一种新的河道中原生动物检测的工具。由于水生无脊椎动物已经被经常应用在生物检测程序中，所以它们也能反映生物污染的水平。隐孢子虫和肠梨形鞭毛虫在斑马贻贝的生物体内积累已经在早先的研究中展示过了。虽然文献中没有关于刚地弓形虫在斑马贻贝中生物体内积累的数据，但在海洋贻贝（紫贻贝Mytilus galloprovincialis）和牡蛎（太平洋牡蛎Crassostrea virginica）中的生物体内积累已经被展示了。

本研究的目的是双重的：首先，我们试图强调斑马贻贝中三种原生动物每种病菌在实验室条件下同时在活的有机体内生物积累到560个卵囊（囊肿）的能力。这样，刚地弓形虫的积累就可以与其它两种病菌相比较了。因为隐孢子虫和肠梨形鞭毛虫在斑马贻贝的积累是众所周知的。其次，单一的体内暴露用两种病菌浓度对之前的结果进行了完善：一种环境浓度是每个贻贝每天20个卵囊（囊肿）和一种10倍的浓度即每个贻贝每天200个卵囊（囊肿）来指定出一个剂量------反映这三种病菌之间的关系。然后，使用已经积累比例最高的病菌，研究其亲器官性。肌肉作为血淋巴库，鳃作为与环境接触的第一结构，消化腺作为异型生物质吸收的主要部位，在不同采样时间对其进行分析可以了解贻贝中原生动物的运输路径。

2. 材料与方法 2.1暴露拟定

准备的纯净的隐孢子虫卵囊和肠梨形鞭毛虫卵囊是从水运有限公司（新奥尔良，LA，美国）购买的，然后在4℃条件下保存直到使用。刚地弓形虫卵囊是由J.P. Dubey（美国农业部，贝茨维尔，美国）慷慨给予的。从猫的粪便中得到的卵囊被变形的ME49Ⅱ基因型用实验方法感染了。它们被保存在含2％H2SO4的4℃水溶液中直到使用。20~25mm长的贻贝是在黙兹河东部海峡（北纬48°45′26.13″，东经5°36′14.51″）的科梅西尔（法国东北部）收集的。它们在暴露和分析前会被放在大容器中适应两个星期的环境，以确保它们在采样时和第一天（D0）暴露时体内是没有原生动物的。这些大容器中充满了Cristaline Aure` le (Jandun, France)，14+1℃的恒温饮用水和受控制通气量（传导性427+46 mS/cm;硝酸盐, 10+3.5 mg/L;亚硝酸盐, 0mg/L;铵盐, 0 mg/L）。贻贝是一周任意两次喂养的，喂食的是蛋白核小球藻和斜生栅栏藻两种微藻的混合物。

在第一个实验中，贻贝被随机分为2组，每组35个样本。每组放在一个含3L泉水的5L的容器中。每天每个贻贝曝露在每种原生动物560个卵囊中，以便比较三种病原菌各自的累积率，进行7天。在第二个实验中，贻贝被随机分为14组，每组50个样本。每组放在一个含4.5L泉水的15L的容器中。每天每个贻贝暴露在20~200个卵囊（囊肿）的条件下，以每种原生动物单一暴露。这两组实验都进行了重复试验。

对于这两种类型的曝光，用4池每池3个贻贝或器官进行了分析。在第一个实验中，在7天的暴露后每组收集12个贻贝来计数整个软组织中的寄生虫。在第二个实验中，贻贝（4池中的3个器官）的肌肉、鳃、消化腺在1,3和7天后被解剖来逐器官的计数寄生虫。所有样本都是以相同的技术对待的，寄生虫的计数是通过Taqman实时PCR（见下文）实现的。当原生动物DNA在Taqman实时PCR中没有检测出来时，在结果的统计分析中会被记为“零”。

2.2样本纯化

解剖后立即将组织（完整的生物体或器官）和稀释10倍的10倍的胰蛋白酶(SigmaeAldrich, Saint-Quentin Fallavier, France)研磨，以便使组织消化吸收和促进卵囊（囊肿）的提取。样品在37℃

下培养90分钟。将悬浮液在1250*g的条件下离心5分钟，经洗涤后保存在-80℃条件下直到原生动物浸出。卵囊（囊肿）的壁是一个复杂的保护屏障，它可以使原生动物在不利的环境中有长期生存的能力。在DNA提取前，一系列由-80℃低温冰冻和95℃融化组成的热休克周期循环重复6次，以打破囊壁来提取原生动物DNA。然后，给根据制造商（Bio-Rad, Marnes-la-Coquette,France）的说明用InstaGene Matrix工具从样品中提取DNA。简单的说，样品用37Hz（超声波88155）的超声波处理1分钟，然后在92*g的条件下离心1分钟。得到的基质中的小球在56℃条件下培养35分钟，全速涡旋处理10秒。在99℃,8分钟的沸腾细胞溶菌步骤后，基质吸收细胞溶菌产物可能会影响PCR扩增过程。样品在11093*g条件下离心3分钟后将上层清液小心转移到新的管子中然后储存在-80℃条件下直到用PCR检测。

