现代生化技术实验讲义(生工10)

实验一 双缩脲法测定蛋白质含量

一、实验目的

了解双缩脲法测定蛋白质浓度的基本原理；熟悉双缩脲法测蛋白质浓度的实验操作方法。

二、实验原理

双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出1个分子氨后得到的产物在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过1个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

三、材料与试剂

硫酸铜、酒石酸钾钠、NaOH、KI、酪蛋白

双缩脲试剂：取0.75g硫酸铜和3.0g酒石酸钾钠溶于250ml蒸馏水，加入150ml 10%NaOH溶液（可另加0.5gKI以防止Cu2+自动还原成一价氧化亚铜沉淀），用水稀释至500ml。此试剂可以长期保存。

10mg/ml标准蛋白溶液：取1.0gNaOH加入500ml蒸馏水中，配成0.05mol/lNaOH溶液。用0.05mol/lNaOH溶液溶解0.25g酪蛋白，定容至25ml。

待测样品液：可以用酪蛋白配制，也可用蛋清，牛血清蛋白。

实验器材：容量瓶，试管，移液管，量筒，烧杯，胶头滴管，吸耳球，洗瓶，分光光度计。

四、操作方法

1、标准曲线的制作

在6支刻度试管中，分别按下表所示量加入各种试剂，振荡均匀混匀。室温下反应30min后，用0号管校零，测定各管在540nm波长下的吸光度，以吸光值作为纵坐标，蛋白质含量为横坐标绘制标准曲线。

试剂 标准蛋白溶液 0.05mol/lNaOH 双缩脲试剂

2、样品蛋白质含量的测定

在刻度试管中加入蛋白样品溶液1m，双缩脲试剂4ml，室温下振荡均匀，显色30min后，用分光光度计于540nm测定各管吸光度，从标准曲线查出样品蛋白质含量。平行测定三次，计算平均值。

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加入量（ml） 0 0.0 1.0 4.0 1 0.2 0.8 4.0 2 0.4 0.6 4.0 3 0.6 0.4 4.0 4 0.8 0.2 4.0 5 1.0 0.0 4.0 五、结果与讨论

根据上述实验结果，绘制蛋白标准曲线，计算未知蛋白样品溶液浓度，并将相关实验数据填入下表： 标准蛋白浓度 吸光度 样品测定吸光度 样品蛋白浓度 样品蛋白浓度 平均值 六、思考题

双缩脲法测定蛋白的原理是什么？操作过程中应注意哪些问题？

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实验二 旋光法测定味精的纯度

一、实验目的

掌握旋光法测定生化物质的基本原理，熟悉旋光仪的仪器构造，掌握旋光仪的使用方法。

二、实验原理

味精在2M盐酸溶液中以谷氨酸形式存在。此时，纯谷氨酸的比旋光度为20。在一定温度下测定样品的旋光度，与该温度下纯L－谷氨酸的比旋光度比较，可计算出味精的纯度。

三、材料与试剂

分析纯盐酸、味精样品、旋光仪

四、操作方法

1、样品溶液配制

精确称取味精样品10.00g，加40－50ml蒸馏水溶解。搅拌下加入分析纯盐酸16ml，使味精全部溶解。冷却至室温，全部转入100ml容量瓶，蒸馏水定容至刻度。 2、旋光仪零点校正

打开电源开关，经预热10min，使钠光发出稳定的光。取16ml分析纯盐酸，用蒸馏水定容至100ml。装满样品室，调整零点。 3、样品液测定

用样品液洗涤旋光管三次，装满旋光管，放进样品室，打开开关，记录旋光仪的读数。并记录测定时刻该样品液的温度。

五、结果与讨论

1、L－谷氨酸的浓度C计算

根据测定的旋光度a，利用下式计算样品液中L－谷氨酸的浓度C。

a?100C?L?[a]tD式中：

C——谷氨酸的浓度，即100ml样品中，所含L－谷氨酸的克数。 a——测得的旋光度 L——旋光管的长度，dm

[a]tD：测定温度为t℃时，L－谷氨酸的比旋光度，按 [a]tD＝32 ＋ 0.06 ×（20－t）进行计算。 2、味精纯度的计算

根据样品中L－谷氨酸的浓度，由下式计算样品中味精的纯度：

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187.13147.13 味精纯度?样品重量C?

