生物化学实验

生物化学实验讲义

实验一 蛋白质的颜色反应与沉淀反应

蛋白质分子中的某种或某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应。不同蛋白质所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦可不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同的颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物质是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白物质的定量测定的依据。

多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后，即产生沉淀。

实验材料与仪器

鸡（或鸭）蛋白

吸管0.5 ml（×1）、1ml（×3）、2 ml（×2）、5ml（×2） 滴管

试管1.5×15cm（×10） 水浴锅 电炉

吸滤瓶500ml（1） 布氏漏斗

试剂

1. 卵清蛋白液：将鸡（或鸭）蛋白用蒸馏水稀释20～40倍，2～3层纱布过滤，滤液冷藏备用。 2. 1%苯酚溶液：苯酚1ml，加蒸馏水稀释至100ml。

3. 1%白明胶液：1g白明胶溶于少量热水，完全溶解后稀释至100ml。

4. 米伦（Millon）试剂：40g汞溶于60ml浓硝酸（比重1.42），水浴加温助溶，溶解后加二倍体积蒸馏水，混匀，静置澄清，取上清液备用。此试剂可长期保存。

5. 0.5%茚三酮溶液：0.5g茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100ml。 6. 尿素：如颗粒较粗，最好研成细粉末状。

7. 10%NaOH溶液：10gNaOH溶于蒸馏水，稀释至100ml。 8. 浓硝酸：比重1.42

9. 1%硫酸铜溶液：硫酸铜1g溶于蒸馏水，稀释至100ml。 10. 硫酸铵晶体：如颗粒太大，最好研碎。

11. 饱和硫酸铵溶液：蒸馏水100ml，加硫酸铵至饱和。 12. 95%乙醇 13. 结晶氯化钠

14. 2～3%醋酸铅（或AgNO3）：2～3g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml。 15. 5%鞣酸溶液：5g鞣酸溶于蒸馏水并稀释至100ml 16. 饱和苦味酸溶液

17. 1%醋酸溶液：冰醋酸1ml用蒸馏水稀释至100ml。

主要内容

（一）米伦氏反应

1. 用苯酚实验：取1%苯酚溶液1ml于试管中，加米伦氏剂约0.5ml，小心加热溶液即出现玫瑰红色。

2. 用蛋白溶液实验：取2ml蛋白溶液，加入0.5ml米伦试剂，此时出现蛋白质的沉淀。小心加热，凝固之蛋白质出现红色。

3. 用白明胶（也是一种蛋白）做上述实验，结果如何？ （二）双缩尿反应

1. 取少许结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素熔化并形成双缩尿，释出之氨可用红色石蕊试纸检测。至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却。然后加10%NaOH溶液1ml摇匀，再

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加2滴1%CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。

2. 另取一只试管，加蛋白液10滴，再加10%NaOH溶液10滴及1%CuSO4溶液2滴，混匀，是否出现紫玫瑰色。

注意硫酸铜不能多加，否则产生深蓝色的干扰络离子。 （三）黄色反应

于一试管内，置蛋白溶液10滴及浓硝酸3～4滴，加热，冷却后再加入10%NaOH溶液5滴，观察颜色变化。 （四）茚三酮反应

取1ml蛋白溶液置于试管中，加2滴茚三酮试剂，加热至沸，即有蓝紫色出现。注意此反应必须在pH5～7进行。 （五）蛋白质盐析作用

1.取蛋白质溶液5ml于试管，再加入等量饱和硫酸铵溶液（此时硫酸铵的浓度为50%饱和），微微摇动试管，使溶液混合后静置数分钟，球蛋白即析出（如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵）。

2. 将上述混合溶液过滤，滤液中加入硫酸铵粉末，至不再溶解，析出的为清蛋白，再加水稀释，观察沉淀是否溶解。 （六）酒精沉淀蛋白质

取蛋白质溶液1ml，加晶体NaCl少许（加速沉淀并使沉淀完全），待溶解后再加入95%乙醇2ml混匀，观察有无沉淀析出。 （七）重金属沉淀蛋白质

取试管2支各加入蛋白质溶液2ml，一管内滴加2～3%醋酸铅（或AgNO3），另一管内滴加1%硫酸铜溶液至有沉淀析出。 （八）生物碱沉淀蛋白质

取试管2支各加入2ml蛋白质溶液及1%醋酸溶液4～5滴，向一管中加5%鞣酸溶液数滴，另一管中加入饱和苦味酸溶液数滴，观察结果。

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实验二 双缩尿法测定蛋白质浓度

具有两个或者两个以上肽键的化合物皆有双缩尿反应。由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，故可用双缩脲法测定蛋白质的含量（借助分光光度计可减小误差）。

