《生物技术概论》备课笔记

第一章 导论

课前4句话

第一句——听课好，成绩就好

第二句————入门好，专业就好

现代生物技术导论 基因工程 细胞工程 发酵工程 酶工程 生物技术与农业 生物技术与食品工业 生物技术与医药产业 第三句——专业好，岗位就好 《生物发酵技术》、《发酵食品生产技术》、《生物分离与纯化技术》、《酶制剂生产及应用》、《生物工程设备》、《生物工程实验技术》、《食品检测技术》等7门课程。

第四句——专业好，岗位就好——选择好，一切都好 Bill Gates：“超过我的下一个首富必定出自基因领域。”

“如果说二十世纪是物理学的时代，二十一世纪将是生物技术的时代！” 克雷格· 文格尔（基因组研究创始人，1996年诺贝尔奖获得者）

生物技术时代——选择生物技术专业

第一节 什么是生物技术？

当今六大高新技术？新能源、新材料、信息、海洋、空间、生物技术 一、定 义

利用生物体来制造产品的技术

对生物有机体在分子、细胞或个体水平上通过一定的技术手段进行设计操作，以改良物种质量和生命大分子特性或生产特殊用途的生命大分子物质为目标的技术体系。 二、内 容

基因工程（核心） 细胞工程（基础） 发酵工程（手段） 酶工程（条件） 上游工程：工程菌（细胞）获得； 中游工程： 发酵工程；

下游工程： 分离、纯化、精制。 三、生物技术产业特征

高技术、高投入、高利润、高风险、长周期

1997-2011年研发一个生物药品最低37亿美元Amgen,最高阿斯利康118亿美元，历时8.-15年

罗氏-78亿美元。

第二节 生物技术发展简史

一、传统生物技术——酿造技术 （1）用发酵池、发酵釭等。

（2）讲究的是养，能保证质量，缺少产量

旧有的制造酱、醋、酒、面包、奶酪、酸奶及其他食品的传统工艺 我国也在石期时代后期，开始用谷物酿酒，最早的发酵技术

公元前6000年，古埃及人和古巴比仑人就知道用微生物发酵产生酒精，并开始酿造啤酒 公元前4000年，古埃及人就开始用酵母菌发酵生产面包； 公元前221年，周代后期我国人民就能制作豆腐、酱油和醋； 二、近代生物技术——发酵技术 （1）大型发酵罐

（2）讲究的是催。最佳环境中培育。能保证产量。

1676年，荷兰人Leeuwenhoek制成了能放大170～300倍的显微镜，并首先观察到了微生物。 1838～1839年间德国生物学家施莱登和施旺提出细胞学说（细胞是所有动植物的结构和功能单位）

19世纪60年代，法国科学家L.Pasteur首先证实发酵是由微生物引起的，并首先建立了微生物的纯种培养技术，从而为发酵技术的发展提供了理论基础。 1897年，法国布赫纳（Buchner）：任何生物都有引起发酵的物质：酶

20世纪20年代，工业生产中开始采用大规模的纯种培养技术发酵化工原料丙酮、丁醇。 1928年，弗莱明（A. Fleming）发现青霉素，1941年青霉素投入生产。 三、现代生物技术——基因工程技术 以70年代DNA重组技术的建立为标志

1953年沃森（Waston）和克里克（Crick）发现了DNA的双螺旋结构，奠定了现代分子生物学研究基础。

DNA：二条反向平行的脱氧核苷酸长链盘旋成双螺旋结构。 RNA：一条核苷酸链。

（1）脱氧核苷酸=磷酸+脱氧核糖+碱基（A或T或G或C），

脱氧核糖+碱基（A或T或G或C或）=脱氧核苷

（2）核苷酸=磷酸+核糖+碱基（A或U或G或C），

核糖+碱基（A或U或G或C）=核苷。 问题：DNA、染色体、基因的关系？ ①DNA与染色体的关系：

1条染色体=DNA(螺旋折叠后)分子+蛋白质

②DNA与基因的关系：

基因是有遗传效应的DNA片段。每个DNA上有许多基因。

能够编码一段功能性的RNA的DNA片段，是与一个多肽链的合成相对应的一段DNA 1、对比DNA和RNA的化学成分，RNA特有的是（B ） A、核糖和胸腺嘧啶 B、核糖和尿嘧啶