将相关实验结果和计算结果填入下表中： 温度 t（℃） 注：味精纯度是指一水合L-谷氨酸一钠（分子量187.13）的含量。在盐酸介质中通过比旋光度测出的为L-谷氨酸（分子量147.13）的浓度，因此计算时需进行换算。

旋光管的长度 L（dm） [a]tD 旋光度a C （g/100ml） 味精纯度 （%） 六、思考题

旋光法测定生化物质的原理是什么？

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实验三 荧光光度法测定氨基酸

一、实验目的

掌握荧光分析法的基本原理，熟悉荧光光度计的仪器构造，掌握荧光光度计的使用方法。

二、实验原理

荧光试剂邻苯二甲醛（OPT）在碱性介质中，在还原剂β-巯基乙醇的存在下，与氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸不反应）反应，生成强荧光化合物1-硫代-2-烷基异吲哚，在波长为340nm的紫外光激发下，产生波长为455nm的荧光，通过测定荧光强度可以确定氨基酸的含量。

三、材料与试剂

5μg/ml硫酸奎宁溶液：用0.05mol/L硫酸配制；

pH 9.5 硼酸缓冲溶液：准确称取硼酸2.4740 g 溶于水并稀释至100 ml，再用2 mol/LNaOH 溶液调pH 至9.5。

pH 8.04 磷酸缓冲溶液：准确称取磷酸二氢钾2.2675 g 于烧杯中，用少量去离子水溶解后，定量转入250 ml 容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；同法称取磷酸氢二钠5.9690 g 用水溶解并定容至250 ml。取上述配好的磷酸二氢钾10.0 ml 与磷酸氢二钠190.0 ml 混合均匀，即得pH 8.04 的磷酸缓冲溶液。

0.1%邻苯二甲醛衍生化试剂：称取50mg邻苯二甲醛，加入1ml无水乙醇使其完全溶解，再加入19 mL pH9.5的硼酸缓冲溶液和200 μL β-巯基乙醇，混匀，用硼酸缓冲液定容至50mL。避光保存于4冰箱, 每隔一天补10 μL β-巯基乙醇。

丙氨酸标准溶液：准确称取丙氨酸100.0 mg, 用去离子水溶解定容至50 ml，准确吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0 ml 分别置于100 ml 容量瓶中，用去离子水定容至刻度，相当于每毫升含有0.0、20.0、40.0、60.0、80.0 μg 丙氨酸。此系列标准溶液应在临用时配制。

样品氨基酸溶液。

荧光光度计；微量注射器或移液枪。

四、操作方法

1、标准曲线的绘制

调节荧光光度计的激发波长为340nm，发射波长为455nm，每次测定前用5μg/ml硫酸奎宁溶液对仪器定位，调节荧光强度为100。

分别移取2 ml 0.0、20.0、40.0、60.0、80.0 μg/ml的标准丙氨酸溶液于干燥试管中，分别加入2ml 0.1%邻苯二甲醛衍生化试剂和2 ml pH 8.04 磷酸缓冲溶液，立即混匀，暗处室温放置5min后，测定其相对荧光强度。以丙氨酸含量为横坐标，相对荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。 2、样品的荧光测定

取2 ml样品溶液，分别加入2ml 0.1%邻苯二甲醛衍生化试剂和2 ml pH 8.04 磷酸缓冲溶液，立即混

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匀，暗处室温放置5min后，测定其相对荧光强度。与标准曲线对照，确定样品中氨基酸的含量。

五、结果与讨论

根据上述实验结果，绘制蛋白标准曲线，计算未知蛋白样品溶液浓度，并将相关实验数据填入下表： 标准丙氨酸浓度 相对荧光强度 样品相对荧光强度 样品氨基酸浓度 样品氨基酸浓度平均值 六、思考题