仪器

容量瓶10ml（×6）

试管1.5×15cm（×8） 吸管5ml（×3）、 2ml（×1） 721分光光度计

试剂

1. 双缩尿试剂：将0.1750gCuSO4·5H2O溶于约15ml蒸馏水，置于100ml容量瓶，加入30ml浓氨水、30ml冰冷的蒸馏水和20ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置1～2小时，再加蒸馏水至刻度，摇匀备用。

2. 卵清蛋白（或酪蛋白）液：约1g卵清蛋白（或酪蛋白）溶于100ml0.9%NaCl溶液，离心，取上液，用凯氏定氮法测定其蛋白含量，根据测定结果，用0.9%NaCl溶液稀释卵清蛋白溶液，使其蛋白含量为2mg/ml。 3. 未知液：可用酪蛋白配置。

主要内容

1. 标准曲线的绘制：将6只10ml容量瓶编号，按下表加入试剂，即得6种不同浓度的蛋白质溶液

编号 1 2 3 4 5 6 2mg/ml乱清蛋白液 （ml） 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 蒸馏水 稀释至刻度 稀释至刻度 稀释至刻度 稀释至刻度 稀释至刻度 稀释至刻度 蛋白浓度 （mg/ml） 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 取干净试管7支，按0、1、2、3、4、5、6编号，1～6号分别加入上述不同浓度的蛋白溶液3.0ml。0号为对照管，加入3.0ml蒸馏水。各管加入双缩尿试剂2.0ml，充分混匀，即有紫色出现，用540nm光测定各管吸光度，绘制浓度-吸光度曲线。

2. 样品测定：取未知浓度的蛋白质3.0nl置试管内，加入双缩尿试剂2.0ml，混匀，测定540nm的吸光度，对照标准曲线求得未知液蛋白质浓度。

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实验三 酵母核糖核酸（RNA）的分离及组份鉴定

酵母核酸中RNA的含量较多，DNA少于2%。RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙 醇使其沉淀，由此即可得到粗RNA制品。用碱液提取的RNA有不同程度的降解。

RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组份。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组份的存在。

实验材料与仪器

干酵母粉（市售） 鲜酵母 PH试纸 天平

烧杯100ml（×1） 量筒50 ml（×1）、10 ml（×1） 抽滤瓶500 ml（×1）、布氏漏斗Φ10cm（×1） 吸管0.5ml（×1）、1ml（×2）、2ml（×2）、5ml（×1） 离心机5000r/min

试剂

1. 0.2%氢氧化钠溶液：2gNaOH溶于蒸馏水并稀释至1000ml。 2. 乙酸（AR） 3. 95%乙醇

4. 无水乙醚（CP） 5. 氨水（CP）

6. 10%硫酸溶液：浓硫酸（比重1.84）10ml，缓缓倒入水中，稀释至100ml。 7. 5%硝酸银溶液：5gAgNO3溶于蒸馏水并稀释至100ml，贮于棕色瓶中。 8. 苔黑酚-三氯化铁试剂

主要内容

1.RNA的提取：置4g干酵母粉于100ml烧杯中，加入0.2%NaOH溶液20ml，沸水浴加热30分钟，经常搅拌。加入乙酸数滴，使提取液呈酸性（试纸检测），离心10~15分钟（4000r/min）。取上清液，加入95%乙醇30ml，边加边搅。加完静置，待完全沉淀，过滤。滤渣先用95%乙醇洗2次（每次约10ml），再用无水乙醚洗2次（每次10ml），洗涤时可用细玻棒小心搅动沉淀。乙醚滤干后，滤渣即为粗RNA，可做鉴定。

