实验1、2

综合实验之生物制品分析检测 实验一:斐林试剂置换法测定还原糖的含量

一、 实验原理:

糖类包括多糖、双糖和单糖，其中单糖和某些双糖具有游离的羰基，称为还原糖，多糖和蔗糖无还原性。利用糖的还原性，与斐林试剂（氧化剂）中的二价铜离子还原为一价铜，进行氧化还原反应，而进行测定.非还原糖必须转化为还原糖，再进行测定。

斐林试剂中酒石酸钾钠铜是一种氧化剂，反应的终点可用次甲基蓝作指示剂，在碱性、沸腾环境下还原呈无色。根据斐林试剂完全还原所需的还原糖量，计算出样品还原糖量。 二、 试剂与材料： 1、试剂：

菲林试剂甲液：称取69.3g硫酸铜晶体，用蒸馏水溶解，定容至1000ml

菲林试剂乙液：称取346g酒石酸钾钠，100g氢氧化钠，用蒸馏水溶解定容至1000ml 2、1%次甲基蓝溶液：1g次甲基蓝溶于100ml水

3、0.2%标准葡萄糖溶液：2g葡萄糖105℃烘干到恒重加水到1000ml 4、碱式滴定管

5、样品溶液：待测葡萄糖溶液

样品1：稀释20倍，样品2：稀释50倍 6、电炉

三、操作方法： 1、斐林试剂标定

A 取甲液5ml+乙液5ml，（注意：甲液与乙液混合可生成氧化亚铜沉淀，应将甲液加入乙液，使开始生成的氧化亚铜沉淀重溶）置于250ml三角瓶中，加入10ml水，并从滴定管中加入0.2%的标准葡萄糖溶液若干毫升（约23ml） 。（量控制在后滴定时消耗葡萄糖液在0.5－1.0ml)

B 电炉上加热至沸，并保持微沸2分钟，加2滴1%次甲基蓝溶液，趁沸以每两秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液用0.2%标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，有红棕色沉淀，溶液清亮为终点止。记录耗用的葡萄糖液量为V0,必须在1min内完成。

注意：还原的次甲基蓝易被空气中的氧氧化，恢复成原来的蓝色，所以滴定过程中必须保持溶液成沸腾状态，并且避免滴定时间过长。 2、定糖预备试验

同1法取斐林试剂，加10ml样品液，摇匀于电炉上加热至沸，保持微沸2分钟，加2滴1%次甲基蓝，用0.2%葡萄糖液滴定至蓝色消失。记录耗用的葡萄糖液量为V1 3、样品中还原糖测定

同上法吸取斐林试剂加10ml样品液(预先稀释)，补加（V0—V1）ml水，并从滴定管中预先加入（V1—1）ml 0.2%葡萄糖液，摇匀至电炉上加热至沸，保持2min微沸，加入2滴1%次甲基蓝，继续用葡萄糖液滴定至蓝色消失。记录消耗的标准葡萄糖液体积为V毫升。 四、结果计算

还原糖含量(以葡萄糖液计) =（Vo-V) *0.002 *1/10 * n（ g/ml) 式中Vo-------- 斐林试剂标定值，ml V--------- 样品糖液测定值，ml

0.002----- 标准GS液浓度，g/ml 10-------- 样品糖液体积，ml n--------- 样品稀释倍数

实验二：凯氏定氮法测定蛋白质的含量

一、原理：有机含氮化合物与浓硫酸共热消化，氮转化为氨，再与硫酸结合成硫酸铵。硫酸铵与强碱反应，放出氨。将氨蒸馏到过量的标准无机溶液中，再用标准碱溶液进行滴定。根据测得的氨量，计算样品的总氮量。 二、试剂与材料：

浓硫酸、硫酸钾－硫酸铜粉末（称取80g硫酸钾和20g硫酸铜结晶体，0.3g二氧化硒研细混合）、30％氢氧化钠溶液、2％硼酸溶液、0.01M标准盐酸、混合指示剂（田氏指示剂）储存液（取50ml 0.1％甲烯蓝乙醇溶液与200ml 0.1％甲基红溶液混合，储存于棕色瓶中备用。此指示剂在PH5.2为紫色；PH为5.4为暗灰色或灰色；PH5.6为绿色；变色点为PH5.4）、硼酸－田氏指示剂混合液（100ml 2％硼酸溶液，滴加约1ml田氏指示剂，摇匀后，溶液呈紫红色）、蛋白质样品、容量瓶、吸管、凯氏烧瓶、凯氏定氮蒸馏装置、微量滴定管、电炉 浓硫酸500ml、硫酸钾200g、硫酸铜200g、硼酸50g、盐酸200ml、甲基红0.5g、溴甲酚绿 0.5g

三、操作方法

1、样品处理：固体样品，应在105℃干燥至恒重。液体样品可直接吸取一定量，也可经适当稀释后，吸取一定量进行测定，使每一样品的含氮量在0.2－1.0mg范围内。

2、消化：取一定量样品，于50ml干燥的凯氏烧瓶内。加入300mg硫酸钾－硫酸铜混合粉末，再加入3ml浓硫酸。用电炉加热，在通风厨中消化，瓶口加一小漏斗。先以文火加热，避免泡沫飞溅，不能让泡沫上升到瓶颈，待泡沫停止发生后，加强火保持瓶内液体沸腾。时常转动烧瓶使样品全部消化完全，直至消化液清澈透明。

另取凯氏瓶一个，不加样品，其它操作相同，作为空白试验，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质，以对样品进行校正。

3、蒸馏：将微量凯氏蒸馏装置洗涤（先用水蒸气洗涤）干净。将凯氏烧瓶中的消化液冷却后，全部转入100ml的容量瓶，用蒸馏水定容至刻度。

吸取20ml稀释消化液，置于蒸馏装置的反应室中，加入10ml30％氢氧化钠溶液，将玻璃塞塞紧，于漏斗中加一些蒸馏水，作为水封。

取一三角瓶，加入10ml硼酸－田氏指示剂混合液，置于冷凝管之下口，冷凝管口应浸没在硼酸液面之下，以保证氨的吸收。

加热水蒸汽发生器，沸腾后，夹紧夹子，凯氏蒸馏。三角瓶中的硼酸－指示剂混合液，吸收蒸馏出的氨，由紫红色变为绿色。蒸馏15min，让硼酸液面离开冷凝管口，再蒸1－2min以冲洗冷凝管口。空白试验按同样操作进行。

4、滴定：样品和空白均蒸馏完毕后，用0.01M标准盐酸滴定，至硼酸－指示剂混合液由绿色变回淡紫色，即为滴定终点。

四、计算 样品总氮量（mg）=（A-B）×c×14×100/20

式中：A：样品滴定时消耗的标准盐酸体积 B：空白滴定时消耗的盐酸体积 C：标准盐酸的当量浓度 14：氮的相对分子量 20：用于蒸馏的稀释消化液体积 100：稀释消化液的体积

样品中粗蛋白含量（mg）＝样品总氮量（mg）×6.25

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