改良的降落PCR扩增中国地鼠目的基因

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山西医科大学学报 ( hn i dUnv 08年 l JS ax i)2 0 Me 0月，3 (0 9 1

文章编号： 10—6 1 (0 8 1—0 7—0 0 7 6 12 0 )0 86 3

改良的降落 P R扩增中国地鼠目的基因 C宋国华一庞文彪 .,农业大学动物科技学院 )

张锐虎 刘田福 岳文斌 (山西医科大学实验动物中心，太原 000;山西，, 30 1

摘要：目的

优化 P R程序， C尝试用降落 P R扩增中国地鼠目的基因。方法 C

设计了 4对引物，用普通 P R和改良的 C降落 P R省略了常规 P R中摸索最适 C C

降落 P R扩增中国地鼠 C X1C X、 A H、 A 6部分基因。结果 C O、O 2 N D 5 N DH

普通 P R只有 1对引物扩增出特异性条带， C而

降落 P R 4引物都扩增出特异性条带， C对并与中国地鼠目的基因大小一致。结论 关键词：中国地鼠；降落 P R;退火温度； P R特异性 C C中图分类号： Q 8 71文献标识码： A

退火温度的过程，对中国地鼠一些 T值相近的基因可以使用降落 P R温度程序扩增， m C是一种行之有效的 P R方法。 C

M o fe o h wn P di d t uc do CR sa a r a h o a p iy tr e e e o ie uu rs u i a n pp o c t m lf a g tg n fCrc t ls g ie s

S G G o h a一，P NG We—i 1 HA u—u,L U a— l UE W e -i2 a oaoy Anm lC ne, h m i ON u -u l A n b o,Z NG R i l I Ti f,Y nbn (L b rtr i a e t S a c a h n u r

Me cl nvri,T i a【 0 J C ia; ol e fAnma c nead Tcnl y,h mcA i l rl iesy di iesy a u n6 0 O, hn lg aU t y 3 C e o i l i c n ehoo S a i c t a vri ) Se g u u Un t A s at Ob ci T mp f tre ee f reuu r esb o ie uho nP R T -C . Mem s C m n bt c: r j t e oa ly agt ns i tl gi u ym df dt cdw C ( D P R) e v i g

oC c s s i o t d o mo lP CR n a d TD- CR we eu e o a l y g n f i t l sg ie sw t ar rmesd i n a e n c n e v d g n o ig r— P r s t mp i e e o c u u r u ih 4 p isp i r e g e b s do o s r e e ec d n e d f s Cr e s s d g o so o s n u e u n e C in f n e s ss q e c OX1 C c, OX NADH5, 2, NADH6,e p c iey Reu t On y o e f g n sa l i y c mmo rs e t l . v sl s l n r me twa mp i e b o a f d n P CR. u a g tf g n swe ea pi e y TD- CR. C n l s n C mp r t lr o CR, ) P e o O s a c b t t r e r me t r 4 a m l id b f P o cu i o o a e wi c T n n P d ho l TI_ CR n e n tt e r h d b ta n a ig t mp r t r d TD- C i ab n f il t o e n e l g tmp r t r fs mep i r r e r s e n e l e e au e An n P R s e e i a c me h d wh n a n ai e ea u e o o r n s mes a en a . Ke r s Cr eu u r e s t u h o C a n ai g tmp r t r; P R p cf i y wo d: i t lsg i u; o c d wn P R; c s n e l e e au e n C s e i ct i y

P R作为一种体外扩增 D C NA的方法，目前在生物医药领域中应用越来越广泛。影响 P R的因 C

Mg 1、NT、 re为大连宝生物公司产品。引 C7d P Mak r

物由上海生工公司合成。1 2基因组 D . NA的提取 1 3设计引物 .取中国地鼠的尾巴，采用常规的酚一氯仿抽提法提取基因组 D NA。 本研究根据 G nB n e e a k中的小鼠线粒体基因组全序列 (录号为 E 1 8 3 )大鼠登 F 03 9、(录号为 AY 6 4 0基因序列，用 Cutl登 7 94 )应 ls w a

