基于纳米金标记适配体识别的伏马菌素B1检测新方法

基于纳米金标记一适配体识别的

伏马菌素Ｂ１检测新方法

王文凤，昊世嘉，马小媛，夏雨，王周平４

（食品科学与技术国家重点实验室，江南大学食品学院，江苏无锡２１４１２２）

摘要：基于核酸适配体识别和纳米金变色效应构建了伏马菌素Ｂ１（ＦＢｌ）的可视化检测新方法。

实验以纳米金为载体．首先在纳米金表面组装巯基化的适配体互补短链ＤＮＡｌ腰Ｂ１一适配体复合

物：当加入目标物时。适配体链与目标物结合，与互补短链ＤＮＡｌ发生解离；此时再加入纳米金

标记的与适配体互补短链１互补的短链ＤＮＡ２，二者杂交可导致纳米金粒子的聚集而使溶液颜

色发生变化．进而实现目标物的可视化检测。通过条件优化，有效避免了由于盐浓度过高使纳米

金发生聚集所产生的误差。同时在纳米金与短链ＤＮＡ孵化时加入表面活性荆十二烷基硫酸钠

（ＳＤＳ），使ＮａＣｌ浓度达到了５００ｍｍｏ儿而纳米金颜色仍不发生改变，打破了以往熟化ＮａＣｌ浓

度１００ｍｍ０１／Ｉ．就使纳米金颜色发生变化的界限。使附着在纳米金上的ＤＮＡ量扩大了３倍。方法

检测线性范围为１２５～１５００ｎｇ／Ｌ，检测限为１２５ｎｇ，Ｌ。该方法已成功应用于啤酒中ＦＢｌ的检测。

关键词：适配体识别；纳米金变色；可视化

中图分类号：髑２０１．６；，Ｉｓ２０７．５文献标志码：Ａ文章编号：１６７３—１６８９（２０１３）０５—０５０ｌ—０８

ＮｏｖｅｌＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＦｕｍｏｎｉｓｉｎｓＢ１ＤｅｔｅｃｔｉｏｎＢａｓｅｄｏｎＡｕＮＰｓＬａｂｅｌｉｎｇ

ａｎｄＡｐｔａｍｅｒＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ

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Ｗｕｘｉ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｉｓｗｏｒｋｓｅｔｕｐａｎｅｗｎａｋｅｄｅｙｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｆｂｒＦＢｌａｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｈｉｇｈ

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收稿日期：２０１２一０５一１１

基金项目：国家“十二五”科技支撑计划项目（２叭２ＢＡＫ０８８０１）；江苏省科技支撑计划项目（ＢＥ２０１１６２１）。

￥通信作者：王周平（１９７４一），男，陕西宝鸡人，教授，博士研究生导师，主要从事营养与食品卫生研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｗａｎｇｚｐ卿ｉａ“ｇｎａｎ．ｅｄｕ．ｃ“骥鹱戮黼鞠赣黧鞠黼隧麟黼麓霞鳝鞭雾熬鹈鬻雾翳魏鬻鬻露鹱鬟｜｜｜麟鎏鬻霪蠹溅溱麓羹辍瀚蓬粪戮瓣隧囊戮食品与生物技术学报２０１３年第３２卷第５期Ｏ

ＵｅｔｅＣｔＩＯｎｂａｓｅａＯｎＡｕＮＰｓＬａｂｅｌｌｎｇ

ａｎｄＡｐｔａｍｅｒＲｅｃｏｇｎ川ｏｎ

ｔｈｅｃｏｌｏｒｏｆＡｕＮＰｓａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｄｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＮａＣｌｔｏ５００ｍｍｏｌ／ＬａｎｄＤＮＡｌｏａｄｉｎｇｅｎｌａｒｇｅ３ｔｉｍｅｓ．Ｔｈｉｓｂｒｅａｋｓｔｈｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｂｏｕｎｄａｒｙｏｆ１００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌｃａｎｃａｕｓｅｄｔｈｅｃｏｌｏｒ

ｃｈａｎｇｅｏｆＡｕＮＰｓ．Ｔｈｅｌｉｎｅａｒｒａｎｇｅｏｆｔｈｅｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ印ｔａｓｅｎｓｏｒｃｏｖｅｒｓａｌａｒｇｅｖａｒｉａｔｉｏｎｏｆＦＢ１ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｆ而ｍ１２５ｎ∥Ｌｔｏ１５００ｎ∥Ｌａｎｄｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｏｆ１２５ｎ∥Ｌｉｓｏｂｔａｉｎｅｄ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｐｔａｍｅｒｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，ＡｕＮＰｓｃｏｌｏｒｃｈａｎｇｅｓ，ｎａｋｅｄｅｙｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