C、脱氧核糖和尿嘧啶 D、脱氧核糖和胸腺嘧啶

2、由 碱基A、G、C、T所组成的核苷酸的种类最多有 （ D ） A、1种 B、3种 C、5种 D、7种

3、组成人体内核酸的碱基、五碳糖、核苷酸各有 （ A ） A、5、2、8 B、4、2、2 C、5、2、2 D、4、4、8 4、正确的是（ ADCB ）

A、染色体由DNA和蛋白质组成 B、RNA与DNA都是核酸

C、mRNA可以翻译合成蛋白质 D、一个DNA分子上有许多基因

1961年破译了遗传密码，揭开DNA编码的遗传信息是如何传递给蛋白质这一秘密

1972年首先实现了DNA体外重组技术，标志着生物技术的核心技术——基因工程技术的开

第三节 生物技术的应用

一、改善农业生产、解决食品短缺

培育抗逆的作物优良品系 植物种苗的工厂化生产 提高粮食品质

生物固氮，减少化肥使用量 二、发展畜牧业生产

动物的大量快速无性繁殖

1997年2月英国Roslin研究所培育出一只小羊--“多莉” 培育动物的优良品系

三、提高生命质量，延长人类寿命

开发制造奇特而又贵重的新型药品 疾病的预防和诊断 基因治疗

人类基因组计划（HGP） 四、 解决能源危机

主要能源：石油和煤炭

以乙醇最有希望成为新的替代能源。 将农业或工业的废弃物变成沼气或氢 五、制造工业原料

氨基酸类：主要的有谷氨酸（即味精）、赖氨酸等； 酸味剂：主要有柠檬酸、苹果酸等

甜味剂：主要有天冬甜精（甜味是砂糖的2400倍）、氯化砂糖（甜味是砂糖的600倍）。 化学工业原料：如乙醇、丙酮、丁醇等产品。 六、生产贵重金属

废渣矿、贫矿、尾矿、废矿

利用细菌的浸矿技术进行提炼 可提取的金属包括：

金、银、铜、铀、锰、钥、锌、钻、镍、钡、铭等１０多种贵重金属和稀有金属 1. 属于生物技术产业特征有（ ）

A、高利润 ；B、高风险 ；B高势能； D、高效率 2. 生物技术的核心为（ ）

A、基因工程 ；B、细胞工程 ；B、酶工程 ； D、发酵工程 3. 生物技术包括的基本内容为（ ）

A、细胞工程 B、基因工程 C、遗传工程 D、酶工程

4. 实现DNA体外重组技术，标志着基因工程技术的开始的年份为（ ） A、1973 B、1970 C、1968 D、1972 作业

1.与其它产业相比，生物技术产业有哪些特征？ 2.基因是如何指导蛋白质合成的？

3.生物技术发展历经三个过程及其技术特征是什么？ 4.基因、DNA、染色体的关系如何？

5.生物技术及应用专业有哪7门核心课程？

第二章 基因工程

第一节?概述

一、基因及基因工程的概念 （一）基因

1.孟德尔时期（1866-1910）

Mendel ：1866年豌豆杂交试验中，将控制性状的遗传因素称为遗传因子。（1909年丹麦W,L.Johanssen用“gene”代替“遗传因子”） 2. 细胞遗传学时期（1910-1940）