素很多：C仪器性能、应体系、 PR反

反应条件，中其退火温度影响最大。退火温度与引物中嘌呤、啶嘧的数目有关，一般根据 Tm值来确定。在实验室日常工作中经常出现两种情况：一种是因未找到最佳扩增条件导致产生大量非特异性产物；一种情况另

是未扩增出任何产物。降落 P R(ocdwnP R, C tuh o C T—C是一种设计多循环以使相连循环的退火 DP R)温度越来越低，而达到最佳扩增条件的方从

18软件进行序列比对， .3在保守区用软件 Olo60 i . g设计了 4对引物，增目的片段长约 9 7—13 7扩 3 8b,物序列见表 1 p引。 1 4 P R扩增 . C 1 4 1普通 P R扩增程序 .. C P R反应体系：5肚 C 2 l反应体系中含 Ta q酶 ( a a 0 2 l基因组 rK r ) .5、D A约 1 g M 1 6mmo/、 N P . N 0n、 . lL d T s 2mmo 0 l

法 _j实验采用常规 P R及改良的降落 P R 13。本 C C两种方法进行扩增中国地鼠线粒体基因组中的C OX1C X1C 2 NA H5 NA H5NA H64个、 O一 OX、 D、 D一 D

基因片段，落 P R效果良好，立了能特异、降 C建敏感、速检测 4个基因片段的 T—C方法，报快 DP R现告如下。

几、下游引物各 0 5 l扩增程序：4℃预变性 5上 .; 9mi;后 9 n然 4℃ 3,8℃ ( 4 0S4或 6℃,4℃ ) n 4 1mi,

1材料和方法

7 2℃ 9 进行 3循环；2℃ 1 i。P R产 0S 5次 7 0r n C a实验动物为山西医科大学实验动物用 10 .%琼脂糖凝胶电泳检测。

1 1实验材料 .

物中心饲养的中国地鼠。 T q酶、 0×B f r a 1 uf、 e基金项目：山西省实验动物专项基金资助项目(0 5 1 20 K0 )

142降落式 P R t cd n (扩增程序 P R .. C ( u o ) ohw P C

1 2

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(0 i

m O 0∞ O O 如卯0 0 ∞ 8 7 7 卵

反应体系同上。P R扩增程序： 4℃ 5 mi; 4℃ C 9 n93,8℃ 1mi,2℃ 9

, 0s4 n7 0S2次循环；4℃ 3 , 9 0S4 7℃ 1ri,2℃ 9, n7 a 0S2次循环；4℃ 3 ,6℃ 9 0 S4

7 2℃ 9 , 0s2次循环；4℃ 3 ,4℃ 1mi,2℃ 9 0s4 n7

9,0次循环；2℃ 1 n C 0S3 7 0mi。P R产物用 1 0 .%琼脂糖凝胶电泳检测。

1mi,2℃ 9,循环；4℃ 3 t5℃ 1mi, n7 0s2次 9 0S4 n表1Ta b1

扩增中国地鼠部分基因的 4对引物Fou a r rm e s f ra plf i g pa ta e ie u u rs u r p isofp i r o m iy n r ilg neofCr c t l sg ie s

15电泳 .2结果

所有 P R产物均在 1 C%琼脂糖 ( 1 X

对目的基因扩增的有效性。

T E缓冲液 ) B凝胶中进行，样量均为 3。点 l

2 1普通 P R扩增结果 . C

常规 P R对同一反应体 C

10b 0 p2 0bp 0

系进行扩增，温度分别在 4退火 8℃,6℃,4℃, 4 4进行了扩增。从电泳结果来看，普通 P R在 4 C 8℃,4 4℃均未扩增出目的片段。仅在 4 6℃扩增出 N DH5 A一N H 引物的目的片段， O、 oX一 OX、 AD 6l对 C x1 C 1C 2