伏马菌素Ｆｕｍｏｎｉｓｉｎｓ是由南非的Ｇｅｌｄｅｒｂｌｏｍ等于１９８８年首次发现【ｌ】，它主要包括串珠镰刀菌风矾ｕｍ啪凡ｉＺｉ南ｒ胱产生的一组结构相关的６种水溶性真菌毒素（ＦＢｌ、ＦＢ２、ＦＢ３、ＦＢ４、ＦＡｌ、ＦＡ：）如图１所示【２】。其中ＦＢ是天然污染玉米样品或真菌培养物中伏马素的主要组成成分。伏马素的结构与神经鞘氨醇十分相近。因而能特异性地干扰神经鞘氨醇的生物合成。伏马菌素的毒性存在种属特异性和靶器官特异性，现有资料表明，ＦＢ能引起马脑白质软化症（ＥＬＥＭ）、猪肺水肿（ＰＰＥ）、大鼠原发性肝癌，对家禽的免疫系统有免疫抑制作用，此外，ＦＢ还被怀疑是人食道癌的致病因子［３】。ＦＢ中的ＦＢ。，相对分子质量７２１．是污染玉米或串珠镰刀菌培养物中伏马菌素的主要组分，也是导致伏马菌素毒性作用的主要原因。世界卫生组织联合专家委员会规定了其临时的每天摄入量最大值［４１。欧盟在９８／５３／ＥＣ指令中规定人类直接食用的花生中ＡＦｓ（Ｂ１＋Ｂ２＋Ｇ１＋Ｇ２）应／Ｊ、于４“ｇ／ｋｇ同。

ＣＯＣ｝ＬＣＨＣＨ．ＣＯＯＨ

ＣＯＯＨ

ＦＡ．Ｒ１Ｒ，Ｒ３

ＦＡ．０ＨＯＨＣＨ，ＣＯ

ＦＢ．ＨＯＨＣＨ，ＣＯ

ＦＢ．ＯＨ０ＨＨ

ＦＢ．ＨＯＨＨ

ＦＢ．ＯＨＨＨ

ＨＨＨ

图１伏马菌素的化学结构

Ｆｉｇ．１ＳｔｒｕｃｔｕｒｅＣｈａｒｔｏｆ

Ｆ啪ｏＩｌｉｓｉ璐

ＦＢ，高温不能使其失去活性，鉴于ＦＢ。的剧毒性和广泛的流行性，以及它所带来的危害，建立一定的ＦＢｌ检测方法尤为必要。目前已经建立起的检测方法包括薄层层析法ＴＬＣ、气谱质谱联用法ＧＣ／ＭＳ、高效液相色谱法ＨＰＬＣ、毛细管电泳法、酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ），日本Ｋｉｋｋｏｍａｎ公司用ＫＬＨ和ＯＶＡ作为ＦＢ，的载体蛋白，制备了抗ＦＢｌ的单克隆抗体ｍＡｂ．建立了以ｍＡｂ为基础的ＥＬＩＳＡ检测方法，并制成试剂盒同，但价格昂贵。这些方法虽具较高的灵敏度和特异性，但成本较高而且需要精密的仪器和专门的从业人员，需要稳定的抗体来源，耗时耗力。

因此．有必要发展一种低成本．不使用复杂仪器，方便快捷而又灵敏的检测方法。比色法因易于观察而成为受欢迎的技术。由于纳米金粒子的高触灭系数、光特性的距离依赖性，近来在ＤＮＡ相关的比色分析中常被用作比色的介质同。纳米金的聚集最早是由Ｍｉｒｋｉｎ等发现【８】，他们报道了一种新的利用纳米金光学特性的距离依赖性来检测多核苷酸。这为纳米金的应用开辟了一个新的途径。

ＡＤｔａｍｅｒ是通过ＳＥＬＥＸ技术从随机寡核苷酸库中筛选得到的单链寡核苷酸［９】。在某种理化条件下，Ａｐｔａｍｅｒ可以折叠形成发夹，颈环等结构与目标物质特异性结合。相对于传统的抗原抗体等技术，Ａｐｔａｍｅｒ具有更高的选择行、特异性、亲和性陋１１】，而且能够区分结构及其相似的物质【１２。１ａ如ＦＢ。、ＦＢ：等，因此受到一些专家学者的极大关注。ＦＢ。的Ａｐｔａｍｅｒ是由ＭａｕｒｅｅｎＭｃＫｅａｇｕｅ等在２０１０年筛选得到的【Ⅷ。这为ＦＢ，的高灵敏度检测提供了一种有效的工具。