摩尔根Morgan:果蝇试验中提出了连锁遗传规律创建了“基因论”：是染色体上呈直线排列的念珠状结构（摩尔根 ( Thomas Hunt Morgan，美国生物学家，被誉为“现代遗传学之父”，获1933年诺贝尔生理学和医学奖。） 3. 生化遗传学时期（1940-1953）

?比德尔Beadle:红色面包霉试验（1941）提出基因是通过酶起作用的 ； ?Avery:肺炎链球菌试验（1944）提出DNA是主要的遗传物质

?Hershey & Chase:大肠杆菌试验(1952)证明了DNA的遗传传递作用

比德尔与塔特姆(E.L.Tatum)由于提出“一个基因一个酶假说”而被公认为生化遗传学的创始人。获1958年诺贝尔生理学和医学奖。 艾弗里在20世纪30年代、40年代、50年代，多次因抗原、DNA的研究获诺贝尔奖提名。

赫尔希和蔡斯在1952年通过大肠杆菌试验DNA是遗传基因的载体。 4. 分子遗传学时期（1953-）

Watson （美国）& Crick(英国):X射线衍射分析研究（1953）提出了DNA双螺旋结构模型;

基因是与一个多肽链的合成相对应的一段DNA（500-1500bp） （二）基因工程

狭义...是指一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（供体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。

广义... 外源基因重组、克隆和表达的设计与构建（上游技术，即狭义的基因工程）+含有重组外源基因的工程菌或细胞的大规模培养以及外源基因表达产物的分离纯化工程。 二、基因工程操作的基本过程 目的基因的分离与改造 载体构建

目的基因插入载体（重组体制备、载体构建） 基因载体导入受体细胞（构建工程菌（或细胞）） 目的基因的鉴定与表达

含目的基因的工程菌大规模培养（工程菌发酵） 目的基因表达产物的分离纯化

第二节?工具酶与基因表达载体 DNA重组技术的基本工具： 准确切割DNA的工具（“分子手术刀”）——限制性内切酶； DNA片段的连接工具（“分子缝合针”）——DNA连接酶、DNA聚合酶 基因转移工具（“分子运输车”）——基因进入受体细胞的载体。 一、限制性内切酶

限制性核酸内切酶：能识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（一般4-8bp），并切段每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键的核酸水解酶。（注：存在于原核及真核生物，在原核生物中表达丰富，可以限制外来DNA的侵入并使其失去活性，但不影响自身DNA。）

切割处：磷酸二酯键断开，产生具有3′－OH基团和5′－P基团的片段。 （一）内切酶的命名 EcoR I

E来自微生物的属名Escherichia埃希氏杆菌属 CO来自微生物的种名coli(大肠杆菌) R来自的微生物的菌株系 I该菌株发现的限制酶的编号

问题1 从Escherichia coli(大肠杆菌）R株发现并分离的第5种限制性内切酶的名称？EcoR Ⅴ 问题2从淀粉化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens）H株发现并分离的的第1种限制性内切酶的名称？BamHⅠ

（二）限制性内切酶分类

根据酶的功能、大小和反应条件及切割DNA的特点，分为Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、 Ⅲ型酶三类.Ⅱ型——特异性切割，同一位点

（三）限制性内切酶切割方式

黏性末端：被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对。

平末端：当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的。 （四）限制性内切酶识别序列

绝大多数Ⅱ型限制性内切酶都能识别 4-8 个核苷酸组成的特定的核苷酸序列，最常见的为 6 个碱基。

二、DNA连接酶

培养基—————高温高压（120℃，21min）、微孔滤膜灭菌 玻璃器皿、用具---与培养基一起灭菌，部分用具酒精火焰灭菌。 接种室、超净台---紫外灯20min

培养室---————保持洁净；减少进出

实验人员————手酒精消毒，穿工作服。

第二节?植物细胞工程

一、理论基础

植物细胞全能性（totipotency）是指植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，都具备发育成完整植株的遗传能力。 在适宜条件下，任何一个细胞都可以发育成一个新个体。它是植物组织培养的理论基础。