荧光分析法的基本原理是什么？

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实验四 青霉素效价的生物测定

一、实验目的

了解用杯碟法测定抗生素效价的原理；掌握青霉素效价生物测定的具体操作步骤与方法。

二、实验原理

抗生素的抗菌特性决定了它的医疗价值，因此，利用他们各自的抗菌活性来测定其效价有着重要的意义。效价的测定法有：液体稀释法、比浊法和扩散法等。本实验采用国际上最常用的杯碟扩散法来测定青霉素的效价。测定时，将规格完全一致的不锈钢小管（即牛津小杯）置于含敏感菌的琼脂平板上，并在牛津小杯中加入已知浓度的标准青霉素溶液和未知浓度的青霉素样品液。于是，抗生素就自牛津小杯处向平板四周扩散，在抑菌浓度所达范围内敏感菌的生长被抑制而出现抑菌圈。在一定的范围内，抗生素浓度的对数值与抑菌圈直径呈线性关系。因此，只要将被测样品与标准样品的抑菌圈直径进行比较，就可在标准曲线上查得未知样品的抗生素效价值，为科学实验或临床应用提供参考依据。

三、材料与试剂

菌种：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus）。

培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（作生物测定用时，平板应分上下两层，上层需另加0.5%葡萄糖）。 试剂：

①1%pH6磷酸缓冲液：K2HPO40.2g(或K2HPO4·3H2O0.253g)，K2HPO40.8g，蒸馏水100ml。 ②0.85%Nacl生理盐水溶液。

③青霉素钠盐：1.667U/mg（1U即1国际单位，等于0.6ug）。 其他：

牛津小杯[不锈钢小管，内径（6+0.1）mm，外径（8+0.1）mm，高（10+0.1）mm]，培养皿（直径90mm，深20mm；大小一致，皿底平坦），试管、滴管、移液管（5、1ml）及大口10ml移液管等。

四、操作方法

1、敏感菌悬液的制备

在使用前先将供试菌株在斜面培养基上连续传代3～4次，使菌种充分恢复其生理性状。将活化的敏感菌斜面，用0.85%生理盐水洗下，经离心后去除上清液，再用生理盐水洗涤1~2次，并将其稀释至一定浓度的悬液。

2、青霉素标准溶液的配制

（1）青霉素标准母液：准确称取青霉素钠盐15~20mg,，溶液在一定量的0.2mol/LpH6磷酸缓冲液中，使成2000U/ml的青霉素溶液，然后保持冷藏存放。

（2）青霉素标准工作液：使用时以标准母液配成10U/ml青霉素标准测定液，按表1所示量加入青霉素标准母液，即配成不同浓度的青霉素标准液。

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表1 不同浓度标准青霉素液的配法

试管编号 1 2 3

3、标准青霉素和样品青霉素效价的测定

（1）倒底层培养基：取无菌培养皿6套，每皿移入9ml牛肉膏蛋白胨底层琼脂培养基，置水平待凝备用。

（2）铺含菌上层培养基：将装在三角瓶中的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（100ml）融化，待冷却到60℃左右时再加入60%葡萄糖液12ml和金黄色葡萄球菌菌液3～5ml，充分混匀后，用大口移液管吸取9ml于底层平板上迅速铺满上层，然后移置水平位置待凝备用。

（3）放牛津小杯：待上层充分凝固后，在每个琼脂板上轻轻放置4支牛津小杯（平板底部用记号笔作好标记），其间距应相等，如图所示：

10U/ml工作液量 （ml） 0.4 1.0 1.4 pH6磷酸盐缓冲液（ml） 9.6 9.0 8.6 青霉素含量 (U·ml) 0.4 1.0 1.4 -1

（图中A为1U/ml标准青霉素，B、C、D为其他剂量和样品青霉素溶液）

（4）滴加标准样品液：用移液枪滴加标准样品液和样品液，每一稀释度应更换一支枪头，每个牛津杯的加入量为0.2ml。每一稀释度做2个重复。

（5）培养：待样品加毕后，盖上培养皿的盖子，并将平板置37℃温箱内培养18～24h后观察测定结果。

（6）测量：取出牛津杯，精确地测量各稀释度的青霉素的抑制圈直径。

五、结果与讨论

1、相关结果的计算

将上述实验结果填入下表中，并进行相关的计算，结果一并填入表中。 计算步骤：

① 算出各组（即各剂量）抑制圈的平均直径。 ② 算出各组1U/ml的抑制圈平均直径。 ③ 统计6套培养皿中1U/ml的抑制圈总平均值。

④ 以1U/ml抑制圈的总平均值来校正各组的1U/ml抑制圈的平均值，即求得各组的校正值。

举例：若12个1U/ml青霉素溶液的抑制圈直径的总平均值为22.6mm。而第一组内4个1U/ml青

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霉素溶液的抑制圈直径的平均值为22.4mm，则第一组1U/ml抑制圈的校正值=22.6-22.4=+0.20（mm）。