本实验中用纳米金作为介质，ＦＢ。一ａｐｔａｍｅｒ作为识别元素来检测ＦＢ，。以前报道纳米金的聚集大都是由盐诱导引起的，作者采用ＤＮＡ杂交互补的方式来达到聚集的目的，当ＦＢ广即ｔａｍｅｒ与目标物质ＦＢ，特异性结合后，两条互补的ＤＮＡ就会杂交，导致纳米金的聚集，实现快速可视化的检测。

１．１试剂

短连ＤＮＡｌ序歹Ⅱ５’ＳＨ一３’ＡＡＴＴＧＡＡＴＡＡＧＣＴＧＧＴＡ：短连ＤＮＡ２序列５’一３’ＳＨＴＡＣ

＿＿—麓翳寓—＿ＩＩ●ｌ鳃司多Ｊｏ哪ａｌｏｆＦｏｏｄｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶ０１．３２Ｎｏ．５

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王文凤，等：基于纳米金标记一适配体识别的伏马菌素ＢＩ检测新方法

ＣＡＧＣ，Ｉ’Ｉ’ＡＴＴＣＡＡｒｒｒ；伏马菌素适配体序列５’一ＡＴＡＣＣＡＧＣＴＴＡＴＴＣＡＡＴＴ—ＡＡＴＣＧＣＡＴＴＡＣＣＴ１１ＡＴＡＣＣＡＧＣＴＴＡＴＴＣＡＡＴｒＡＣＧＴＣＴＧＣＡＣＡＴＡＣＣＡＧＣＴＴＡＴＴＣＡＡＴＴ—ＡＧＡＴＡＧＴＡＡＧＴＧＣＡＡＴＣＴ一３。上述ＤＮＡ都在“上海生工”合成，用含有质量分数１％ＳＤＳ的１０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＰＢ（ｐＨ７．４）溶液来稀释。ＤＮＡ浓度通过紫外在波长２６０ｎｍ处的吸收值来获得。伏马菌素购买于ｓｉｇｍａ公司，氯金酸（ＨＡｕＣｌ４）购买于上海久岳化工有限责任公司，柠檬酸钠购买于中国医药上海化学试剂公司，其它试剂均为分析纯。

１．２仪器

ＵＶ—Ｖｉｓ（一ＮＩＲ）ＵＶＰｒｏｂｅ２．３３版分光光度计，日本岛津公司产品；ＪＥＭ一２１００ＨＲ透射电镜（ＴＥＭ），日本ＪＥＯＬ公司产品；ＤＦ一１０１Ｓ型集热式磁力加热搅拌器，河南巩义市予华仪器厂产品；Ｃｅｎｔｄｆｕｇｅ５８０４Ｒ台式高速冷冻离心机器，上海安亭科学仪器厂产品；Ｂｉｏｒａｄ电泳仪，美国Ｂｉｏ—ｒａｄ伯乐公司产品；Ｂｉｏｒａｄ凝胶成像仪，美国Ｂｉｏ—ｒａｄ伯乐公司产品；ＭＯＳ一４５０ＡＦ—ＣＤ圆二色光谱仪，Ｆｍｎｃｅ．Ｂｉｏ—Ｌｏｇｉｃ公司产品。

１．３纳米金的制备

采用对Ｇｒａｂａｒ等㈣的方法略加改进来制备纳米金溶液，在三口圆底烧瓶中加入９５．８ｍＬ超纯水，再加入４．２ｍＬ质量分数１％氯金酸溶液，磁力、回流加热搅拌，持续煮沸ｌＯｍｉｎ，然后迅速加入１０ｍＬ质量分数１％柠檬酸三钠溶液，煮沸１０ｍｉｎ。最后将热源除去，继续搅拌１５ｍｉｎ，将圆底烧瓶取下，冷却至室温，得到的棕红色液体，即为纳米金。主要通过紫外、可见吸收图谱、透射电子显微镜对其进行了表征。