2.3寄生虫量化

寄生虫的检测是在一个Chromo4检测器（Bio-Rad）中由Taqman实时qPCR得到实现的。引物、探针和基因库编号在表一中总结了。为了确定在我们的样品中原生动物DNA复制的数量，有一个已知的积极控制DNA浓度的由1:5稀释到10倍来建立的参考曲线。qPCR的结果与参考曲线中数据比较可以确定我们样品中的DNA浓度。

qPCR扩增是在下述的混合物中按照制造商的说明进行的：被添加到20μL的混合液中，混合液中包含2倍iQ超混合液（Bio-Rad），每个长400nM得引物,每个长200nM的探针。没有添加模板控制。DNA聚合酶在最初的95℃的变性步骤后被激活了。然后，样品在95℃，15秒和60℃,1分钟的环境中进行45个周期循环。每个样品重复进行了统计分析。

表一：通过Taqman实时PCR进行斑马贻贝中原生动物检测所用的引物和探针

2.4统计分析

从对照组和实验组得到的数据是用非参数的ManneWhitney U-测试进行比较的。所有统计学检验是用Windows v10.0环境下的SPSS软件进行的。当p < 0.05时认为差异是显著的。

3结果

3.1. 同时暴露实验

暴露一个星期后，对4池中的3个贻贝进行解剖并用同样的方法处理。然而，在各池中发现了高变异。实际上，在贻贝组织中检测到平均有1.4±1.5个的隐孢子虫卵囊和8.7±12.2个的肠梨形鞭毛虫囊肿，而在整个有机组织中发现刚地弓形虫卵囊有31.2±29.1个。所有的刚地弓形虫池和四分之三隐孢子虫池中都包含原生动物DNA。对于肠梨形鞭毛虫，只有二分之一池中发现有DNA，并且这个结果从统计角度来看毫无意义，尽管它的DNA数量高于隐孢子虫。

图一：在实验室中每贻贝每天暴露在560卵囊（囊肿）的同时暴露实验中（N=4池的3个贻贝），暴露7天后斑马贻贝中发现的卵囊（囊肿）数量的平均数（和标准偏差）（对数刻度）

3.2 单个暴露实验

第二个实验室实验用一个环境浓度的病原体（20卵囊每贻贝每天）和一个十倍浓度（200卵囊每贻贝每天）的病原体来进行。在一个星期的暴露后，除了隐孢子虫在低浓度中没有检测到，其余条件下都在贻贝组织中发现了原生动物DNA。尽管如此，在暴露在肠梨形鞭毛虫和刚地弓形虫卵囊后，一种相关的关系被注意到（图2）。实际上，一周后在20卵囊（囊肿）每贻贝每天的低浓度中发现平均有0.1±0.3个肠梨形鞭毛虫囊肿和0.2±0.4个刚地弓形虫卵囊，然而在200卵囊（囊肿）每贻贝每天的浓度中发现有平均0.7±0.7个囊肿和22.4±30.3个卵囊。与第一个实验相似，每组之间的变量在表2中呈现。与同时暴露实验相反的是，肠梨形鞭毛虫DNA在高暴露条件下在所有池中都有发现，而隐孢子虫只在其中两个组发现。

表2：能发现原生动物DNA的组的数量/用于同时或单个暴露分析的总的组的数量（1池=3个贻贝或器官）

图2：在实验室中每贻贝每天暴露在20和200卵囊（囊肿）的单一暴露实验中（N=4池的3个贻贝），暴露7天后斑马贻贝中发现的卵囊（囊肿）数量的平均数（和标准偏差）（对数刻度）

3.3在单个暴露实验后刚地弓形虫卵囊的器官定位

因为暴露于隐孢子虫和肠梨形鞭毛虫导致非常低的贻贝生物体内积累，我们集中到我们的刚地弓形虫和高剂量暴露的器官定位实验。

仅暴露一天后在所有器官测验中都明显了发现原生动物DNA（图3）。在第一和第三天的抽样中检测到原生动物DNA在鳃和消化腺中所占比例很明显高于对照组。对这两个器官，尽管很容易观察到增长的趋势，但高标准偏差（表3）使我们展示的第七天采样的相关结果出现异常。