问题1 植物体上的细胞全能性大小是否有区别？ 答：受精卵>生殖细胞（卵）>体细胞 体细胞已经分化为组织和器官。 二、植物细胞工程的基本技术手段 （一）植物组织培养

看录像回答问题（5.30min开始） 问题1 什么是脱分化和再分化？

1）已分化（或成熟）的组织又恢复到无分化的初始状态。

2）处于脱分化状态的愈伤组织进行培养，诱导其形成新的植物体的过程。 问题2 已分化的细胞如何培养成植物器官或植物体？ 1.配制培养基

MS培养基、LS和RM培养基、N6（氮6）培养基等等。 2.外植体选择与处理

外植体：能被诱发产生无性增殖系的器官或组织切段 。 器官来源------一般以幼嫩的组织或器官为宜。

切块大小----组织块要达到2万个细胞（即5～10mg）以上

外植体→自来水多次漂洗→消毒剂处理→无菌水反复冲洗→无菌滤纸吸干。 3.诱导去分化阶段

较高浓度的生长素和少量的细胞分裂素。

愈伤组织---原指植物受创伤伤口附近产生的薄壁组织，泛指经细胞与组织培养产生的可传代的未分化细胞团。 4.继代增殖阶段

5、生根成芽（再分化）阶段 6、移栽成活阶段

（二）植物细胞培养和次生代谢物的生产

以离体的植物单细胞或细胞团为外植体，在无菌条件下通过诱发细胞分裂形成细胞团，再分化形成具有芽、根的完整植株。

1.悬浮细胞培养----细胞生长旺盛、次生物质积累少

①原代培养：从形成愈伤组织的培养瓶中，挑取质地松弛、生长旺盛的愈伤组织2g放入盛有30m1液体培养基的三角瓶，用镊子轻轻捏碎,置于25℃黑暗或弱光下震荡摇床固定培养

②继代培养(多次)：18～25d后，将培养物摇匀，静置片刻，用吸管吸取培养基中部的培养物（细胞团小，可清除较大细胞团块和接种物残渣），加入另一无菌三角瓶中，然后添加新鲜培养基。

③悬浮细胞同步化：分级过筛分离和不连续密度梯度离心，便于进行体细胞胚胎发生及其生理生化机制的研究。

2.固定化细胞培养----细胞生长缓慢，次生物质含量较高。

将细胞包埋在褐藻酸钙（惰性支持物）的内部或贴附在它的表面。前提是通过悬浮培养获得足够数量的细胞。

（三）植物体细胞杂交（细胞融合技术） 看录像回答问题

1.什么是细胞融合和细胞杂交？

1）两个或多个细胞相互接触合并、染色体等遗传物质重组的过程。

2）来自不同植物体细胞融合成一个杂种细胞，且把杂种细胞培育成新的植物体的方法。 2. 细胞融合包括哪些步骤？

⑴步骤①是去掉 ，使植物细胞成为 ，最常用的方法是 。 ⑵步骤②一般常用的化学试剂是 ， 目的是 。

⑶在利用杂种细胞培育成为杂种植株的过程中，运用的 技术手段是 ，其中步骤④相当于 ， 步骤⑤相当于 。

1.什么是细胞融合？简述植物细胞融合过程？ 2.植物组织培养包括哪几个步骤？

3.什么是悬浮细胞培养和固定化细胞培养？各有何优缺点？

4.自然界中有一种含有叶绿体的原生动物──眼虫，说明植物的细胞器同样可以在某些动物细胞中存活，请探讨：动物细胞与植物细胞之间可以实现杂交吗？如果理论上可行，请设计出具体实验方案。