１．４ＦＢｌ的检测

取１０００斗Ｌ的纳米金于２．５ｍＬ的离心管中（事先用缓冲液清洗干净，避免使纳米金颜色发生改变），１２０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，取上清５００¨Ｌ，然后分别取短连ＤＮＡ１、ＤＮＡ２各１５斗Ｌ每管中，３７℃摇床孵化１２ｈ，然后逐步加人ＮａＣｌ（１ｍｏ儿），加之前进行超声，每次增加５０ｍｍｏ此，直至ＤＮＡｌ中的ＮａＣｌ浓度达到５００ｍｍｏｌ／Ｌ，ＤＮＡ２中的ＮａＣｌ浓度达到３００ｍｍｏ帆，再孵化过夜。离心去上清液，再用１×ＰＣＲ扩增缓冲液进行溶解。得到短链修饰的纳米金。取ＤＮＡ１修饰的纳米金５００斗Ｌ，加入ＦＢ。适配体并保证其过量进行杂交，得到适配体修饰的纳米

金，然后加入不同浓度的ＦＢ。，孵化３０ｍｉｎ，离心去上清液再加入ＤＮＡ２链修饰的纳米金。ＰＣＲ仪９５℃５ｍｉｎ后关闭电源，让其自然降温，观察颜色变化并在４００。８００ｎｍ进行ＵＶ—ｖｉｓ扫描。

１．５啤酒中ＦＢｌ的加标回收

按照２．３ＦＢ，的检测中的方法制备适配体修饰的纳米金和短链ＤＮＡ２修饰的纳米金，在购买来的啤酒中加人ＦＢ。，使ＦＢ。的质量浓度分别为１９０、４５０、６００、８００、１２５０ｎｇ／Ｌ，过膜脱气后采用甲醇一水提取法，加人体积分数７５％的甲醇水溶液．振荡提取３０ｍｉｎ，静置后取上清分装，一２０℃保存待测。再按照上述方法进行孵化杂交。最后在ＵＶ—ｖｉｓ分光光度计上测波长为５２０ｎｍ和６３０ｎｍ处的吸收值。

２．１ＦＢｌ检测的原理

纳米金本身在柠檬酸钠的缓冲溶液中．由于斥力大于万德华力，相对稳定而呈现红色。当在纳米金的表面连接上ＤＮＡｌ链和ＦＢ厂ａｐｔａｍｅｒ之后（见图２），加人目标物质ＦＢ。，这时ＦＢ广印ｔａｍｅｒ就会优先与目标物质ＦＢ。结合，ＤＮＡｌ链暴露出来，再加入与ＤＮＡｌ链互补的ＤＮＡ２链，通过杂交互补的方式使纳米金的距离靠近。由于纳米金的颜色具有光距离依赖特性，距离拉近就会引起纳米金颜色的变化，加入的目标物质浓度不同，纳米金聚集的程度不同，导致纳米金呈现不同颜色的变化，从而实现可视化的检测。

ＤＮＡｌ

ＡｕＮＰｓ

ＤＮＡ２

ＦＢ

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Ｆ：Ｂ．ａｐｔａｍｅｒ

ＦＢ，ａｐｔａｎｌｅｒ复合物图２用纳米金和ＦＢ广ａｐｔａｍｅｒ检测ＦＢｌ的原理

ｌ瞄ｇ．２ＳｃｈｅｍａｔｉｃｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎＦＢＩｕｓｉｎｇ

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ＡｐｔａｍｅｒＲｅｃＯｇｎｉｔｉＯｎ

２．２

ＮａＣｌ浓度的优化及杂交条件的选择

纳米金与ＤＮＡ的连接主要是在ＤＮＡ上修饰

ＳＨ．通过Ｓ—Ａｕ键将ＤＮＡ修饰在纳米金的表面陋ｒ丌，而纳米金上ＤＮＡ的附着量和孵化时ＮａＣｌ的浓度相关，以往研究中采用的大都是１００

ｍｍｏ儿的

ＮａＣｌ浓度．冰箱４℃，４８ｈ以上的孵化条件［１８。１９１。但

当采用这个方法加入ＮａＣｌ为１００ｍｍｏｌ，Ｌ时，纳米金的颜色就发生了变化。本实验成功的一个前提就是在最后一步ＤＮＡ２链与ＤＮＡｌ链杂交之前的任何一步都应保持纳米金的颜色不发生改变，为此作者对实验条件进行了探索。见表１、表２和图３。

表１

ＤＮＡｌ链即５７端与纳米金孵化条件的选择

Ｔａｂｌｅ１

ｌｎｃｕｂａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｃｈｏｉｃｅｏｆＤＮＡｌ（５’ｅｎｄ）ｃｈａｉｎａｎｄＡｕＮＰｓ

