氨基酸分析原理和色谱条件

根据具体仪器编写的氨基酸分析原理和色谱条件。

分析原理和色谱条件

一、 氨基酸分析的须知：

（一） 样品要求：样品应有代表性，固体样品必须过60目筛；液体样品需有一定的流动性；

办固体状的样品要保证能在称量纸上不流动。对不难采集并需要我们处理的样品，常规样品一般固体样品5克左右，液体样品15ml左右；对难以收集的样品（如：酶、肽等）液体样蛋白含量应大于300μg/ml，体积不少于4ml；固体重量应不少于500μg。

（二） 自己处理样品的同学和老师，应根据自己的样品状态，严格按照本室要求样品的处

理方法处理样品。并讲处理好的样品在星期二下午3点前送到测试中心氨基酸分析室，处理好的样品要同时送两份（两个盛有蒸干样品的25ml小烧杯），并提供样品的蛋白质含量、称样量、定容体积、加0.02NHCl体积等有关数据。（样品处理方法见本附件）。

（三） 因氨基酸分析需要柱后（或柱前）衍生，分析时间长，所以对氨基酸分析的上机浓

度要求严格。请各位老师和同学无论是自己处理样品还是需要氨基酸分析室处理样品都应准确知道自己所测样品的蛋白含量（或氨基态氮含量）。如果需要本实验室处理样品时，提供的蛋白质含量的误差应控制±5%。如20%的蛋白含量，提供的数据应为（18-22）%。

（四） 氨基酸分析室仪为学校所有需要氨基酸分析的同学和老师服务，为了保证仪器能长

期处于良好的运行状态除了我们机台的工作人员的努力外，还需要各位同学和老师的大力合作。样品的浓度过高极易造成分离柱的污染和反应盘管爆裂（每个反应盘管3000元左右）并且测定的数据也不准确；样品的浓度过低直接影响分析结果的准确性。对提供的原始数据不准确的样品，在上机分析时造成仪器损坏或氨基酸峰过低由送样人员负责。因提供原始数据不准确的样品需要重新上机的样品，则需另收上机费。

（五） 氨基酸的分析需要柱前或柱后衍生，衍生化试剂对分析结果会有一定的影响，对需

要做影响因素分析的样品，应妥善保管好不同时间采集样品，待样品收集全后，一起处理、一起做。这样更有利于对实验结果的分析。

（六） 每做一个样品的氨基酸全分析（17种氨基酸），对仪器都是一次的严重的磨损。为

了使仪器能更好地为大家服务，请各位老师和同学根据自己的科研、论文的实际需

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要和经费的情况合理安排样品的测定数量。本科生、研究生的样品需要征得导师的同意后再送样（最好有导师的电话或书面通知）。

（七） 氨基酸分析室对样品的测定结果负责，对数据有疑问的分析结果，我们共同探讨。

对有必要重做的样品我们可以重做，如果是分析测试的问题，我们不收任何费用。如果是样品本身的问题则按实际费用收取测试费。

（八） 氨基酸分析室的工作人员在样品分析好后，及时通知各位老师和同学。在接到样品

分析好后，请各位老师带好经费卡（或已到财务处划好帐的单子—第二联）。我们在收到转账单后给出分析图谱。对经常需要分析氨基酸样品的老师和同学，可以先记账，一个季度结一次。

（九） 有关氨基酸分析的其他问题，我们将与有关老师和同学共同探讨。

二、 游离氨基酸分析样品前处理方法（除蛋白）

固体样品：精确称取样品__mg加入10ml5%的磺基水杨酸沉淀2小时。吸取一定的量于10000rpm/min离心15分钟。取一定体积的上清液调pH至2左右定容（参考方法一份上清液加3份水），用0.45μm微膜过滤至样品杯中上机测定。

液体样品：精确精确吸取样品__ml加入等体积的10%的磺基水杨酸沉淀2小时。吸取一定的量于10000rpm/min离心15分钟。取一定体积的上清液调pH至2左右定容（参考方法一份上清液加3份水），用0.45μm微膜过滤至样品杯中上机测定。