5 0bp 0

5 8 82 0 0bp 0

N DH5的引物均未扩增结果 (图 1。 A见 )

M. rkr .OX1基因片段；2 C X1C 2基因片段； Ma e;1 C, O .OX

3 N D 5因片段； . A H . A H基因片段 .A H基 4 N D 5N D 61—4扩增的碱基数分别是 10 6b,3 p 10 5b, 8 p 6 p 9 7b, 9 p 13 7b

图 2降落 P R扩增产物 (%琼脂糖电泳 ) C 1Rg2、d啪 I R珊Dut (l'p e di 1 aa s) 1 l a= C dc e￣ brt n% gm e s et o e

3M. re;1 N H5N H6基因片段； . OX Mak r . AD . AD 2 C 1基因片段； 3 C X1C 2基因片段；4 N H5基因片段 . O OX . AD

讨论

在进行 P R扩增时，到许多参数的影响， C受这

些参数包括循环次数、 M、NT引物和模板， d P、通过改变这些条件来使产物

获得最好的效果。其中退火温度是影响 P R特异性的重要因素， C变性后温

图 1普通 P R扩增产物 (%琼脂糖电泳 ) C 1Fg1 C:ro C r ut e c p oe di% aa ) i ￣nfnP R po c l t hr e 1 g g l d s( e o t n

度快速冷却至 4 0—6 0℃,使引物和模板发生结可 22降落 P R扩增结果 . C采用降落 P R扩增， C 4合。由于模板 D NA比引物复杂的多，物和模板引之间的碰撞机会远远高于模板互补链之间的碰撞。 对引物的目的基因片段均在琼脂糖电泳中检测到， 片段大小约在 9 0—13 0 b 0 0 p左右，引物设计的与产物片段相符，电泳条带迁移情况来看，增从扩 P R产物的大小较为一致 (图 2。采用降落 C见 )

在 Tm值允许的范围内，择较高的温度可大大减选少引物和模板之间的非特异性结合，提高 P R反应 C的特异性 j 4。

P R扩增， C目的区以外的非特异性弥散无或很弱，说明用该方法获得的产物特异性较强，高了 P R提 C

降落 P R技术的基本原理为： C根据引物的 T m值，置一系列从高至低的退火温度，始选择的设开

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退火温度高于估计的 Tm值，着循环的进行，随退

℃,4℃, 5℃, 7℃, 4 4 4比较接近，此可用降落因

火温度逐渐降低至 Tm值，最终低于 Tm值。在并每一个停留的退火温度上循环 2次。当达到引物与模板结合的 T值时，增开始，降低到非特 m扩当异性扩增发生的水平时，异产物会有一个几何级特

P R程序扩增， C大大提高了工作效率。 普通 P R和 T—C C DP R相比，落 P R是一种降 C潜在的一步法找到最佳退火温度的方法 _通 6。普 6

P R程序简单、时，般的 P R仪都可完成， C省一 C但缺点是退火温度不适当时容易出现假阴性； T—而 D P R虽然程序复杂，要 P R仪有较大的内存， C需 C但能非常有效地降低或避免假阴性，不在理想的扩且

的起始优势，剩余反应中，在

特异产物具有绝对竞争优势，而使其在扩增中占主导地位，高其特从提异性』 3。降落 P R代表了一种不同的优化策略， C通

过在一个程序中采取一系列不同的退火温度进行扩增循环。考虑扩增特异性和扩增效率， T -在 D

增体系(比如最佳 M浓度 )下增加特异性和目的产物的产量[ 。参考文献：[] A l VM,cmesrHH, fi rG .￣uneseicdtco 1 r t Sh i e Pee P Sq ec— c i e t n f p f e io r t lc i cdDNA d u t h u np 3g n ytr— f i oo hca i— as - a d csi t eh ma 5 e eb emi n