１００２００

３００

４００

５００６００

０＿３９０８Ｏ．３９０８

０－３９０８

０．３９０８Ｏ．３９０８

Ｏ－３９０８

３７３７３７

３７

３７３７

０．２９１４Ｏ．２７５２Ｏ．２１２８０．１８４５０．１４３２０．１２０７

Ｏ．０９９４０．１１５

６Ｏ．１７８Ｏ＿２０６３０．２４７６

Ｏ．２７０

ｌ

０．３１２１０．２８５３Ｏ．２３１

４

Ｏ．２００９０．１８９５０．１６４６

表２

ＤＮＡ２链即３’端与纳米金孵化条件的选择

Ｔａｂｌｅ２

Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ

ｃｈｏｉｃｅｏｆＤＮＡ２（３７ｅｎｄ）ｃｈａｉｎａｎｄＡｕＮＰｓ

０．０７８７

Ｏ．１０５５

０．１５９４

Ｏ．１８９９

Ｏ．２０１３０．２２６２

１００

２００

３００４００

５０００＿３７２９Ｏ．３７２９Ｏ．３７２９

Ｏ＿３７２９

Ｏ．３７２９３７

３７３７

３７

３７０．３２０３０．２８１４Ｏ．２４０６０．２１０７０．１８０９

４００５０（）

７００８（）０

０．０５２６Ｏ．０９ｌ５０．１３２３

０．１６２２

０．１９２

４

４

４４４

０．３４１５０＿３２０４Ｏ．３０５７

０．２７４６

０．２３３８

Ｏ．０３ｌ４Ｏ．０５２５０．０６７２０．０９８３０．１３９１

ｎｍ

ＤＮＡｌ链

图３

不同ＮａＣｌ浓度条件下ＤＮＡｌ、ＤＮＡ２链与纳米金孵化后的扫描光谱和颜色比较

Ｆｉｇ．３

ＵＶ—ｖｉｓａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒａａｎｄｃｈａｒｔｏｆＡｕＮＰｓｌｉｎｋｅｄＤＮＡｌ

ｏｒ

ＤＮＡ２ａｔＤｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆＮａＣｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ

＠

Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ

Ｆｏｏｄｓｃｉｅｎｃｅａｎｄ

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

Ｖ（）１．３２

Ｎ１）５２０１３

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●

＿ｌ团置瑟圜王文凤，等：基于纳米金标记一适配体识别的伏马菌素Ｂ．检测新方法

图３中的１００～６００ｍｍｏｌ／Ｌ代表的是ＮａＣｌ浓度。其中ａ图是ＤＮＡ２链（左上角是没有加入ＳＤＳ，ＮａＣｌ浓度为１００ｍｍｏｌ／Ｌ时的纳米金颜色，其余都为加了ＳＤＳ纳米金的颜色）’ｂ图是ＤＮＡｌ链。

从表１和表２可以推算出，无论是ＤＮＡｌ还是ＤＮＡ２链。无论是３７℃还是４℃，附着在纳米金表面的有效ＤＮＡ量都是随着ＮａＣｌ浓度的增加而增大的．３７℃的孵化要好于４℃的孵化。从表１和表２还可以算出，ＮａＣｌ为１００ｍｍｏ儿时，ＤＮＡｌ链的孵化率只有２０．３％。ＤＮＡ２链的孵化率只有１４．１％。为了保持纳米金的颜色在连上ＤＮＡ之后不发生变化，提高ＤＮＡ在纳米金表面的附着量，本实验中加入了表面活性剂ＳＤＳ，从图３（ｂ）可以看出当加入ＳＤＳ后．ＤＮＡｌ链的ＮａＣｌ浓度可以达到５００ｍｍｏｌ，Ｌ时颜色仍不发生改变，而当加到６００ｍｍｏｌ／Ｌ时，颜色开始变紫，４００—８００ｎｍ的紫外扫描光谱也显示了ＮａＣｌ浓度为５００ｍｍ０１／Ｌ时，峰的位置没有发生红移，而当ＮａＣｌ浓度为６００ｍｍｏｌ／Ｌ时，峰宽几乎没有变化，但却发生了红移。同样，如图３（ａ）所示，当ＤＮＡ２链的ＮａＣｌ浓度达到３００ｍｍｏｌ／时Ｌ，纳米金颜色不发生改变。峰位也没有出现红移：而当ＮａＣｌ浓度达到４００ｍｍｏ此时，颜色开始变化．峰位也发生了红移；ＮａＣｌ浓度为５００ｍｍ０１／Ｌ时，峰位红移得更多，而且峰开始变宽。所以作者最后选择了ＤＮＡｌ链熟化的ＮａＣｌ浓度为５００ｍｍｏ帆，此时的孵化率为６３．３％，是之前的３倍。ＤＮＡ２链的ＮａＣｌ浓度为３００ｍｍｏｌ／Ｌ，此时的孵化率为３０．６％。本实验中加入ＳＤＳ的主要作用一是增加纳米金的稳定性，降低其对管壁的吸附性；二是缩短了实验时间．以前的孵化一般都要在４８ｈ以上，本实验只需１０多个小时；三是在维持纳米金颜色不变的同时增加了ＮａＣｌ的浓度，进而增加了纳米金表面ＤＮＡ的附着量，这对于以纳米金和ＤＮＡ链为基础的其他实验都是至关重要的环节。因为ＤＮＡ附着量的增加可以大大地提高实验的灵敏度。