附：游离氨基酸分析送样要求

1、 样品应澄清，无可见渣子，放置或离心后不产生沉淀。

2、 样品液应无色或仅为淡黄色。色深样品必须经过脱色处理。

3、 含盐量低。样品液中的总离子强度不应大于0.5N。含盐量过高必须经过脱盐处理。

4、 含蛋白或多肽类物质必须除去。样品需经0.45微米的滤膜过滤。pH应控制在2左右。

三、 水解氨基酸样品预处理

（一） 蛋白质样品的前处理

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（1） 准确称取一定量的样品于特制的水解管底部，缓慢加入8ml6NHCl轻轻转动水解管，

保证样品全部在试管底部并保证样品得到全部润湿，抽真空，维持10分钟后，在酒精喷灯上封口。

（2） 110℃±1℃水解24小时。

（3） 切开水解管用去离子水全部转移到__容量瓶中、定容，双层滤纸过滤，取滤液1ml

置于25ml小烧杯中，在加NaOH的真空干燥器中蒸干（水浴加热不超过45℃），加入__mlpH2.2的盐酸溶解后，溶液转移到样品瓶中备用。

（二） 碱水解测定色氨酸样品前处理

精确称取一定量的样品放入已编号的特制水解管中，加入含5%SnCl2的5NNaOH__ml,抽真空封口110℃水解20小时，冷却、全部转移至__ml容量瓶中用6NHCl中和至中性，定容至刻度、摇匀、用双层滤纸过滤，上机测定水解样品中的色氨酸含量。

附：

5、 单体氨基酸标样的配制：

氨基酸的分子量/20,即为称样量（mg）,溶解后定容到500ml。

酸的纯度测定

用紫外做单一氨基酸的纯度测定时，用目的氨基酸的分子量/2，即为称样量（mg），溶解后定容到250或500ml.

碱水解测定色氨酸的样品称样量是酸水解的2倍，其余相同

四、 酶蛋白、糖蛋白、肽等微量样品的氨基酸分析样品要

求：

1、 样品中不含有盐或经酸水解后会形成结晶的组分。

2、 酶蛋白、糖蛋白等样品的17种氨基酸定量分析，样品中的蛋白绝对含量应不低于200

μg；需另外测定色氨酸时样品的需求量要增加一倍。若只做氨基酸的定性分析样品的需求量可减至定量分析样品需求量的三分之一左右。样品若为液体时，在保证蛋白绝对含量的同时，其体积不得超过4ml。

3、 肽类样品的氨基酸分析的样品要求参照酶蛋白的氨基酸分析的样品要求，肽样品中的氨

基酸残基数低于8个，则对样品的需求量可相应降低一倍。

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4、 液相色谱做氨基酸分析，用紫外检测器时，标样的浓度是100ppm左右（视氨基酸分子

量而定），定量分析的最低浓度应控制在10ppm左右；用荧光检测器时其浓度均降低10倍。定性分析样品浓度可在各自相应浓度的基础上再降低5倍左右。

5、 无论是定量分析还是定性分析，样品量越多，测定的数据越准确。所以在对微量样品的

氨基酸分析时，在不影响其他测定项目和实验的前提下，尽量提供多一些样品。

五、 分析原理和色谱条件

（一） 安捷伦1100液相色谱分析氨基酸的工作原理（柱前衍生）：具有不同R基团的氨

基酸与邻苯二甲醛（OPA）自动衍生化反应后，不同的氨基酸都能生成唯一的衍生物（产物具有紫外和荧光吸收）。衍生物经C18柱分离、检测，外标法定量。

*脯氨酸是与氯甲基茐甲酯（FMOC）反应。

（二） H835-50氨基酸分析仪工作原理（柱后衍生）：利用氨基酸在不同pH溶液中所带的正负电荷不同这一两性特点，只要在不同时间内流经离子交换柱的缓冲液的pH不同，氨基酸的带电情况就会发生变化，因而与离子交换树脂的结合能力也就不断地在变化，而达到分离的目的。经柱分离的单一氨基酸与茚三酮在100水浴反应后、比色，外标法测定样品中氨基酸的含量。

（三） 色谱条件

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