第四章 发酵工程

第一节 概述 一、发酵工程的定义

在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术。 从广义上讲，由三部分组成：

上游工程、中游工程（发酵）、下游工程

优良菌株的选育、发酵条件的确定、培养基等营养物质的准备。 发酵过程控制

发酵液的预处理、固液分离、纯化、干燥处理（真空干燥和冰冻干燥） 二、发酵工业必须具备的条件 ?某种适宜的微生物

?发酵条件（培养基组成、温度、溶氧浓度、PH等） ?发酵设备

?分离纯化方法及设备 三、发酵工程的内容

?微生物菌体发酵（如药用真菌） ?微生物酶发酵（酶的生产） ?微生物代谢产物发酵（氨基酸等） ?微生物转化发酵（乙醇转化为乙酸） ?生物工程细胞发酵（工程菌、杂交细胞发酵） 四、发酵工程的应用

第二节 生物反应器及发酵系统 一、概述

（一）定义：是人们对生物有机体进行有控制的培养以生产某种产品或进行特定反应的容器。包括：传统发酵罐、酶反应器等、固定化酶和细胞反应器、动植物细胞培养反应器。 (二)分类

1、根据细胞或组织的代谢要求等划分

（1）厌氧生物反应器（2）好氧生物反应器（3）光照生物反应器（4）膜生物反应器 2、根据容积划分

实验室、中试、生产规模发酵罐 二、微生物细胞反应器——发酵罐

按能量（使液体循环）的输入方式分：机械搅拌式（机械搅拌）、气升式（气体喷射）、自吸式（利用泵对液体的喷射作用）。 1.机械搅拌型发酵罐（通用型发酵罐）

1.机械搅拌通风发酵罐（通用型发酵罐）

优点：PH和温度易控制、溶氧好。缺点：搅拌功率消耗大，结构复杂不易清洗。 2. 自吸发酵罐

有机械搅拌、喷射自吸发酵罐两类 3.气升式发酵罐 (二)厌氧发酵罐

思考（1）是否需要供氧？（2）是否需要搅拌装置和空气压缩机吗？（3）如何保证上层氧气排除？

答：不需供氧；无；尽量装满，排除上层氧气 三、固体发酵设备

四、动植物细胞培育反应器

有搅拌式、气升式、中空纤维（杂交瘤细胞）、膜生物反应器、填充床生物反应器等等。 1、动物细胞悬浮培养反应器 2、动物细胞贴壁培养反应器 3、动物细胞微载体悬浮培养反应器 (二)植物细胞培养生物反应器 (三)微藻培养光合生物反应器 （1）地球上预计有多少种？ （2）富含哪些成分？ （3）产油率如何？

（4）如何达到最大生产力？

（5）荷兰设计了几种光合生物反应器进行蓝藻培养试验？

（1）何为微藻——含有叶绿素A并能进行光合作用的微生物的总称，80多万种，截止2012年已知2万余种，D=5μm。

（2）成分： 含有蛋白质、脂类、藻多糖、β-胡萝卜素、多种无机元素。 （3）产油效率如何？

在一年生长期内，1ha大豆能产446L，而微藻能产生物质燃油95000L。 （4）有大量培养或生产的微藻有哪些？ 分属4个藻门：蓝、绿、金、红藻门。 （5）达到最大生产力需要的条件？ ---初期足够的光进行光合作用，接下来营造 恶劣的环境（为了自保产生油脂和营养素） 第三节 发酵工程工艺 一、菌种选育与种子扩大培养

(一)菌种选育

从自然界直接分离；人工诱变筛选获得突变株 ；经基因工程、细胞工程改造成的工程细胞或工程菌。

(二)种子扩大培养（种子制备）

（1）将沙土孢子或冷冻孢子接种到斜面培养基中活化培养； （2）移种到扁瓶固体培养基或摇瓶液体培养基中扩大培养； （3）种子罐扩大培养； （4）种子进罐培养（发酵）。 二、培养基制备 (一)种类