得到ＤＮＡｌ链和ＤＮＡ２链修饰的纳米金之后，选择了４种常见的缓冲液分别作３７℃２ｈ和９５℃５ｍｉｎ然后让其自然降温的方式对杂交条件进行了筛选。从图４可以看出，９５℃５ｍｉｎ然后让其自然降温的方式得到的扫描图更稳定，１×ＰＣＲ扩增缓冲液纳米金颜色开始变紫，峰位红移得多而且峰也变得较宽，这对实验极其有利，因此最后选择的杂交温度为９５℃，杂交缓冲液为ｌ×ＰＣＲ扩增缓冲液

ｍｎ

（ｂ）９５℃

注：①０．００１ｍｏｌ，ＬＥＤＴＡ，０．０５ｍｏｌ几ＮａＣｌ，０．０２ｍｏｌ，ＬＴｒｉｓ—Ｈｃｌ；②超纯水；③２０ｍｍｏｌ／ＬＮａｃｌ＋１０ｍｍ０１／ＬＰＢ；④１×ＰＣＲ扩增缓冲液

图４４种缓冲液杂交光谱及颜色比较

Ｆｉｇ．４ＵＶ—Ｖｉｓａｂｓｏｒｐ舶ｎｓｐｅｃｔｒａａｎｄｃｈａｒｔｏｆＡ心聃ａｆｔｅｒＤＮＡｌａｎｄＤＮＡ２ｈｙｂｎＩｌｚａｔｉ蚰ａｔ珊侬ｒｅｎｔ

ｅｘｐｅ—ｍｅｎｔａＩｃｏｎｍＵｏｎｓｏｆｔｅｍｐｅｒａｔＩＩｒｅａｎｄｂ１１］瞪ｂｒ

２．３ＦＢ。的定量检测

保持连有适配体的纳米金在加入ＤＮＡ２链后颜色不发生改变是本实验成功的另一个关键因素，如图５（ａ），因此在ＤＮＡｌ链与Ａｐｔａｍｅｒ杂交时，要使Ａｐｔａｍｅｒ的量足够的大，直至加入ＤＮＡ２链颜色不发生变化为止，然后再进行后续的实验。而当加入与目标物质结构相似的物质ＦＢ２时，纳米金的颜色也几乎没有发生变化，这充分证明了适配体的高特异性，能够区分结构相似的物质。图５（ｂ）显示的是ＤＮＡｌ、ＤＮＡ２以及ＤＮＡｌ连接上Ａｐｔａｍｅｒ后的电泳图，ＤＮＡｌ链连接上ＦＢｌ一ａｐｔａｍｅｒ之后，相对分子质量变大，同样条件下跑得较慢．这也证明了作者