其他各组依次类推获得各自的校正值。

⑤ 以各组1U/ml的抑制圈的校正值校正各剂量单位浓度的抑制圈直径，即获得各组抑制圈的校正值。

举例：若12个1U/ml青霉素溶液的抑制圈直径的总平均值为22.6mm。而第一组内4个1U/ml青霉素溶液的抑制圈直径的平均值为22.4mm，则：第一组的校正值=22.6-22.4=+0.20（mm）。若第一组皿内0.4U/ml青霉素溶液的抑制圈平均值为18.6mm，那么第一组0.4U/ml青霉素溶液的抑制圈校正值=18.6+0.2=18.8（mm）。

其他各组依次类推获得各自的校正值。

皿号 青霉素效价/ (U·ml) -1抑菌圈直径/ mm 平均值/ mm 校正值/ mm 1U/ml青霉素抑菌圈 直径/mm 平均值/ mm 校正值/ mm 1 2 3 4 5 6 0.4 1.4 样品 1U/ml青霉素抑菌圈直径总平均值 青霉素样品的效价 2、绘制标准曲线，计算样品效价：

（mm） (U·ml) -1以青霉素浓度的对数值为纵坐标，以抑制圈直径的校正值为横坐标，绘制标准曲线。在标准曲线上查得青霉素样品的效价，填入上表。

六、思考题

采用杯碟法测定抗生素的生物效价时，在操作过程中应注意什么问题？

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实验五 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量

一、实验目的

1、学习SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量的原理； 2、掌握垂直板电泳的操作方法；

3、运用SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量及染色鉴定。

二、实验原理

十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量，是六十年代末Weber和Osborn在Shapiro等人在实验基础上发展起来的一项新技术。用这种方法测定蛋白质的分子量具有快速灵便，设备简单等优点。

蛋白质的电泳迁移率在一般的电泳方法中，主要取决于它在某pH下所带的净电荷量、分子大小（即分子量）和形状的差异性，而SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对大多数蛋白质，主要取决于它们的分子量，与原有的电荷量和形状无关。

SDS是一种阴离子表面活性剂，在一定的条件下，它能打开蛋白质氢键和疏水键，并按比例地结合到这些蛋白质分子上形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。SDS与蛋白质的定比结合使蛋白质-SDS复合物均带上相同的负电荷，其量远远超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了蛋白质间原有的电荷差异。在水溶液中，蛋白质-SDS复合物具有相同的构象，近似雪茄烟形的长椭园棒，克服了蛋白质间原有的形状差异。这样蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率不再受原有电荷和形状的影响，而只是蛋白质分子量的函数。蛋白质分子量与电泳迁移率间的关系可用下式表示：

lgMr = K – bm

式中 Mr为分子量；K为常数；b为斜率；m为迁移率。

因此，用本法测定蛋白质的分子量只需根据待测蛋白质在已知分子量的标准蛋白质的lgMr～迁移率的图中的位置，就能得知分子量。

三、试剂与材料

30％丙烯酰胺贮存液：称取丙烯酰胺29.2g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后装于棕色瓶，于4℃冰箱保存备用（可用1-2月）。

N,N,N,N－四甲基乙二胺（TEMED）。 10％过硫酸铵溶液，当天配制。

SDS－分离胶缓冲液：1.5mol/LTris－HCl，pH8.8，加0.4％SDS。 SDS－浓缩胶缓冲液：0.5mol/LTris－HCl，pH6.8，加0.4％SDS。

SDS－样品缓冲液：10％（W/V）甘油，5％巯基乙醇，0.05％溴酚蓝，2.3％（W/V）SDS和0.0625 mol/LTris－HCl，pH6.8。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/rvyv.html