2. RNA组份鉴定：取上述RNA约0.5g，加10%硫酸溶液5ml，加热至沸1~2分钟，将RNA水解。

1．嘌呤碱：取水解液2ml加入浓氨水2ml，然后加入约1ml 5%硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱 的银化合物沉淀。

2．核糖：取一支试管加入水解液1ml、三氯化铁浓盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液0.2ml。放 沸水浴中10分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。

3．磷酸：取一支试管，加水解液1ml和定磷试剂1ml。在水浴中加热，观察溶液是否变成兰色，说明磷酸是否存在。

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实验四 糖的化学性质

淀粉和蔗糖缺乏自由醛基（苷羟基）无还原性。但在酸的作用下，淀粉和蔗糖很容易水解成为糊精及少量麦芽糖、葡萄糖，使之具有还原性。淀粉溶液遇碘呈蓝色。

实验材料与仪器

试管1.5×15cm（×8） 滴管

大烧杯500ml（×1） 小烧杯100ml（×1） 酒精灯 广泛pH试纸

试剂

1. Benedict试剂 2. 2%葡萄糖 3. 2%蔗糖 4. 2%麦芽糖 5. 1%淀粉溶液 6. 20%NaOH溶液 7. 0.1%碘液 8. 浓盐酸

9. 2%硫酸溶液

主要内容

1、糖的还原性（与Benedict试剂反应）

取4支试管，各加1mlBenedict试剂，混合均匀后，分别加4滴2%葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及1%淀粉溶液，摇动均匀，将各试管同时放入沸水浴中加热2~3分钟，然后取出放在试管架上冷却，注意观察试管中溶液颜色变化，是否有红色沉淀生成。 2、蔗糖水解

取2支试管，编号后，分别加1ml2%蔗糖和1~2ml蒸馏水，向甲管中加3~5滴2%硫酸溶液，乙管中加3~5滴蒸馏水，混合均匀，然后将两支试管同时放入沸水浴中加热10~15分钟，取出两支试管放在试管架上冷却，甲管用10%NaOH溶液中和至中性。再向甲乙管中各加1mlBenedict试剂，摇动均匀，将两支试管同时放入沸水浴中加热2~3分钟，观察甲、乙两管中颜色的变化，说明什么问题。

3、淀粉与碘的作用

取一支试管加10滴1%淀粉溶液和1滴0.1%碘液，溶液立即出现蓝色，将试管放入沸水浴中加热5~10分钟，观察有何现象发生，然后取出试管，放置冷却，又有何变化。 4、淀粉的水解

取1个小烧杯加10ml1%淀粉溶液和8滴浓盐酸，沸水浴中加热，每隔2~5分钟取出1小滴淀粉水解液在白瓷板上，滴1 滴0.1%碘液，注意观察其颜色的变化，直到无蓝色出现为止。冷却后，向小烧杯中逐滴加入20%NaOH溶液至弱碱性为止，此时，取出1ml淀粉水解液于1支试管中，1支试管加1ml 1%淀粉溶液，在此2支试管中分别加入Benedict试剂，摇动均匀后，将2支试管同时放入水浴中加热2~5分钟，观察颜色变化，说明什么？

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实验五 过氧化氢酶和过氧化物酶的定性反应

过氧化氢酶（E）能催化过氧化氢分解，产生水及分子氧。作用机理如下：

2H2O2 → O2 + 2H2O

过氧化物酶能催化过氧化氢释放出新生氧以氧化某些酚类和胺类物质。 催化从底物移去电子，并转给过氧化氢反应，即：

供体+2H2O2→氧化的供体+2H2O

实验材料与仪器

生马铃薯或血液 新鲜猪肝糜

试管1.5×15cm（×4 吸管5ml（×1）、2ml（×4） 天平 水浴锅 剪刀 白菜梗 棉花或纱布 胶头滴管 研钵

漏斗Φ8cm（×1）

试剂

1. 2%过氧化氢溶液

2. 1%焦性没食子酸水溶液：焦性没食子酸1g，溶于100ml蒸馏水。

3. 白菜梗提取液：白菜梗约5g切成细块，置研钵内，加蒸馏水约15ml，研磨成浆，经棉花或 纱布过滤，滤液备用。

主要内容

1.过氧化氢酶实验：

取试管4支，按下表加入试剂： 管号 1 2 3 4 2%H2O2 （ml） 3 3 3 3 新鲜猪肝糜 （g） 0.5 － － － 煮熟肝糜 （g） － 0.5 － － 生马铃薯 （g） － － 1 － 熟马铃薯 （g） － － － 1 加完，观察有无气泡产生，特别注意肝糜周围和马铃薯周围。 2.过氧化物酶实验：