在纳米金表面成功连接上了ＦＢ广ａｐｔａｍｅｒ。

ｕｅＩｅｃｌｌｏｎｂａｓｅａＯｎＡｕＮＰｓＬ．ａＤｅ¨ｎｇａｎｄＡｐｔａｍｅｒＲｅｃＯａｎｉｔｉＯｎ

（ｃ）线性关系

图５纳米金连接上ＤＮＡｌ、ＤＮＡ２及ＤＮＡｌ连接上Ａｐｔａｍｅｒ后的电泳图以及加入不同浓度的ＦＢｌ与

６３０，５２０比值之间的线性关系

Ｆｉｇ．５ＥｌｅｃｔｒＯｐｈｏｒＯｇｒ帅ｏｆＡｕＮＰｓｌｉｎｋｅｄＤＮＡｌｏｒＤＮＡ２ｏｒＤＮＡｌ一ａｐｔ砌ｅｒａｎｄＣａＵｂｒａｔｉｏｎｃｕｒＶｅ

ｏｆｔｈｅｒａｔｉｏｏｆ６３０，５２０ａｎｄｄｉ脏ｒｅｎｔＦＢｌ

ｃｏｎｃｅｎｔｒａ廿ｏｎｓ

当加入不同质量浓度的目标物质ＦＢｌ时，Ａｐｔａｍｅｒ优先与目标物质结合，暴露的ＤＮＡｌ链就会与ＤＮＡ２链杂交互补，使纳米金颗粒发生聚集，如图６所示，ＦＢ，质量浓度逐渐增大，纳米金聚集程度也越大．导致了纳米金颜色由红色到紫色再到蓝色的逐渐变化。从图６紫外扫描光谱上也可以看出，当纳米金上连接了ＤＮＡ链之后，它的峰位发生微弱的红移．但峰宽仍保持不变，而且纳米金的颜色也没有发生改变。当加入的目标物质质量浓度逐渐增大之后，它的峰红移越来越多，而且峰变得很宽．５２０ｎｍ处纳米金的特征峰值逐渐减小，而接近６３０ｎｍ处的吸收值逐渐增大，６３０／５２０的比值也规律性地变化。以加入的目标物质质量浓度为横坐标，６３０／５２０的比值为纵坐标，在目标物质质量浓度１２５～１５００ｎｇ／Ｌ范围内其线性回归方程为’，＝０．０００８戈＋Ｏ．３１３１，Ｒ２＝０．９９９３，线性关系良好（图５（ｃ）），对加入目标物质质量浓度１２５、２５０、５００、７５０、１０００、ｌ２５０、１５００ｎｇ／Ｌ重复３次，测得其在５２０ｎｍ和６３０ｎｍ处的吸收值，６３０／５２０的相对标准偏差（ＲＳＤ）分别为２．５３％、２．４６％、２．５３％、２．５２％、３．１０％、２．７２％、２．５３％，重复性较好，检测限为１２５ｎ∥Ｌ。透射电镜也显示了纳米金逐渐聚集的过程，见图７。但当目标物质质量浓度进一步增大即大于１５００ｎｇ／Ｌ，峰位红移得更多而且峰值减小，６３０／５２０的比值不再在这个线性范围之内。ＣＤ图是检测ＤＮＡ二、三级结构的有效工具．本实验中对加入不同质量浓度的目标物质之后的混合物进行了ＣＤ１９０～３５０ｎｍ的扫描，结果如图８所示，波长在２７０ｎｍ附近，峰值随着ＦＢ。质量浓度的增加而加大，证明Ａｐｔａｍｅｒ形成了发卡、颈环等结构并与目标物质发生了特异性结合。

ｎｎ

ａ：ＡｕＮＰｓ：ｂ：ＡｕＮＰＫ＋ＤＮＡ２：ｃ：ＡｕＮＰＨ＋ＤＮＡｌ：

ｄ：ＡｕＮＰｓ＋ＤＮＡｌ＋ＦＢｌ一ａｐｔ锄ｅｒ；

ｌ：１２５ｎｇ／Ｌ；２：２５０ｎｇ／Ｌ；３：５００ｎｇ，Ｌ：４：７５０ｎｇ，Ｌ

５：１０００ｎｇ／Ｌ；６：１２５０ｎｇ，Ｌ：７：１５００ｎｇ，Ｌ

图６不同ＦＢ。浓度条件下的扫描光谱及纳米金颜色比较Ｆｉｇ．６ＵＶ—ｖｉｓａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒａａｎｄｃｈａｒｔｏｆＡｕＮＰｓａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔＦＢｌｃＯｎｃｅｎｔｍｔｉｏ璐

啊离曩舅霸＿＿＿＿ｌ嘲ｑ参ＪｏｕｍａｌｏｆＦｏｏｄｓｄｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶ０１．３２Ｎｏ．５２０】３