1、按营养物质来源 天然、合成培养基 2、按状态 液体、半固体、固体培养基 3、按用途（从发酵生产应用考虑） 孢子、种子、发酵培养基 (二)发酵培养基组成

碳源：葡萄糖、糖蜜、淀粉和糊精；

氮源：有机氮源——花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟等。

无机氮源——氨水、硫酸铵、氯化铵、硝酸盐等； （混合使用—早期利用无机氮，中期酶系形成可用有机氮） 无机盐：镁、硫、磷、铁、钾、钙、钠、氯、锌、钴、锰等； 生长因子 前体物 三、灭菌

问题1 在发酵生产中，为什么要进行灭菌操作？ 答：（1）杂菌消耗培养物质。

（2）杂菌及产物导致产物分离提取困难。 （3）杂菌繁殖会改变反应介质的PH值； （4）杂菌可能会分解产物；

（5）发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解 问题2.消毒与灭菌的区别？

消毒：杀死物体表面及内部一部分对人体有害的病原菌的营养体，而对被消毒的物体基本无害的措施，如对皮肤、水果等

灭菌 ：杀死任何物体内外的一切微生物的方法，灭菌后的物体不再有可存活的微生物。 问题3 灭菌 方法有哪些？

(一)培养基灭菌

1.间歇灭菌（分批灭菌、实消）

----将配制好的培养基同时放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程，通常也称为实罐灭菌（常用）。

2.连续灭菌（连消）：将配制好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、 保温和冷却而进行灭菌。

1）配料预热罐——预热到60-70℃，避免温差过大产生水汽撞击声； （2）连消塔————使料液的温度很快升高到126-132℃；

（3）维持罐————在灭菌温度下保持5-7min（连消时间短，灭菌不彻底）； （4）冷却管————采用冷水喷淋冷却，冷却到40-50℃。 (二)发酵用空气过滤除菌 四、发酵

(一)发酵操作方式 1.分批发酵

一次投料，一次接种，一次收获 间歇培养 2、 补料分批发酵

在分批培养过程中，向反应器内加入培养基的一种或多种成分，以达到延长生产期和控制培养过程的目的。

优点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度。可解除底物抑制，尽可能地延长产物的形成时间。 3、 连续发酵

以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养基，同时以相同的速度流出培养液。 二)发酵工艺控制

影响酶活性，改变菌体代谢方向 最适生长温度/最适产物合成温度

在发酵罐上安装夹套和蛇管，通过循环冷却水控制。 2. pH值

问题1 为什么要进行PH控制？ 答：（1）影响酶活性，

（2） 影响细胞膜的通透性（营养物吸收和代谢产物分泌）。 （3）影响代谢产物的合成方向

问题2 选择PH值的原则是什么？ 答：有利于菌体生长和产物的合成

（考虑不同菌种、生长期和产物合成期不同阶段。），

一般根据试验确定，如霉菌和酵母菌PH3-6 细菌和放线菌6.3-7.6。 问题3 如何控制ph值？ （1）采用合适的培养基配比 C（酸性）：N（碱性）合适， 生理酸、碱性物质比例合适； 添加缓冲物质：碳酸钙和磷酸盐 （2）发酵过程中补加酸或碱 补加氨水、硫酸铵 （3）调节补糖速度控制pH 3.溶氧(DO)浓度

发酵初期采用小通风，停搅拌，可降低能耗，而且在工艺上也是必须的(较大的通风和搅拌而产生过大的剪切力，对菌体的生长有时会产生不利的影响). 五、发酵产物的获得

(一)发酵液的特性和产物的分类 1）成分复杂： 2）产品浓度低： 3）失活问题：

4）分批发酵各批次成分存在差异 菌体细胞、酶、代谢产物

(二)下游加工的一般流程与单元操作 1. 粗分离阶段

1）发酵液的预处理和固-液分离 2）产物的初分离(提取 2.纯化精制阶段

3）产物的高度纯化（精制 （4）成品加工

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