Inoue法制备化学感受态细胞及注意事项

1试剂的配制

⑴ 5mol/L的KOH: 10mL

称取KOH（南京化学试剂有限公司）2.8055g 加无菌的Mill-Q水至10mL ⑵ 0.5mol/L的PIPES pH:6.7

称取PIPES固体（进口Sigma）3.775g 加无菌的Mill-Q水至25 mL 用5mol/L的KOH调pH至6.7 并过滤除菌。 ⑶ Inoue转化缓冲液的配制：500mL

试剂 需要量/500mL 终浓度 MnCl2.4H2O（国药集团化学试剂有限公司） 5.44g 55mmol/L CaCl2.2H2O （AMRESCO） 1.1g 15 mmol/L KCl（南京化学试剂一厂） 9.325g 250 mmol/L PIPES(0.5mol/L, pH:6.7) 10mL 10 mmol/L H2O 补水至500 mL 过滤除菌 4℃冰箱存放备用

2 .DH5a化学感受态细胞的制备

⑴第一天 划平板：DH5a从-80℃冰箱冻存管划线至LB平板，37℃培养箱培养，约12hrs. ⑵ 第二天 接种子瓶：从平板挑单clone至种子瓶20mLLB Media中,37℃，220rpm摇床过夜.

⑶ 第三天 接子瓶：从种子瓶吸取一毫升DH5a种子菌液至子瓶中，25℃，220rpm摇床培养，约6～7hrs.

⑷ 测OD：待OD值约为0.6时开始制作(离心机事先预冷)

① ② ③ ④

将培养好的菌液转移至灭菌的50mL离心管中，置于冰上10min至菌液冰冷.

4℃,2500g离心10min.

弃上清，将离心管倒扣于滤纸上吸干剩余液体．

向５０ｍＬ离心管中加约１６ｍＬ的Ｉｎｏｕｅ转化缓冲液，重悬细菌沉淀（轻轻

重悬，不要用振荡器或吹吸混匀）。 ⑤ 4℃,2500g离心10min。

⑥ 弃上清，将离心管倒扣于滤纸上吸干剩余液体． ⑦ 每管各加入５ｍＬＩｎｏｕｅ缓冲液，轻轻悬浮。 ⑧ 每管各加入３７５ｕＬＤＭＳＯ，混匀，冰上１０ｍｉｎ． ⑨ 每管１１０uＬ，快速分装并冷冻。－８０℃，备用。

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