（ａ）纳米金＋ａ１１ｆａｍｅｒ

王文凤，等：基于纳米金标记一适配体识别的伏马菌素Ｂ．检测新方法

ｌＪＦＢ。质量浓度５００ｎｇ，ｎ１

时纳米金的聚集

㈩ＦＩ｛啦量浓Ｊ生ｌ㈤（）『ｌｚ／ｎＩｌ

时纳水惫的聚％

图７纳米金的ＴＥＭ电镜图

Ｆｉｇ．７

ＴＥＭｉｍａｇｅｏｆＡｕＮＰｓ

另外，本实验中还发现稀释ＤＮＡ粉末时ＰＢ要

好于ＴＨｓ＿ｂｕｆｆｅｒ，这可能是因为ＤＮＡ的骨架是电负

性的，而Ｔｒｉｓ中含有氨基带正电，二者之问存在的

静电作用占有了ＤＮＡ在纳米金表面的大部分有效

空间，从而降低了ＤＮＡ的附着量。超声也可以增加

ＤＮＡ的附着量，可能是因为超声打破了纳米金表面

ＤＮＡ分子间的相互作用，创造了更多的剩余空间，

导致了ＤＮＡ附着量的增加。而纳米金粒径增大也

会增加ＤＮＡ的附着量。

４?５

３．Ｏ

莒要１．５誊△蚕。

一１．５斌。瓞三；警

Ｗ一…一

ｕ’出—怍，ｎ。

图８不同浓度下的ＣＤ图

Ｆｉｇ．８ＣＤｓｐｅｃｔｒａｏｆｄｉ胤ｒｅｎｔｃｏ耻ｅｎｔｍｔｉｏ璐ｏｆＦＢｌ

２．４啤酒中伏马菌素ＦＢ，的加标回收

因谷物和水果受到伏马菌素的污染．以它们为

原料生产的啤酒、黄酒等发酵酒及以感染了黑曲霉

的葡萄等水果为原料制成的果汁、果（葡萄）酒中都

极易含有对人体有害的伏马菌素，但目前对于伏马

菌素的限量标准都集中在消费量较大的玉米谷物

及制品，对于酒类产品中伏马菌素的限量及检测方

法报道很少。很多研究者都在致力于酒中伏马菌素

的脱毒研究，因此将作者新建立的方法应用于啤酒

（以大麦为主要原料，玉米、小麦等为辅助原料发酵

而成）中伏马菌素ＦＢｌ的检测，其加标回收率见表

３，重复测定３次，在１９０、４５０、６００、８００、１２５０ｎｇ／Ｌ

的ＲＳＤ值分别为６．３８、８．７０、１０．６７、６．３８、６．３８。

表３啤酒中伏马菌素邝．的加标回收率

—霍峦■■蟹蕊田■团田

１９０１８１．０９５．３

４５０

６００

８００

１２５０

４３８．１

５６２．２

７３２．８

Ｉ１８６２

９７．４

９３．７

９１．６

９４．８

本实验巾以纳米金为介质，以适配体为识别７已

素，实现了对ＦＢｌ的可视化检测。当加人ＳＤＳ时。

ＤＮＡ链与纳米金的孵化过程中，ＮａＣｌ浓度可以达

到５００ｍｍｏｌ／Ｌ而纳米金仍不变色，打破了以前报道

中只加入１００ｍｍｏｌ／Ｌ的界限㈣。进而增加了ＤＮＡ

的附着量，提高了实验的灵敏度。当加入不同质量

浓度的ＦＢｌ时，纳米金颜色发生改变，６３０／５２０的值

也发生规律性变化，进而实现定量检测的目的．最

低检测限为１２５ｎｇ，Ｌ。ＣＤ光谱显示了Ａｐｔａｍｅｒ与目

标物质特异结合后发卡、颈环、Ｇ一四聚体等结构的

存在。在啤酒中的加标回收率良好。这种简单快速

低成本的可视化检测方法越来越受到科学工作者

的重视，它将为分析检测提供一种全新的而且可行

的途径。

＿—●●———■—●—■■＿—————●—＿●＿—■＿＿——●＿■——嚣—＿重——＿黼食品与生物技术学报２０１３年第３２卷第５期

Ｏ—＿———■＿

ＷＡＮＧＷｅｎ—ｆｅｎｇ，ｅｌａｌ：ＮｏｖｅＩＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＦｕｍｏｎｉｓｉｎｓＢ１

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２０１３瓣缓蘩熬纛翳糯囊黎瀚壤黧黼鬟黎黼黧鬃黼蘩黎髑震黎瀚缀缀懑§黼ｏＪｏｕｍｌｏｆＦｏｏｄｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｔｅｃｌｌＩｌｏｌｏｇｙＶ０１．３２Ｎ０．５

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