图3：在暴露于200个刚地弓形虫卵囊每贻贝每天的浓度中1,3,7天后，在贻贝器官中发现的卵囊（囊肿）数量的平均数（和标准偏差）（对数刻度）

表3：能检测到刚地弓形虫DNA的组的数量/用于每贻贝每天单一暴露在200个刚地弓形虫卵囊实验分析的总的组的数量

4讨论

许多作者强调海洋无脊椎动物可以在它们的组织中逐渐增加隐孢子虫卵囊和肠梨形鞭毛虫囊肿的数量。因为许多海洋生物是人们的食物资源，所以海洋生态系统被大量的研究。对人们来说原生动物在海食品中存在可能成为一个潜在的危险来源。在淡水的水道中，文学作品中有更少可用的信息。不管怎样，原生动物的在生物体内的累积使生物失去了经济利益却可能是一个揭示河道中生物污染的机会。斑马贻贝已经应用在了实验室和野外试验。我们的研究结果完善了现有的淡水数据因为我们用一个环境浓度和两个较高剂量来描述斑马贻贝累积隐孢子虫和肠梨形鞭毛虫的能力。我们也强调刚地弓形虫能在斑马贻贝中生物累积。我们的研究强调我们用于刚地弓形虫和肠梨形鞭毛虫的技术的灵敏度，原生动物在像20卵囊（囊肿）每贻贝每天的低浓度环境中被发现，这是特别有趣的水生物监测。此外，我们的结果指出在贻贝组织中刚地弓形虫比其他原生动物浓度更高。不论什么模式的暴露（单一暴露或同时暴露），大体上检测出的刚地弓形虫DNA浓度都高于肠梨形鞭毛虫和隐孢子虫DNA。然而，在最后的暴露中发现的浓度在与200（尽管不是所有的器官都考虑）或560卵囊（囊肿）暴露的浓度近乎一样。这个结果可能是由于（i）如果它们的环境太恶劣，饱和的贻贝会停止进食。（ii）基质的影响（iii)寄生虫的不同的传播方式的竞争。隐孢子虫和肠梨形鞭毛虫是水平传播的（从一个到另一个），而刚地弓形虫可以水平和垂直地传播。在寄生虫利用不同的传播方式甚至在它们在不同的宿主组织中生活，竞争就在寄生虫之间产生了。这些假说讲必须用进一步的实验来证实（i)用一个大范围的原生动物浓度（ii)用简化的基质（iii)用单个和同时实验的合并暴露

在任何暴露下都只检测到低浓度的隐孢子虫。隐孢子虫是一个只有4—5μｍ大小的小型生物，而刚地弓形虫和肠梨形鞭毛虫比它大三倍。作为滤食性生物，斑马贻贝可以在水中根据它们的食物喜爱将微粒分类并且挑选出15到40μｍ的微粒。尽管如此，在贻贝组织中检测出的三种寄生虫的低浓度DNA可能是由于缺乏切合实际并且灵敏的方法来提纯和检测原生动物DNA。最近的研究已经评估了环介导等温扩增法（LAMP）对水中刚地弓形虫的检测。LAMP实验用了一组4个特定的引物，这种引物可以在目标DNA中识别6种不同的序列。这种方法似乎对水中刚地弓形虫进行快速检测非常灵敏并且灵敏度高于qPCR。此外，环介导等温扩增技术对隐孢子虫和肠梨形鞭毛虫的检测也有所评估。这将会使评估环介导等温扩增检测法在贻贝中变得很有趣。

在2007年，Downey和Graczyk提出了一个实验，其中对不同的组织收藏进行测验来提高从美洲牡蛎组织恢复隐孢子虫卵囊的能力。组织样品用二乙醚均匀和纯化，用免疫磁性分离法隔离，用免疫荧光检测法量化。当样品中添加卵囊时，最有效的方法是在分离和纯化过程中血淋巴与整个组织分离时产生。这些结论强调了基质使用的复杂性和简化基质的必要性。尽管如此，使用一些器官代替整个组织来检测贝类是很想做到的。正如我们的结果所示，贻贝器官（肌肉、鳃、消

化腺）里卵囊（囊肿）的量化，单独暴露在200卵囊（囊肿）每天与整个组织暴露在560卵囊（囊肿）每天相似。此外，许多研究调查了原生动物在不同生物中的运输。Fayer 等人已经确认了在东部牡蛎(C. virginica)的鳃和血细胞内优先积累隐孢子虫卵囊。在蛤蜊(Tapes decussatus)中，作者在蛤蜊内脏中发现了数量最多的卵囊。一个实验性研究在一段净化时间后从地中海贻贝（M. galloprovincialis）消化腺中展示了最多的弓形虫DNA。在我们的实验中，一个星期暴露的最后，在斑马贻贝肌肉中发现了最多的刚地弓形虫DNA。实验中的高度变化可以用不同的暴露条件（实验室或田野外），暴露途径（食物或水）以及在各生物间的不同生活方式（淡水的或海洋的，饮食，行为）。亲器官性明显取决于在生物体内液体传输。因为器官浸没在血淋巴中，血淋巴可以带来大量原生动物到器官中，超出了他们的吸收能力。