取试管4支，按下表编号加入试剂：

管号 1 2 3 4 1%焦性没食子酸 2ml 2ml 2ml 2ml 2%H2O2 2滴 － 2滴 2滴 蒸馏水 2ml － － － 白菜梗提取液 － 2ml 2ml － 煮沸的白菜梗提取液 － － － 2ml 摇匀后，观察并记录各管颜色变化和沉淀情况。

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实验六 维生素C的定量测定（2,6-二氯酚靛酚滴定法）

还原型维生素c（抗坏血酸）能还原染料2，6—二氯酚靛酚（Dichlorophenolindo pheno1一DCPIP)．本身则氧化为脱氢型。在酸性溶液中，2，6—二氯酚靛酚呈红色，还原后变为无色。因此．当用此染料滴定含有维生素C的酸性溶液时，维生素C尚未全部被氧化前，则滴下的染料立即被还原成无色。一旦溶液中的维生素C已全部被氧化时，则滴下的染料立即使溶液变成粉红色。所以，当溶液从无色转变成微红色时即表示溶液中的维生索C刚刚全部被氧化，此时即为滴定终点。如无其他杂质干扰．样品提取液所还原的标准染料量与样品中所含的还原型抗坏血酸量成正比。

实验材料与仪器

松针、新鲜蔬菜（辣椒、青菜、西红柿等）、新鲜水果（桔子、柑子、橙、柚等）。 吸管1.0ml（×1）、10ml（×1） 容量瓶100ml（×1） 锥形瓶100ml（×3） 微量滴定管2ml（×1） 天平 研钵

漏斗Ф8cm（×2）

试剂

1. 2％草酸溶液：草酸2g，溶于100ml蒸馏水。 2. 1％草酸溶液：溶1g草酸于100ml蒸馏水 3. 标准抗坏血酸（维生素c）：标准称取50.0mg纯抗坏血酸，溶于1％草酸溶液，并稀释至500ml，贮棕色瓶，冷藏，最好用时配。

4. 1％HCl溶液

5. 0.1％2，6－二氯酚靛酚溶液：溶500.0mg2，6－二氯酚靛酚于300ml含有104mgNaHCO3

得热水中，冷却后加水稀释至500ml，滤去不溶物，贮棕色瓶内，冷藏（4℃约可保存一周）。每次使用时，以标准抗坏血酸溶液标定。

主要内容

1、 提取

水洗干净整株新鲜蔬菜或整个新鲜水果．用纱布或吸水纸吸干表面水分。然后称取20.0g加入积2％草酸100ml至于组织搅碎机中打成浆状。称取浆状物5.0g，倒入50ml容量瓶中以2％草酸溶液稀释至刻度。静置10分钟，过滤（最初数ml滤液弃除）滤液备用。 2、 滴定

⑴标准液滴定

准确吸取标准抗坏血酸溶液1.0 mL (含0.1mg抗坏血酸)置100 mL维形瓶中，加9 mL 1％草酸，用

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微量滴定管以0.1％2，6—二氯酚靛酚滴定至谈红色，并保持15s不褪色，即达终点。由所用染料的体积计算出1mL染料相当于多少毫克抗坏血酸(取10 mL l％草酸作空白对照，按以上方法滴定)。 ⑵样品滴定

准确吸取滤液两份，每份10.0mL分别放人2个100 mL锥形瓶内，滴定方法同前。另取10 mL l％草酸作空白对照滴定。 ⑶计算

计算公式：

＝ （ V A—V B）╳ S

维生素C mg数/100g样品 ╳100

W

式中：VA 为滴定样品提取液所用的2，6—二氯酚靛酚的平均mL数； VB 为滴空白对照所用的2，6-二氯酚靛酚的平均mL数。 S 为1mL 2，6—二氯酚靛酚溶液氧化维生素C的mg数。 W 为10mL样品提取液中含样品的g数。

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