P R过程中一般需要采用热启动的方法。如果观 C察到许多产物带，可提高 T—C的最高退火温度 DP R和最低退火温度，其范围上移；少最低退火温使减度条件下的循环次数；使各退火温度下的循环数增加一个，同时减少较低退火温度或恒定退火温度循环的次数。如果未检测到产物或产物带很弱，可将反应产物在恒定退火温度下再反应 1 0个循环并重

ndt nfrs—eedn C J . ac oeei 2 0,2 1: e r s aedpn et R[] C ri gns,0 12 ( ) a e P n s1 3— 1 0. 3 4

1 j Pre, iigL . eo eeeaepi r n uho 2 i eM Vnn C Us f g nrt r sadt cdwn a d me oPCR o a l y a h lg n s e e fa me t fo S r p o c s t mp i ao e a e g n r g n r m t e t my e f

vnze eIP 2 0 J n co i it h o,0 2 2 ( ) eeul S 5 3[]JIdMi boBoe n l20,9 1: a r l c1 5.

新分析[ 。本实验主要采用常规 P R及降落 P R两种方 C C法进行扩增，比较了两种方法的扩增策略和效并

[] D nR C xP Wa wr h Je 1 T uho nP R t i 3 o H, o T, i i t,t . oc dw C cr n g B a o— cmvn pr u r n u n e ea pf ai[] N c i u e t u

i spi gd r g gn li t n J . ulc s o mi i m ic o eA isR, 9 1 1 ( 4: 0 8 c e 1 9,9 1 ) 4 0 d s

果，以期找到一种尽可能地提高扩增效率和产物产量的扩增策略。在本研究进行的初期，者试图利笔

[]王天云， 4张贵星，薛乐勋 .一种简便高效的改良降落 P R[] C J.中国生物工程杂志，0 3 2 ( 1:O一8 . 2 0,3 1 )8 2

用常规 P R对同一反应体系进行扩增，尽管不断 C但改变退火温度 ( 8℃,6℃,4℃ )普通 P R均仅 4 4 4, C扩增出 l对引物的目的片段，可能是由于扩增程这

[] E a sMF A a o S, i n rodL,ta . oc dw 5 v , dmsnC SmmosA n l e 1 T uho n nG nr r rG 5 GP+) C do t zds lD e eNP i ( P+/ 6 P Ra pi e a e NA me n mi mpc n e tain sp ot t e st e ee t n o u n a io o cn rt u p r hes nii d tci f h ma p pl— o v o l

mai sJ MC Ci P to,0 55 1 . vr[]B l ahl20,:0 u n[] Hun Q, lui mi et o cdw KR cmb e 6 agX Cot rS He—s e tuho I; o i d e n d n nwih p me-e pae mimac t r i rtm lt s th PCR o a i s Nt n a d s— frrpd i o i e o n q e cn flw l ua ih ltnn s bmi g n a l u n ig o o moe l weg tgu e i u t t e e fmi c r y

序设计不合理或退火温度不适宜等原因导致产物不能有效合成的缘故。应用 T— C法对此反应 DP R体系进行扩增时，有进行最佳退火温度的摸索，没直接简单地设计了 P R扩增程序， C即顺利扩增出目

f m eabiwha B Cl rr[]B r ahxp d et A i ayJ . MCG nt2 0,:8 o b e e,0 7 8 1 .

[]邹晓月， 7焦志军.降落式 P R检测载脂蛋白 A C 5基因[]江苏 J.大学学报：医学版，0 7 1 ( )3 8—3 9 2

0,7 4:5 5

的片段，且特异性条带和目的片段大小一致；而表

明在对中国地鼠线粒体 C X、 O 2 N D 5 O 1C X、 A H、NA H D 6基因进行扩增时， D—C T P R法显著优于常

作者简介：宋国华，,93—0 女 17 2生，读博士，在副教授 .[收稿日期： 20 0 8—0—2] 5 1

规 P R法。本实验中 4对引物的 T值分别为 4 C m 8

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