关注刚地弓形虫，我们的结果不仅指出原生动物积累与周围环境污染成正比，还有取样时间，即使使用一个环境剂量。剂量反应关系的第一步表明斑马贻贝可以作为原生动物生物监测的哨兵物种。这种关于隐孢子虫和肠梨形鞭毛虫的观点在先前的研究中提出来过，但是，据我们所知，这是第一个研究有关弓形虫的。尽管如此，似乎有必要用一个净化实验来完成这些实验以强调多久可以在贻贝中检测到原生动物。如果贻贝可以集中病原体很长一段时间，并且因为他们是固定不动的，那么它们可以被用作一个对水中生物污染评估的综合基质。也可以根据制动过程在活跃的生物监测中使用生物来避免生如大小、历史污染水平和生物可用性等生物参数的影响。由于水质分析费时、昂贵并且生物检测方式有限，所以其它配套工具例如原生动物在斑马贻贝中患病率可以用来揭示河道中原生动物的污染。

总之，这些结论突出一些生物学问题如卵囊（囊肿）在无脊椎动物体内平衡仍缺乏研究，尽管斑马贻贝已经作为生物化学生物监测的工具了。目前，生物反应作为生物标志物对生物监测的研究是一种有效的工具，因为它们可以在对个人或人群造成不可逆转的伤害之前对各种污染起到早期预警。因此，斑马贻贝可以通过由于内分泌干扰物、基因毒性化合物、微量金属甚至由于毒药而产生的波动来区分位置。在生态毒理学研究中，重要的是要考虑到可能会干扰生物结果的因素。科学界现在承认在生物反应中有许多生物或非生物元素作为混杂的因素，但非特异性寄生的研究还很少。然而，原生动物在各种河道中都以高密度呈现，并且我们的研究强调了斑马贻贝富集隐孢子虫、肠梨形鞭毛虫和刚地弓形虫在它们组织中的能力。尽管斑马贻贝不是特定主要的原生动物，但异己分子元素会影响它们和它们的生物反应。我们发现刚地弓形虫卵囊在肌肉组织中相当普遍；我们现在需要确认这种普遍存在于肌肉还是血淋巴中。事实上，血淋巴细胞参与各种功能如伤口和壳愈合，养分消化，运输和排泄。如果原生动物干扰到红细胞、免疫和防御功能就可能会增加其他重要功能如生存、能源或繁殖的代价，我们的实验持续了一个星期并且是用高浓度的病原体中进行的。长期暴露在低剂量对完成斑马贻贝累积的数据和指出病原体对整个生物体的影响是必要的。尽管生物的影响仍然知之甚少，但未来体外暴露可以提高我们对非特异性病原体和细胞间相互作用的理解，如血细胞在无脊椎动物免疫和防御中发挥的重要作用。

5结论

作为固定不动的生物，水生无脊椎动物可以反映水道的环境污染。此外，它们的广泛分布有助于它们成为生物毒理学研究选择的生物。在各种河道发现高浓度的原生动物，但是它们的行为取决于水的参数（物化特性、流量、降雨量）。为揭示原生动物污染，新工具必须被开发因为水质分析一直不精确并且产生不相关的结果。我们的结果强调斑马贻贝在它们的组织中积累隐孢子虫、肠梨形鞭毛虫和刚地弓形虫的能力与环境浓度成正比。原生动物定位似乎更多的在肌肉组织里，包括血淋巴，并呈时间及剂量依赖性。原生动物的检测在肌肉组织里似乎比在其它器官有更大的相关性。此外，为了选择有关的器官进行生物监测，允许进一步的调查来确认其在肌肉或血淋巴中的积累。斑马贻贝不仅可以在化学生物监测中用于突出生物污染并且可以在水中的卫生评价中作为一种新的工具。此外，化学和生物压力对生物体平衡会有重要的影响。目前，异己寄

生虫没有被考虑到生态毒理学研究中，但作为一种生物因素，它可能是一种误导结果的来源。

致谢

作者感谢Ste phanie La Carbona和Catherine Cazeaux,ARRIA Normandie,为优化实时定量PCR过程。我们感谢Emilie Dupuis和Jeanne Hohweyer, laboratoire de parasitologie-mycologie de Reims Champagne-Ardenne，为他们在样品处理和分析中提供的帮助。

我们感谢Annie Buchwalter对此进行认真的英语修订和两个匿名评论者在很大程度上改善这个手稿和提出的建设性的评论。

这个博士工作得到了来自Région Champagne-Ardenne的支持。CNRS-INSU提供了资金支持和跨科学研究方案是塞纳河的环境。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/rw52.html